Name: Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Öğrenin, hücre tabanlı luciferase muhabir tahlili ile γ-secretase aktivitesini nicel olarak ölçmeyi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı için yeni modülatörlerin belirlenmesine ve substrat seçiciliğinin incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar çekirdek tesis cep Enstitüsü ve Organismic biyoloji, Academia Sinica, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu Çalışma Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan (Y.-F. için en 103-2320-B-001-016-MY3 tarafından desteklenmiştir L.), Program translasyonel biyofarmasotik geliştirme-Platform eksen destekleyen teknoloji yenilik için Düzen (Y.-Tayback için NP7) ve Academia Sinica (Y.-Tayback için).

1. Luciferase gazeteci sinyalleri, γ-Secretase bölünme APP-C99 veya NΔE için karşılık gelen ölçümü
Not: Lütfen CG ve NG hücreleri20,21nesil ayrıntılı açıklamaları için önceki yayınlara bakın.
<ol><li>
Tohum hücreleri NG veya CG (20, 000 hücre/iyi) 96-şey Mikroplaka 200 μL/kuyuda Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) artı % 10 fetal sığır serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiyotik (örneğin oluşan büyüme orta bir son seste üzerine zeocin) ve 200 μg/mL hygromycin d.
	<ol>
<li>Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
		<li>Mikroplaka bir oksijen CO2 kuluçka aktarmak ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 μL büyüme ortamının her kuyudan çıkarın.</li>
	<li>100 μL/iyi büyüme eklemek orta ya % 0,2 Dimetil sülfoksit (DMSO), 2 mikron ile 2 μg/mL tetrasiklin içeren CL-387,785, 2 mikron N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) veya diğer ilgili ErbB1/ErbB2 inhibitörleri.</li>
	<li>Mikroplaka 24 h 37 ° C'de tedavi CG veya NG hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>150 μL/iyi büyüme orta Mikroplaka kaldırın.</li>
	<li>50 μL/iyi luciferase tahlil reaktif ekleyin ( Tablo reçetesibakınız).</li>
	<li>
Mikroplaka bir ışıldama Mikroplaka okuyucu aktarın.
	<ol>
<li>Mikroplaka nazik ajitasyon ile 5 min için oda sıcaklığında korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ateş böceği luciferase (FL) belirlemek-ışıldama ışıldama Mikroplaka okuyucu içinde kayıtlı bir önceden tanımlı program kullanarak yayılan.
	<ol>
<li>Araç kontrol yazılımı açın ( Tablo reçetesi enstrüman Ayrıntılar için bakınız).</li>
		<li>'Luminometry' 'Aracı' menüsünden seçin.<ol>
<li>'Parameters' Ayarlar ' ın altında emisyon filtre, kene 'Normal' için emisyon diyafram, girmek için '1' için zaman sayma 'Filtre' seçin ve yukarı ışıldama okuma ayarlamak için 'Tamam' tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>'Araç kontrol' sekmesi altında etkin iletişim kuralları listesinde gezinin ve ışıldama okumak için önceden saklı protokolü seçin.</li>
		<li>'Ekran canlı' sekmesinin altındaki aşağı açılır listesinden ölçek tanımlamak ve 'Logaritma' veya 'Lineer' türü için seçin.</li>
		<li>'Isı' sekmesinde, 'Off' tabak Isıtma için seçin.</li>
		<li>Okuma ışıldama gerçekleştirmek için 'Başlat' düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Gerektiğinde, sonuçları 'gömülü kontrol yazılımı içinde belgili tanımlık keşfe çıkmak' kullanarak elektronik tablo biçimine dışa aktarabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. miktar γ-Secretase aktivitesinin
<ol><li>
CG tarafından yayılan bir ışıma sinyal veya büyüme orta % 100 göreli γ-secretase etkinlik olarak yalnız 1 μg/mL tetrasiklin içeren % 0,1 DMSO ile tedavi hücreleri NG tanımlayın.
	<ol>
<li>Arka plan ışıldama CG veya NG hücreden tetrasiklin içermez büyüme orta hücrelerle tedavi tarafından tahmin ediyoruz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luciferase sinyalleri ile büyüme orta 1 μg/mL tetrasiklin içeren kültürlü CG veya NG hücreleri normal duruma getirmeye ve ya 1 mikron CL-387,785 veya 1 mikron luciferase sinyali ile DAPT CG DMSO tedavi veya NG tarafından yayılan hücreleri (% 100 göreli γ-secretase etkinlik, olarak 2.1 içinde tanımlanmış olan).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aducanumab immünoterapi evre 1b deneme reklam için gelen umut verici sonuçlar sıkıca Aβ kritik rolü yılında22 patogenezinde kurduk ve anti-Aβ yaklaşımlar hala Anti-reklam uyuşturucu gelişimi için uygun bir strateji olduğunu göstermektedir. Burada γ-secretase-katalize proteolizis APP-C99 ve ateş böceği luciferase muhabir sistemleri kullanarak NΔE miktarının için hücre tabanlı deneyleri tarif. APP-C99 ve NΔE iki en iyi okudu γ-secretase yüzeylerde ve birlikte γ-secretase13pat...

