Name: Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Öğrenin, ATR-FTIR spektroskopisi ve çok değişkenli veri analizi kullanarak Plasmodium falciparum enfeksiyonunu hızlı ve düşük maliyetli tespit etmeyi. Bu yöntem, nokta bakım tanılarında hasta sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar için finansman Avustralya Araştırma Konseyi tarafından sağlanan (gelecek bursu FT120100926 BRW için), Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya'da (Program grant ve kıdemli araştırma bursu için JGB; Erken kariyer bursu JSR; Altyapı araştırma enstitüleri destek düzeni Grant Burnet Enstitüsü için), ve Victoria Eyalet hükümeti operasyonel alt yapıyı desteklemek Burnet Enstitüsü için Grant. Bay Finlay Shanks enstrümantal desteği anıyoruz.

Lütfen uygun malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) başvurun ve uygun seviye 2 (BSL-2) eğitim aramak. Tüm kodlamayla adımları aseptik teknik kullanılarak, eğer zararlı UV ışınlarına maruz dekontaminasyon adımları, iğne sopa yaralanmalar ve biyolojik etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak ve enfeksiyon riski olduğu anlamına gelir bir BSL-2 dolapta yapılmalıdır parazit kültür herhangi bir yaralanma girer. Ayrıca, stok kan kan bankalardan belirli hastalıklar ve kan hastalıkları kaynaklı yaymak için potansiyel ekranlı sadece potansiyel bir risk olduğunu. Yaralanma oluşumunu acil tıbbi yardım isteyin.
1. hazırlık ve 3D 7 ölçümü Plasmodium falciparum parazit seyreltme serisi
Not: Plasmodium sp. kültür son derece duyarlıdır. Taze/geçmemiş reaktifler kullanın ve parazitler düzenli olarak medya değiştirerek yem. Besleme kültürleri % 5 parasitemia iki günde aşağıda; kültürler arasında 6-%10 parasitemia bir veya iki kez bir gün besleme; ve kültürler arasında 11 – %20 4 kere a gün kadar yem. Açlıktan ölmeye başlıyor parazitler kaybetmek onların şekil ve sözleşme başlar. Böyle bir durumda, yem ve hemen da medyayı değiştirerek ve hisse senedi RBCs. toplamak donör kan antikoagülan ve ilk 6 saat içinde ölçü olarak heparin içeren kan toplama tüpler ekleyerek oranında seyreltin.
<ol><li>Kültür 3D 7 30 mL toplam parasitemia % 10 yüzük ulaşıncaya kadar Plasmodium falciparum parazitler standart protokolüne göre süzün.</li>
	<li>
Parazitler ve eşitleme
	<ol>
<li>11 h parazit yaşam döngüsü içine shizogeny sonra resuspend kültür ve transfer bir otomatik pipet kullanarak bir 50 mL konik tüp içine.</li>
		<li>300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları (25 ° C ve 100 kPa) kültür santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant pipet ile çizim veya pelet bozmadan bir vakuma bağlı bir Pasteur pipet kullanarak kaldırın. Atık medya % 10 çamaşır suyu çözüm atın.</li>
		<li>Yavaş yavaş 12-15 mL % 4 sorbitol çözeltisi kullanarak bir otomatik pipet Pelet ve kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme kültür karıştırın.</li>
		<li>15 dakika 37 ° C'de kültür kuluçkaya.</li>
		<li>300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları kültür santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant 1.2.3 adımda anlatıldığı gibi kaldırın.</li>
