Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti
September 19th, 2018
Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.
Bu yöntem biyomedikal araştırma alanında biyomarker keşfi, ilaç keşfi, teşhis ve ilaç veya antikor ların taranması gibi anahtar soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek verimli olması ve protein izoformlarını son derece tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebildiğidir. Etkilenen proteinleri veya izoformlarını ölçebildiği için bu tekniğin etkileri birçok hastalığın tanısına kadar uzanır.
Bu yöntem hücre sinyalyolları hakkında bilgi sağlasa da, spesifik proteinlerin analiz edilmesi gereken diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. İlk olarak, bir mikrolitre DMSO inhibitörü karışımı ve iki mikrolitre proteaz inhibitörünün 47 mikrolitre numune seyrelticisine ekleyerek bir örnek seyreltici karışımı hazırlayın, böylece DMSO ve proteaz inhibitörlerinin son konsantrasyonu bir X.Dilute daha önce izole edilmiş protein lisatları kullanarak istenilen konsantrasyonları elde etmek için.
Sonra, standart merdiven 3.325 mikrolitre ekleyin, proteaz inhibitörü altı mikrolitre, ve antholite premix 137.675 mikrolitre DMSO inhibitörü üç mikrolitre. En az 15 saniye lik numuneyi girve buzda tut. DMSO proteaz inhibitörlerinin ve izoelektrik nokta standart merdivenin son konsantrasyonlarının bir X olması ve kılcal damardaki proteinlerin istenilen son konsantrasyonlara ulaşması için hazırlanan iki çözeltiyi bir veya üç oranında karıştırın.
Proteinler örnek karışıma eklendikten sonra, tüm adımlar buzda veya dört santigrat derecede gerçekleştirilir. Buz üzerine 384 kuyuluk bir tabak yerleştirin. Otomatik Batı lekeleme sistemi yazılımı ile tasarlanan test şablonu düzenine göre, numune karışımının on mikrolitresini plakanın uygun kuyuya yükleyin.
Bunu takiben, antikor dilüent ile primer ve sekonder antikorları seyreltin. Daha sonra, pipet her kuyuya 10 mikrolitre primer antikor ve 15 mikrolitre ikincil antikor. Sonra, luminol ve peroksit XDR bir oran bir karıştırın.
Pipet 15 mikrolitre luminol peroksit her kuyuya karışır. Numuneler ve reagantlar tabağa eklendikten sonra, 2500 kez G'de on dakika santrifüj ve sıvıyı aşağı döndürmek ve kabarcıkları çıkarmak için dört santigrat derece. Kabarcıklar hala varsa, ince bir pipet ucu kullanarak el ile kaldırın.
Otomatik Western blotting sistem yazılımını açın ve dosya menüsünden new''yi tıklatın. Düzen bölmesine gidin ve 384 kuyuluk plakadaki reagant'lar ve numuneler için konumlar atayın. Bloğun herhangi bir yerindeki bir kuyuyu tıklatarak bir reagant ataması yapın.
Her biri 12 kuyudan oluşan bir satır bloğu seçin. Ardından, düzen bölmesi araç çubuğuna gidin ve bir örnek, birincil, ikincil veya luminol satır bloğu ekleyin. Protokol bölmesine gidin ve plakada bir reagant konumu seçin.
Ardından, örnek sütundaki hücreyi tıklatın ve açılır menüden reagant'ı seçin. Aynı şekilde, her döngü için birincil, ikincil ve luminol için reagant konumlarını seçin. Birincil veya ikincil antikor sütununda hücreleri teker teker tıklatın ve gerekirse kuluçka sürelerini değiştirin.
Ardından, protokol bölümündeki Ekle düğmesini tıklatarak döngüler ekleyin. Şablon bölmesine, birincil ve ikincil antikorların kimliği, katalog numaraları ve seyreltmeleri gibi örnekle ilgili bilgileri girin. Yeni bir ait sonuç dosyasını kaydedin.