Amiloid-β (Aβ) oligomeric formları ateş hastalarda Alzheimer hastalığı (Ah)1' den beynindeki başlıca nedeni olduğuna inanılmaktadır. Aβ peptitler β-secretase ve γ-secretase2tarafından ilk amiloid precursor protein (APP), kademeli bir bölünme tarafından üretilmektedir. Son on yılda, reklam tedavisinde doğru tedavi yaklaşımları Aβ üretim3önlenmesi üzerinde odaklanmıştır. Çalışmalar çoğunluğu γ-secretase bölünme app engel ve böylece Aβ üretimi veya β-ve/veya γ-secretase faaliyetleri4inhibisyonu azaltır α-secretase etkinlik, her iki büyütme üzerinde odaklanmıştır. Ne yazık ki, non-selektif kaçınılmaz yan etkileri sonuçlarında β veya γ secretases inhibisyonu β ve γ secretase5,6diğer fizyolojik yüzeylerde, işleyişi ile girişim bu kaynaklanmaktadır. γ-secretase inhibitörleri ile ilgili son çalışmalar bir dizi üzerinde çentik7 temel γ-secretase-aracılı işlenmesi ihmal edilebilir etkileri uygulamakla süre Aβ üretim düzenleyen kimyasal ve genetik modülatörler keşfi bildirdin ,8,9,10,11,12, ancak, başarılı tedavi değil henüz geliştirilmiştir. Böylece, daha fazla sistematik ekranlar seçici APP işleme γ-secretase-aracılı modüle roman genetik ve kimyasal değiştiricileri bulmak için garanti altındadır.
Γ-Secretase 90'dan fazla farklı proteinler membran bağlantılı ayırmak olduğu bilinmektedir. Bu yüzeyler arasında düzeydedir, olan faaliyet hücre kaderini belirleme farklılaşma geliştirme13sırasında için önemlidir. Seçmeli olarak γ-secretase-katalize APP olmaması durumunda işleme oransal çentik etkileyen işleme minimizing çentik ile ilgili yan etkileri için γ-secretase inhibitörleri gerekli olacak ve bu seçicilik olacak birincil faktör olduğu düşünülmektedir Reklam kronik tedavisi için potansiyel γ-secretase modülatörler biyolojik etkinliği dikte. Arylsulfonamide türevleri, GSI-953 (begacestat) ve BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase14,15güçlü ve seçici inhibisyonu sergilemek bulunmuş gibi bir dizi olmuştur. Bir önceki çalışma γ-secretase dekolte APP ve çentik fark inhibisyon Zebra balığı16kullanarak vivo içinde validation ile birleşimiyle ELISA tabanlı bir nicel tahlil gözlenen göstermiştir. Ayrıca, hücre tabanlı tahlil paradigmalar γ-secretase APP ve çentik17,18doğru olası substrat selectivity gidermek amacıyla kurulmuştur. Burada açıklananlar için benzer protokolleriyle, biz son zamanlarda yeni bir sınıf (d) keşfettim-kuvvetli APP γ-secretase bölünme çentik tutumlu seçicilik19ile modüle leucinamides. Birlikte, bu çalışmaların bir kanıtı-of-substrat seçicilik/kullanılabilirliğini γ-secretase kimyasal modülasyon ve deneysel doğrulama tabi olabilir fikri destekleyen concept sağlar. Ancak, bu tahlil platformlar çoğunlukla nispeten düşük işlem hacmi dökümanları ve ilaç bulma programları için endüstri standartlarını karşılamıyor olabilir emek yoğun yaklaşımlar kullanır.
Biz-si olmak son zamanlarda oluşturmak kantitatif γ-secretase iki farklı yüzeylerde, APP (APP-C99) 99-amino asit C-terminal parçası ve ekstraselüler katalitik aktivitesini belirleyebilirsiniz hücre tabanlı luciferase muhabir gen deneyleri Çentik peptid (NΔE) etki alanı silindi. APP-C99 ve NΔE olarak γ-secretase çeşitli deneyleri içinde doğrudan yüzeylerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Homojen ve tutarlı luciferase muhabir gen deneyleri için APP-C99 veya NΔE γ-secretase bölünme üretmek için yapısal bir Gal4 ateş böceği organizatörü tahrik luciferase muhabir (ifade eder bir istikrarlı hücre HEK elde edilen satır (CG) oluşturulan Gal4-Luc) ve Gal4/VP16-öğesini APP-C99 füzyon protein (C99-GV). Buna ek olarak, yapısal Gal4-Luc ve NΔE (NΔE-GV) Gal4/VP16-öğesini ifade başka bir istikrarlı hücre HEK elde edilen satır (NG) oluşturulan. Bu roman substrat özgü γ-secretase deneyleri kullanarak, biz şimdi ölçmek ve γ-secretase farklı yüzeylerde (CG hücrelerindeki APP-C99) veya NΔE NG hücrelere doğru katalitik aktivitesini ayırt etmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca, substrat özgü γ-secretase deneyleri yüksek içerik tarama platformları için elverişli olması için tasarlanmıştır. Bu yeni oluşturulan γ-secretase deneyleri bilişsel işlev yeni nesil tedavisi için istenmeyen çentik inhibisyon alabilme olmadan Aβ üretim baskılayarak artırabilirsiniz roman γ-secretase modülatörler keşfi için önünü açabilir Reklam.