		<li>10-15 mL % 0,9 serum için Pelet ve çözüm kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme karıştırın.</li>
		<li>Adımları 1.2.6–1.2.8 sorbitol tüm kalıntıları yıkamak için iki kez daha tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parasitemia seyreltme serisi hazırlanması
	<ol>
<li>Stok RBCs adımları 1.2.6–1.2.9 olduğu gibi yıkayın.</li>
		<li>Standart laboratuvar koşulları, hisse senedi RBCs 300 – 400 x g 5 min için de, kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant adım 1.2.3 olduğu gibi atın.</li>
		<li>Microcentrifuge tüpler % 0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000 etiketleyin ve 0 µL, 1 µL, 2.5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL ve kültürünün sırasıyla 0,2-20 µL pipet kullanarak 100 µL ekleyin.</li>
		<li>100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 ve 0 µL stokunun RBCs tüpler etiketli %0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000, sırasıyla ekleyin.</li>
		<li>1200 x g ve 10 min için Standart laboratuvar koşulları, antikoagülan tüpler santrifüj taze donör kan toplanır.</li>
		<li>Bu bir pipet ile çizerek ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi atarak plazma kaldırın.</li>
		<li>İzole RBCs 900 µL her microcentrifuge tüp içine ve 10 x ters çevirme tarafından iyice karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spektral edinme
	<ol>
<li>Eşlik eden spektral satın alma programı kullanarak, "Enstrüman Set-Up" tıklatın ve veri koleksiyon parametrelerini şu şekilde ayarlayın: 128 taramalar için arka plan; örnek için 32 inceden inceye gözden geçirmek; ve çözünürlük 8/cm enstrümanın en büyük örnek aralığında.</li>
		<li>ATR-FTIR Spektrometre üreticisinin tavsiye başı sıcaklık ayarlayın veya bir gece.</li>
		<li>Kristal ücretsiz mendil Ultrasaf Su ile nemlendirilmiş lint kullanarak dairesel bir hareketle hafifçe ovma tarafından temiz. O zaman başka bir tüysüz ücretsiz temizleme işlemi kullanarak iyice kurulayın.</li>
		<li>"Arka plan ölçüm" tıklatarak arka plan ölçüm hava almak. Her 20 dk, kristal adım 1.4.3 olduğu gibi temiz ve bu ölçüm yineleyin.</li>
		<li>Canlı görüntü "Önizleme" seçeneğini tıklatarak açın. Kristal temiz olduğunu gösterir bir düz, yatay temel gözlemlemek.</li>
		<li>Deiyonize su doğrudan orta kristalin üzerinde 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın. Her beşinci örnek sonra bu su ölçüm yineleyin.</li>
		<li>Tüysüz ücretsiz mendil ve yumuşak dairesel hareketlerle kullanarak kristal kuru.</li>
		<li>Örnek 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın.</li>
		<li>Adım 1.4.3 olduğu gibi örnek arasında kristal temiz.</li>
		<li>Örnekleri ve çoğaltır sırasını rastgele emin 3 çoğaltır iktisap kadar yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. çok değişkenli veri analizi (MVDA)
Not: Veri tedavi tüm veri kümesi üzerinde gürültü ve biyolojik olmayan kökenli doruklarına ilavesi önlemek için yapmanız gerekir. Buna ek olarak, biyolojik olarak ilgili bölgeleri üzerinde analiz: 2980-2800/cm ve 1750-850/cm.