Başlat düğmesini tıklatmadan önce, her şeyin doğru olduğundan emin olmak için düzeni hızlıca kontrol edin. Şimdi, çalıştırmaya başlamak için başlat'ı tıklatın. Yazılım, kullanıcıdan atıkları temizlemesini, su ve kılcal kutuyu doldurmasını, kaynak tepsisine anolit ve katolit eklemesini, yıkama tamponu eklemesini ve plakayı soğutulmuş numune tepsisine yüklemesini ister.
Çalışma başladıktan birkaç dakika sonra bilgisayar ekranında bir enstrüman durum çubuğu görüntülenir. Durum ve ayırma bölmelerini görmek için çalıştır özeti'nin ekranına tıklayın. Bir kılcal damarda elektroforez in ayrımını gözlemlemek için, istenilen döngüyü tıklayıp kontrol panelindeki oynat düğmesine tıklayarak o kılcal damar için ayırma filmini oynayın.
Çalıştır dosyasını açın ve çözümleme ekranı sekmesini seçin. Izoelektrik nokta aralığını değiştirmek için edit've ardından analiz'e tıklayın. Uygun izoelektrik nokta standardını uygulayın.
Bir tepe sığdırma ekleyin ve bir tepe adı ekleyin. Son olarak, zirveler sekmesinde kullanılacak verileri seçin ve daha fazla analiz için verileri dışa aktarın. Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates fosforilted ekstrasellüler sinyal-regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir.
Vasküler endotelyal büyüme faktörü ile gözlenen fosforitane proteinlerin çok yüksek indüksiyonu vardır. Inset endojen yükleme kontrolü gösterir, HSP 70, hem işlenmemiş ve tedavi örnekleri için örneklerin benzer yükleme gösteren. Konvansiyonel bir immünoblotta, fosforiile hücre dışı sinyal leregüle kiyaz proteinleri kapiller izoelektrik odaklama analizi ile dört tepeye ayrılmıştıne rağmen sadece iki bant saptamıştır.
Vasküler endotelyal büyüme faktörü uyarılmış lysates gelen ekstrasellüler sinyal regüle kinazelektroferogramı burada gösterilmiştir. Inset paralel olarak kullanılan aynı yükleme denetimini gösterir. Konvansiyonel bir immünoblot sadece iki bant ekstrasellüler sinyal-regüle kizaz bir ve ekstrasellüler sinyal-regüle kiaz iki karşılık gösterir.
Kapiller izoelektrik odaklama ile ise, hücre dışı sinyal-regüle kinaaz proteinleri dört farklı fosforilted zirveleri ve iki un-fosforile peaks karşılık gelen altı zirveleri olarak çözüldü. Bir kez hakim, bu teknik birkaç saat içinde yapılabilir, döngülerin sayısına bağlı olarak, düzgün yapılırsa. Bu prosedürü çalışırken, konvansiyonel immünoblots ile karşılaştırıldığında daha yüksek antikor konsantrasyonları kullanmayı unutmayın önemlidir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, kabarcıkların kaldırılması, plakanın yüklenmesi vesaire gibi hileler nedeniyle öğrenmenin zor olduğu için önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteininizin farklı izoformlarını gözlemlemek için verileri nasıl tasarlayacağınızı, numuneleri nasıl hazırlayacağınızı, testetmeyi nasıl çalıştırabileceğinizi iyi anlamalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Kılcal izoelektrik odaklama, küçük biyolojik örneklerden proteinleri ve bunların izoformlarını karakterize etmek için antikor tabanlı, ultrahassas bir tekniktir. Bu protokol, spesifik proteinlerin otomatik tespiti ve nicelendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Proteomik
- Biyomedikal Araştırma
Arka Plan
- Protein analizi için yüksek verimli teknik.
- Biyobelirteç ve ilaç keşfi için yararlıdır.
- Hastalık teşhisinde etkilenen proteinleri ölçebilir.