<table><tbody><tr><td>VictorLight lüminesans plaka okuyucu</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II, Tip 2 Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Serisi A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Termo Fisher</td><td>12100046</td><td>büyüme ortamının ana bileşeni</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemositomer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu mikroplaka</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo lusiferaz test reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş CO2 inkübatör</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293 hücre hattı</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 yazılım sürümü 3.0</td><td>Lüminesans mikroplaka okuyucunun</td> <td>PerkinElmer</td><td></td> cihaz kontrol yazılımı</tr></tbody></table>

amiloid habercisi γ-secretase-aracılı protein ve çentik bölünme hücre tabanlı luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Biz hücre tabanlı muhabir gen deneyleri kantitatif farklı yüzeylerde γ-secretase bölünme ölçmek için bir çift geliştirdik. Bu el yazması γ-secretase-aracılı bölünme APP-C99 veya çentik, bir Gal4 ateş böceği organizatörü tahrik luciferase muhabir sistemi kullanarak izlemek için kullanılan yordamları açıklar. Bu deneyleri stabil CO HEK293 hücreleri Gal4 tahrik luciferase muhabir gen ve app (APP-C99; Gal4/VP16-tagged C-terminal parça transfecting tarafından kuruldu CG hücreleri), veya Gal4/VP16-etiketli çentik-ΔE (NΔE; NG hücreleri). Bu muhabir deneyleri paralel olarak kullanarak, biz bu göstermiştir bir ErbB2 inhibitörü CL-387,785, tercihen γ-secretase bölünme APP-C99 CG hücrelerdeki ama değil NΔE NG hücrelerdeki bastırmak. CL-387,785 ile tedavi ederken CG ve NG hücreleri tarafından sergilenen fark yanıt γ-secretase modülatörler için tercih edilen bir karakteristik, hem de bu yanıtları γ-secretase DAPT tarafından indüklenen pan inhibisyonu alışılmışın tersine olan. Çalışmalarımız γ-secretase faaliyetleri farklı yüzeylerde doğru hücresel bir bağlamda farklılaşmış doğrudan kanıt sağlar. Bu yeni deneyleri bu nedenle ilaç keşif geliştirilmiş AD tedaviler için yararlı araçlar olabilir.