<ol><li>
Veri tedavi Not: İki yazılım, Örneğin, Matlab (bundan böyle 1 yazılım olarak da adlandırılır) ve Unscrambler (bundan böyle 2 yazılım olarak da adlandırılır) X MVDA için örnek olarak kullanılır. Yazılım 1 MVDA bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) ek gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Ancak, bu bir GUI (Tablo reçetesi) satın almak için tavsiye edilir. Yazılım 1 atıfta bu üstlenecek yaparken aşağıdaki talimatlara piyasada bulunan GUI araç kutusu ile birlikte, ve örnek veri tedavi senaryo bağlı.<ol>
<li>Uygun çok değişkenli veri analizi yazılımı açın, "Veri al" seçeneğini tıklatın ve çözümleme için dosya türünü seçin.<ol>
<li>Yazılım 1, "Analiz" GUI açmak için command window içine girdi. Sağ X box "Veri al" bulmak için tıklatın.</li>
			<li>Yazılım 2, "Alma" bulmak için "dosya" sekmesini tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tüm spectra her kümede ayrı ayrı seçip "Aç" düğmesini tıklatarak veri kümeleri olarak örnek, su ve temel spectra çalışma alanına alma ve her kümesi, Örneğin, 'wat' su spectra ürününün veri kümesi için kısa bir ad verin.</li>
		<li>Yeni Tablo/Matris "yeni Matrix/vektör" tıklatarak seçin ve n örnek sayısına nerede bir n × 1 vektör oluşturmak. Her örnek parasitemia giriş ve vektör 'Parasitemia' adını verin.<ol>
<li>Yazılım 1, "Yeni değişken" komut penceresinde tıklatın.</li>
			<li>Yazılım 2, "Yeni Matrix" simgesini tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verileri ' "Çizmek veri simgesini" çizmek. "Zoom" tıklayarak ve 1800-1400/cm üzerinde yakınlaştırma spectra su buharı efektler için incelemek; en açık biçimde gözlenen Amid yamaçları boyunca kısa, keskin, dar tepeler olarak ben ve Amid II bantları.</li>
		<li>Aşırı su buharı durumlarda Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve "Düzeltme" seçin. Gürültü ve/veya güçlü su buharı katkıları düzgünleştirme 25 puan kullanarak örnek ve su spectra yumuşatma tarafından azaltmak veya su buharı düzeltme yöntemini kullanabilirsiniz.</li>
		<li>Uygunsa, adım 2.1.4 aynı Düzenle/pre-process veri sekmesindeki temel düzeltme algoritması kullanarak doğru yatay-temel.</li>
		<li>Su spectra ortalama ve örnek veri kümesi için eşdeğer bir n × m matris satırları kopyalayın ve 0,7 tarafından çarpılarak % 70 yoğunluğu azaltmak.<ol>
<li>Yazılım 1, bunu komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası "AverageWater=mean(WaterDataset)" girerek. Sonra Kopyala-Yapıştır örnek veri kümesi eşleşen satırları. Giriş yoğunluğu azaltmak için "AverageWater70 AverageWater = * 0,70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her örnek spektrum üzerinden ortalama su spectra çıkarma.<ol>
<li>Yazılım 1, komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası girerek bunu "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".</li>
		</ol>
</li>
		<li>İkinci türev işlevi uygular ve sonra verileri tek normal değişken (SNV) işlevi seçerek normal duruma getirmeye ve ortalama Merkezi veri Düzenle/pre-process veri sekmesini açın.<ol>
<li>Yazılım 1, tek seferde bunu. Önce "Türev" ve giriş 25 puan yumuşatma, polinom 3 sırasını ve düzgünleştirme 25 puan ve çetinkaya-deniyordun işlevini kullanarak Ayarla örnek üzerinde türev sipariş seçin. O zaman seçme "SNV" ve "Demek Merkez". Tamam/Uygula "'ı" tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve sadece onların kutuları işaretli olmasını sağlayarak 2.980-2800/cm ve 1750 – 850/cm "Sütun değişkenleri", seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Asıl adı bileşen analizi (PCA)<ol>
<li>Tıklatın "analiz | Ayrışma"ve seçme PCA.<ol>
<li>Yazılım 1, "Model inşa"'i tıklatın.</li>
				<li>Yazılım 2, PCA yöntemleri girdi. En iyi dizi sorumlusu bileşen (adet) - iş, 7 - giriş ve en çok 100 yinelemeden ve seçim çapraz doğrulama için doğrulama yöntemi. "Çalıştır" ı tıklatın.</li>
			</ol>
</li>