- Test hatalarını önlemek için dikkatli kullanım gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Protein izoform analizi için detaylı bir protokol sağlamak.
- Protein tespitinde tekrarlanabilirliği artırmak.
- Hücre sinyal yollarına dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- DMSO ve proteaz inhibitörleri ile örnek seyreltici karışımının hazırlanması.
- İzole edilen protein lizalarının seyreltilmesi.
- Otomatikleştirilmiş ve robotize edilmiş test adımları.
- Tekniğin öğrenilmesine yardımcı olan görsel gösterim.
Ana Sonuçlar
- Protein izoform tespiti için yüksek verimli yetenek.
- Numuneler arasında ölçümlerde tekrarlanabilirlik.
- Teşhis ve ilaç taramasında potansiyel uygulamalar.
- Çeşitli sistemlerde spesifik protein analizinde içgörüler.
Sonuçlar
- Kılcal izoelektrik odaklama, biyomedikal araştırmada değerli bir araçtır.
- Hastalıkların teşhisinde önemli ölçüde yardımcı olabilir.
- Tekniğin ustalaşmasında görsel yardımcılar kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Capillary isoelectric focusing (cIEF) addresses the discovery-stage challenge of detecting low-abundance protein isoforms from limited biological samples, such as tissue biopsies, with high sensitivity and reproducibility. By enabling quantitative, high-throughput analysis of protein charge variants, the method enhances predictive confidence in target validation and supports early go/no-go decisions in drug development pipelines. Its automation and minimal sample requirements reduce technical variability, improving data reliability for portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving protein isoforms based on isoelectric point, clarifying post-translational modifications relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible detection of phosphorylated and unphosphorylated protein states in cell-signaling pathways.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence by quantifying isoform-specific expression changes in response to stimuli, such as vascular endothelial growth factor, aiding in pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative electropherograms that can be analyzed for peak area and isoform ratios.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated capillary-based separation and chemiluminescent detection, minimizing manual variability.
- Scalability: Enables high-throughput screening of 96 samples per run, supporting scalable compound or antibody evaluation in drug discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by measuring affected proteins or their isoforms, such as phosphorylated ERK, linking discovery to diagnostic applications.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by providing reproducible, quantitative data on protein modification states across experimental conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by delivering sensitive, reproducible measurements in the picogram range, reducing false negatives in low-sample scenarios.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, capillary isoelectric focusing supports hypothesis testing in early discovery, enables assay readiness for screening, and provides quantitative readouts that inform lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein isoforms that conventional immunoblotting fails to detect, such as distinguishing four phosphorylated ERK peaks from two bands.
- Screening: Describes assay readiness through automation, reproducibility, and quantitative outputs, allowing reliable comparison of protein expression across treatment conditions.
- Analytics: Highlights measurements like peak area and electropherogram profiles that enable teams to quantify isoform-specific changes and compare experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling detection of disease-affected proteins and isoforms, such as HSP70 loading controls and VEGF-stimulated ERK phosphorylation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, due to its automation, standardization, and applicability across multiple targets and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through isoform-specific detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated capillary electrophoresis and chemiluminescent detection.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by detecting subtle isoform shifts early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on sensitive, quantitative protein isoform data from limited samples.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein chemistry, electrophoresis, and immunoassay optimization.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs, including automated Western blotting systems, CCD cameras, and peak analysis software.
- Cross-team standardization requirements for sample preparation, antibody titration, and bubble removal to ensure assay consistency.
- Adaptation considerations across model systems, such as adjusting antibody concentrations and isoelectric point ranges for different protein targets.
- Practical limitations include the need for careful bubble removal, precise reagent mixing, and visual training due to assay complexity, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Sample Mix Preparation (Calculation for 150 L Sample Mix)
3:03
Designing a New Assay Template with System Software
4:33
Running the Assay File
5:20
Analyze the Data
5:46
Results: Characterization of Extracellular Signal Regulated Kinase Proteins by Capillary Isoelectric Focusing
7:08
Conclusion