İnhibisyon ErbB2 CL-387,785 tarafından differentially APP-C99 tarafından işlenmesini teşvik γ -secretase çentik bölünme etkilemeden Kantitatif belirli γ-secretase substrat proteolitik bölünme ölçebilirsiniz hücre tabanlı bir tahlil oluşturmak için biz oluşturulan CG HEK293 elde edilen hücre kültürünü bir tetrasiklin-indüklenebilir C-ölümcül Gal4/VP16-öğesini, istikrarlı co transfection tarafından APP-C99 ve bir Gal4 ateş böceği organiz...

İki substrat özgü γ-secretase deneyleri başarılı bir şekilde üretilip. Burada sunulan her iki hücre tabanlı deneyleri γ-secretase enzimatik faaliyetleri yolu ile ateş böceği luciferase gazetecilere verim ölçmek için tasarlanmıştır.

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Gama-sekretaz için bu kantitatif hücre bazlı raportör gen testinin genel amacı, varsayılan gama-sekretaz modülatörlerinin gama-sekretaz aracılı bölünme üzerindeki diferansiyel etkisini incelemektir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığının tedavisi için yeni gama-sekretaz modülatörlerinin tanımlanması gibi Alzheimer hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, yüksek verimli bir tahlil sistemi olması ve gama-sekretaz modülatörlerini kolayca tanımlayabilmesidir.Bu tekniğin anlamı, minimal yan etkilere sahip anti-AD ilaçlarının potansiyel keşfi yoluyla Alzheimer hastalığının tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, gama-sekretazın substrat seçiciliği hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca nöroblastom gibi diğer hastalıkların çalışmalarına da uygulanabilir.Bu yönteme yeni başlayan kişiler, hücre kültürü ortamının dikkatli bir şekilde çıkarılması ve 96 mikroplakaya eklenmesi ile mücadele edebilir, çünkü çok fazla rahatsızlık nihai sonuçları karmaşıklaştırabilir. Bu prosedüre, metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi NG ve CG hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın. Bir hemositometre ile NG veya CG hücrelerini sayın.Daha sonra, hücreleri, büyüme ortamında kuyu başına 200 mikrolitrelik bir nihai hacimde 96 oyuklu mikroplakalara oyuk başına 20.000 hücrede tohumlayın. Mikroplakaları nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörüne aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyonun ardından, her oyuktan 100 mikrolitre büyüme ortamını çıkarın.% 0.2 dimetil sülfoksit, iki mikromolar CL-387, 785, iki mikromolar DAPT veya diğer ilgili ErbB1 / ErbB2 inhibitörleri ile mililitre başına iki mikrogram tetrasiklin içeren büyüme ortamı kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. Tedavi edilen hücreleri ve mikroplakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mikroplakalardan büyüme ortamının oyuğu başına 150 mikrolitre çıkarın.Ardından, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, mikroplakaları bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında tutun. Lüminesans mikroplaka okuyucusunda saklanan önceden tanımlanmış bir programı kullanarak ateşböceği lusiferaz tarafından yayılan lüminesansı belirleyin.İlk olarak, cihaz kontrol yazılımını açın. Ardından, Araç menüsünden Luminometri'yi seçin. Parametreler ayarı altında, emisyon filtresi için Filtre Yok'u seçin, emisyon açıklığı için Normal'i işaretleyin, sayma süresi için bir tane girin ve lüminesans okumasını ayarlamak için Tamam'a tıklayın.Enstrüman kontrolü sekmesi altında, aktif protokoller listesinde ilerleyin ve lüminesansı okumak için önceden kaydedilmiş protokolü seçin. Canlı görüntü sekmesi altında, açılır menüden ölçeği tanımlayın ve tür için Logaritma veya Doğrusal'ı seçin. Sıcaklık sekmesi altında, plaka ısıtması için Kapalı'yı seçin.Son olarak, lüminesans okumasını gerçekleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın. Kontrol yazılımına gömülü Explorer'ı kullanarak sonuçları bir elektronik tablo formatına aktarın. Tetrasiklin içermeyen büyüme ortamı ile muamele edilen CG veya NG hücrelerinden arka plan lüminesansını tahmin edin.% 100 nispi gama-sekretaz aktivitesi olarak% 100 nispi gama-sekretaz aktivitesi olarak tek başına mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram içeren büyüme ortamında% 0.1 DMSO ile muamele edilen CG veya NG hücreleri tarafından yayılan bir lüminesans sinyali tanımlayın. Son olarak, tetrasiklin ve CL-387, 785 veya DAPT içeren büyüme ortamı ile kültürlenen CG veya NG hücrelerinden lusiferaz sinyallerini, DMSO ile muamele edilen CG veya NG hücreleri tarafından yayılan lusiferaz sinyaline normalleştirin. Burada, CG hücrelerinde APP-C99'un gama-sekretaz bölünmesinin kantitatif ölçümlerini gösteren temsili sonuçlar gösterilmiştir.Hücreler, 24 saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram varlığında bir mikromolar CL-387, 785 veya DAPT ile tedavi edildi. C99-GV'nin gama-sekretaz aracılı proteolizinden türetilen lüminesans, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 100 mikrolitre eklendikten sonra ölçüldü. Tek başına araçla muamele edilen hücreler tarafından yayılan lusiferaz sinyali% 100 bağıl lüminesans olarak ayarlandı.NG hücrelerinde N-delta-E'nin gama-sekretaz bölünmesinin kantitatif ölçümlerini gösteren temsili sonuçlar burada gösterilmektedir. Benzer şekilde, hücreler 24 saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre tetrasiklin başına bir mikrogram varlığında bir mikromolar CL-387, 785 veya DAPT ile tedavi edildi. N-delta-E-GV'nin gama-sekretaz aracılı proteolizinden türetilen lüminesans, lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 100 mikrolitre eklendikten sonra ölçüldü.Tek başına araçla muamele edilen hücreler tarafından yayılan lusiferaz sinyali% 100 bağıl lüminesans olarak ayarlandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, incelenecek bileşiklerin sayısını beklerken yalnızca bir ila iki saatlik bir uygulamalı süre gerektirir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Alzheimer hastalığı alanındaki araştırmacının, Alzheimer hastalığı için yeni terapötikler arayışında gama-sekretazın genetik ve kimyasal değiştiricisini keşfetmesinin yolunu açtı.