			<li>% 95 güven sınırı, kesikli halkada puanları Arsa PC1 ve PC2 arasında gözlemlemek.</li>
			<li>Örnek spectra sınırı dışında "Seçin Spectra aracı" kullanarak potansiyel aykırı ortaya puanları ile işaretleyin.</li>
			<li>İşaretli spectra yüksek varsa Hotellings T2 değerleri ve yüksek Q fazlalıklar onları daha fazla çözümleme dışı bırakmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R)<ol>
<li>Tıklatın "analiz | Regresyon"ve seçme"PLS-R".<ol>
<li>Yazılım 1, şu Y bloğu'nu tıklatın ve vektör seçin "Parasitemia | Model oluşturmak".</li>
				<li>Yazılım 2, PLS-R yöntemleri girdi. "Parasitemia" vektör seçim çapraz doğrulama doğrulama yöntemi olarak örnek veri kümesi olarak "X veri kümesi" ve "Y başvuru" olarak seçin. "Çalıştır" ı tıklatın.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Regresyon modelini analiz. R2 değerleri üzerinden 0,80 ve %0,1 parasitemia daha az olan çapraz doğrulama (RMSECV) değerleri, ortalama karekök hata kabul edilebilir modellerdir.</li>
			<li>Regresyon vektör analiz ve biyolojik grupları tanımlar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
<li>Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+threat%3A+asymptomatic+parasitemia+and+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).</li>
<li>Hanscheid, T., Grobusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+useful+is+PCR+in+the+diagnosis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">How useful is PCR in the diagnosis of malaria.</a> Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).</li>
<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
<li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Malaria+Rapid+Diagnostic+Test+Performance%3A+results+of+WHO+product+testing+of+malaria+RDTs%3A+round+6+%282014-2015%29%22">Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015)</a>. , (2014).</li>
<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

PLS-R modeli Doğrusal bir ilişki, Y bulduğu bir yöntemdir denetimli birden fazla varyasyon = bX + E on, akıllı değişken X arasındaki (burada, her wavenumber absorbans) ve sürekli değişken Y (burada, parasitemia düzey). Kısacası, model değişkenleri x korelasyon x ile Y farkı yakalamak gizli değişkenler (LVs) yeni bir dizi oluşturmak için birleştirir ve regresyon vektör (b) hesaplar bu y değeri tahmin yeni bir spektrum sonuçları ile çarpılır. İki değer modeli gücünü alınabilir: R2 değeri ve ortalama karekök hata...

Sıtma bizim zaman en yıkıcı hastalıklar arasında olduğunu; endemik bölgelerde risk yarım nüfus yaşıyor ve orantısız yoksul1,2,3,4durumu. Sorunun büyük bir parçası asemptomatik taşıyıcılar ve toplumlarda kalıcı olması izin ve sivri enfeksiyon sırasında ıslak mevsim neden rezervuarlar için sivrisinek vektörel çizimler5, aracı olarak erken sahne hastalar var. Sıtma en ölümcül hastalık2en ağır formu neden P. falciparum olduğunu beş Plasmodium parazitler tarafından nedeniyle oluşur.
Şu anda, sıtma tanısı için mükemmel daha az tekniklerdir. Optik mikroskobu, geçerli altın standart, sadece 62-88 parazitler/µL kullanılan yöntem6bağlı olarak algılayabilir. Ayrıca, intensiveness ve yüksek beceri gerekli, birçok bölgeler mikroskopi misdiagnoses nedeniyle > özellikle düşük parasitaemia sahip olanlar doğrudan kaynakları alanında ve sonuçlarında eksikliği bağlanabilir2, seviyesi %50 Olguların anti-sıtma ilaçları suistimal. Hızlı tanı antikorlar algılama ve ayırımcılık ve parazitlerin DNA'ölçmek polimeraz zincir tepkimesi (PCR) deneyleri için kullanan testleri (RDTs), diğer 2 ana tanı yöntemleri vardır. Şu anda, RDTs sadece P. falciparum ve P. bağlı en az 100 parazit/µL kan hastalığı tedavi edilmezse nadir formlarda kaynaklanan tespit edebiliyoruz. 7 , 8 buna ek olarak, PCR deneyleri ayırımcılık ve Plasmodium farklı tür bir duyarlılık 0.0004-5, ölçmek parazitler/µL kan. Ancak, bu pahalı reaktifler, ekipman ve teknik beceri gerektirir ve böylece alan uygulama için uygun değildir.
