Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

Gama-sekretaz için bu kantitatif hücre bazlı raportör gen testinin genel amacı, varsayılan gama-sekretaz modülatörlerinin gama-sekretaz aracılı bölünme üzerindeki diferansiyel etkisini incelemektir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığının tedavisi için yeni gama-sekretaz modülatörlerinin tanımlanması gibi Alzheimer hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, yüksek verimli bir tahlil sistemi olması ve gama-sekretaz modülatörlerini kolayca tanımlayabilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, minimal yan etkilere sahip anti-AD ilaçlarının potansiyel keşfi yoluyla Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, gama-sekretazın substrat seçiciliği hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca nöroblastom gibi diğer hastalıkların çalışmalarına da uygulanabilir.

Bu yönteme yeni başlayan kişiler, hücre kültürü ortamının dikkatli bir şekilde çıkarılması ve 96 mikroplakaya eklenmesi ile mücadele edebilir, çünkü çok fazla rahatsızlık nihai sonuçları karmaşıklaştırabilir. Bu prosedüre, metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi NG ve CG hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın. Bir hemositometre ile NG veya CG hücrelerini sayın.

Daha sonra, hücreleri, büyüme ortamında kuyu başına 200 mikrolitrelik bir nihai hacimde 96 oyuklu mikroplakalara oyuk başına 20.000 hücrede tohumlayın. Mikroplakaları nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörüne aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyonun ardından, her oyuktan 100 mikrolitre büyüme ortamını çıkarın.

% 0.2 dimetil sülfoksit, iki mikromolar CL-387, 785, iki mikromolar DAPT veya diğer ilgili ErbB1 / ErbB2 inhibitörleri ile mililitre başına iki mikrogram tetrasiklin içeren büyüme ortamı kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. Tedavi edilen hücreleri ve mikroplakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mikroplakalardan büyüme ortamının oyuğu başına 150 mikrolitre çıkarın.

Ardından, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, mikroplakaları bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında tutun. Lüminesans mikroplaka okuyucusunda saklanan önceden tanımlanmış bir programı kullanarak ateşböceği lusiferaz tarafından yayılan lüminesansı belirleyin.

İlk olarak, cihaz kontrol yazılımını açın. Ardından, Araç menüsünden Luminometri'yi seçin. Parametreler ayarı altında, emisyon filtresi için Filtre Yok'u seçin, emisyon açıklığı için Normal'i işaretleyin, sayma süresi için bir tane girin ve lüminesans okumasını ayarlamak için Tamam'a tıklayın.

Enstrüman kontrolü sekmesi altında, aktif protokoller listesinde ilerleyin ve lüminesansı okumak için önceden kaydedilmiş protokolü seçin. Canlı görüntü sekmesi altında, açılır menüden ölçeği tanımlayın ve tür için Logaritma veya Doğrusal'ı seçin. Sıcaklık sekmesi altında, plaka ısıtması için Kapalı'yı seçin.

Son olarak, lüminesans okumasını gerçekleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın. Kontrol yazılımına gömülü Explorer'ı kullanarak sonuçları bir elektronik tablo formatına aktarın. Tetrasiklin içermeyen büyüme ortamı ile muamele edilen CG veya NG hücrelerinden arka plan lüminesansını tahmin edin.

% 100 nispi gama-sekretaz aktivitesi olarak% 100 nispi gama-sekretaz aktivitesi olarak tek başına mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram içeren büyüme ortamında% 0.1 DMSO ile muamele edilen CG veya NG hücreleri tarafından yayılan bir lüminesans sinyali tanımlayın. Son olarak, tetrasiklin ve CL-387, 785 veya DAPT içeren büyüme ortamı ile kültürlenen CG veya NG hücrelerinden lusiferaz sinyallerini, DMSO ile muamele edilen CG veya NG hücreleri tarafından yayılan lusiferaz sinyaline normalleştirin. Burada, CG hücrelerinde APP-C99'un gama-sekretaz bölünmesinin kantitatif ölçümlerini gösteren temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Hücreler, 24 saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram varlığında bir mikromolar CL-387, 785 veya DAPT ile tedavi edildi. C99-GV'nin gama-sekretaz aracılı proteolizinden türetilen lüminesans, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 100 mikrolitre eklendikten sonra ölçüldü. Tek başına araçla muamele edilen hücreler tarafından yayılan lusiferaz sinyali% 100 bağıl lüminesans olarak ayarlandı.

NG hücrelerinde N-delta-E'nin gama-sekretaz bölünmesinin kantitatif ölçümlerini gösteren temsili sonuçlar burada gösterilmektedir. Benzer şekilde, hücreler 24 saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram varlığında bir mikromolar CL-387, 785 veya DAPT ile tedavi edildi. N-delta-E-GV'nin gama-sekretaz aracılı proteolizinden türetilen lüminesans, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 100 mikrolitre eklendikten sonra ölçüldü.

Tek başına araçla muamele edilen hücreler tarafından yayılan lusiferaz sinyali% 100 bağıl lüminesans olarak ayarlandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, incelenecek bileşiklerin sayısını beklerken yalnızca bir ila iki saatlik bir uygulamalı süre gerektirir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Alzheimer hastalığı alanındaki araştırmacının, Alzheimer hastalığı için yeni terapötikler arayışında gama-sekretazın genetik ve kimyasal değiştiricisini keşfetmesinin yolunu açtı.