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, tetrasiklin ile indüklenebilir bir sistem kullanılarak genetik olarak değiştirilmiş insan hücrelerinde γ-sekretaz aktivitesini ölçme prosedürünü göstermektedir. İşlem, tetrasiklin ile APP gen ekspresyonunun indüklenmesini, amiloid β peptitlerin üretilmesini ve lusiferaz üretiminin aktive edilmesini içerir. Lusiferaz-substrat reaksiyonundan kaynaklanan biyolüminesans daha sonra ölçülür ve γ-sekretaz aktivitesini yansıtır.

İnsan Hücrelerinde γ-Sekretaz Aktivitesini Ölçmek için Lusiferaz Testi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücreden hücreye transferi, nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin ilerlemesinin altında yatıyor olabilir. Burada, rekombinant veya biyolojik numunelerden tohumlama aktivitesinin spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yeni bir FRET akış sitometrisi testi açıklanmaktadır.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Biz toplama misfolded proteinlerin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protocol detayları lentiviral istikrarlı hücre satırı üretimi, otomatik confocal görüntüleme ve görüntü analizi protein toplamları indüklenen. Açıklayıcı bir uygulama olarak SOD1 toplama bir saat ve doz bağımlı şekilde teşvik küçük moleküller etkisini okudu.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Bu protokol, rekombinant protein saflaştırmasını ubikitin zincir bölünme deneyleri ile birleştirerek nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genetik varyasyonun deubikitile edici enzim aktivitesi üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Öğrenin, hücre tabanlı luciferase muhabir tahlili ile γ-secretase aktivitesini nicel olarak ölçmeyi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı için yeni modülatörlerin belirlenmesine ve substrat seçiciliğinin incelenmesine olanak tanır.

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm (Video) | JoVE Journal

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

Daha fazla video keşfet