Son derece hassas, güvenilir ve uygun fiyatlı bir teknik tanı kez, böylece hasta sonuçları iyileştirilmesi ve hastalık ortadan kaldırılması mümkün hale geliştirmek için önemlidir. Zayıflatılmış toplam yansıma Fourier dönüşümü (ATR-FTIR) spektroskopisi bu sorun için olası bir çözüm sunar. Önceki çalışma algılamak ve P. falciparum kan filmler algılama sınırları elde sabit metanol ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir < 1 parazit/µL kan (< %0.0002 parasitemia) PCR yöntemleri için karşılaştırılabilir olan9,. Son yıllarda yapılan çalışmalarda algılamak ve parazitler sulu örneklerinde ölçmek ve böylece fiksasyon adım ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, su buharı, spektral gürültü ve veri tedavi gibi faktörler en iyi sonuçları10için dikkate alınması gerekir.
Yeni kullanıcılar ATR-FTIR spectra almak ve sulu kırmızı kan hücreleri (RBC) örnekleri10 P. falciparum tespiti için bir regresyon modeli hazırlamak nasıl göstermek için bu protokolü amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Donör kanı</td> <td>-</td><td></td> <td>Eğitimli bir tıp doktoru tarafından toplanmalıdır</td></tr><tr><td>Stok kanı</td><td>Avustralya Kızıl Haçı'</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>Burnet</td> <td>Enstitüsü-Laboratuvar</td> <td>suşu vahşi tip eşdeğeri</td></tr><tr><td>RPMI-1640 ortamı, Sodyum Bikarbonat içermeyen L-hepes ile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albümaks (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>,</td><td>Aliquot'u 50 mL'lik şahin tüplerine E003000PJ ve dondurucuda saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Leke</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Kültürde kullanılmadan önce filtrelenmelidir</td></tr><tr><td>Kan alma tüpleri (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma Yağı</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL kültür kapları</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipet uçları</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipet uçları</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik pipet kontrolörü</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Santrifüj</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Doğrudan Isı CO2 İnkübatörleri</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Binoküler Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Satın alırken 100x lensin yağ olduğundan emin olun daldırma lensi</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR ATR Hızlı Yakalama Bağlantılı Spektrometre</td>, <td>Bruker</td><td>9308-3700</td> Matlab Mathworks Inc <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Çok Değişkenli veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Çok Değişkenli veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td> satın alırken "Eco-ATR" eki talep ettiğinizden emin olun.<td></td><td>Matlab için GUI</td></tr></tbody></table>

algılama ve miktar için plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Biz miktar yöntemi ve parazitler ve sulu kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) algılama çok değişkenli veri analizi () ile birlikte basit benchtop zayıflatılmış toplam yansıma Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spektrometresi kullanılarak göstermek MVDA). 3D 7 P. falciparum % 10 parasitemia yüzük sahne parazitler için kültürlü ve seri 0-1 arasında bir seyreltme oluşturmak için taze donör izole RBCs spike için kullanılan %. Her örneğinin 10 µL spektrum elde etmek için ATR elmas pencerenin ortasına yerleştirildi. Örnek verileri sinyal gürültü oranı artırmak için ve su katkısını kaldırmak için tedavi edildi ve sonra ikinci türev spektral özellikleri gidermek için uygulandı. Verileri daha sonra MVDA iki tür kullanarak analiz edildi: ilk asıl bileşen analizi (herhangi bir aykırı ve sonra kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R) miktar model oluşturmak için belirlemek için PCA).

Kısmi en küçük kareler (PLS-R) Arsa ve onun ilişkili regresyon vektör, Şekil 1a ve 1b sırasıyla, parazit sinyal bir doğrusal regresyon modeli için kullanılacak form için kullanılabilir RBCs yeterince farklı olduğunu göstermektedir tahmin parazitler ve gelecekteki veri kümesi.
Sağlam, doğrusal PLS-R modeli 0,87 bir R-kare değeri ile oluşturulan ve %0.13 parasitemia, <strong class="xf...

Burada, bir protokol için Plasmodium falciparum miktar virüslü sulu kırmızı kan hücrelerinde bir zayıflatılmış toplam yansıma kızılötesi Spektrometre ve çok değişkenli veri analizi kullanarak ve algılama mevcut.

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Bu işlemin genel amacı, çok değişkenli veri analizi ile ATR-FTIR spektroskopisi kullanarak sıtma paraziti tahmini için bir regresyon modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, gelecekte hasta sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olabilecek bakım noktası tanılarının hızlandırılabına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, modelin oluşturulması biraz zaman alsa da, son derece taşınabilir, kullanıcı dostu, son derece hassas ve düşük maliyetli olmasıdır.Bu yöntem sıtma parazitlerinin sayısallaştırılmasını mümkün kılmasına rağmen, antimikrobiyal ajanlara bağlı parazit bileşimindeki değişiklikler gibi çevresel değişikliklere yapılan fenotipik yanıtı gözlemlemek için de kullanılabilir. Bu fikir, Avustralya Senkrotron'da sıtma yalıtılmış hücreler üzerinde yaptığımız çalışmalardan gelişti. Bu tek hücreli seviyedeydi.Oradan, atr-FTIR spektroskopisi aslında tanı testi geliştirmek için kullanmaya karar verdi. Senkronizasyon prosedürübaşlamadan önce, kültür 30 mililitre 3D7 zorlanma Plasmodium falciparum parazitler metin protokolünde açıklandığı gibi. Otomatik bir pipet kullanarak, kültürü yeniden askıya alın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Kültürü standart laboratuvar koşullarında 300-400 kat g olarak beş dakika santrifüj edin. Peleti bozmadan otomatik bir pipetle çizerek süpernatantı çıkarın. Atık ortamı %10 çamaşır suyu çözeltisine atın.Yavaş yavaş pelet için% 4 sorbitol çözeltisi 12 ila 15 mililitre ekleyin ve kültür homojen olana kadar tüp kapama ve ters çevirerek kültürü karıştırın. Kültürü 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, beş dakika için kültür santrifüj.Peletrahatsız etmeden supernatant kaldırmak için otomatik bir pipet kullanın. Pelete %0,9 tuz 10 ila 15 mililitre ekleyin ve kültür homojen olana kadar tüpü kaplayıp ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Santrifüj ve tuzlu çözeltisi sorbitol tüm kalıntıları kaldırmak için iki kez daha yıkayın tekrarlayın.Bu prosedürü başlatmak için, stok kırmızı kan hücreleri santrifüj, veya RBC. Supernatant çıkarın ve üç kez toplam% 0.9 tuzlu ile yıkayın. Stok RBC'leri ve kültürü 5 dakika boyunca 300 ila 400 kez g olarak santrifüj edin ve her tüpten süpernatant atın.Sekiz mikrosantrifüj tüpünü belirtildiği gibi etiketle. Sonra her tüp için kültür uygun miktarda eklemek için 0,2 ila 20 mikrolitrelik pipet kullanın. Daha sonra, istenilen parazitseyreltme elde etmek için her tüp stok RBC uygun miktarda ekleyin.Antikoagülan tüplerde toplanan taze donör kanı 1,200 kez g ve standart laboratuvar koşullarında 10 dakika santrifüj edin. Bir pipet ile çizerek ve% 10 çamaşır suyu çözeltisi içine atarak plazma çıkarın. Her mikrosantrifüj tüpüne 900 mikrolitre izole donör RBC ekleyin ve 10 kez ters çevirerek iyice karıştırın.Basit bir tezgah üstü Zayıflatılmış Toplam Yansıma Fourier Transform Infrared veya ATR-FTIR spektrometresi spektrum elde etmek için kullanılacaktır. Kristali dairesel bir hareketle hafifçe temizlemek için ultra saf suyla nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendiller kullanarak kristali hazırlayın ve temizleyin. Daha sonra, iyice kristal kurutmak için başka bir tiftik içermeyen silme kullanın.Arka Plan Ölçümü'ne tıklayarak havanın arka plan ölçümlerini alın. Her 20 dakikada bir kristali temizleyin ve bu ölçümü tekrarlayın. Önizleme'yi tıklatarak canlı görünümü açın.Kristalin temiz olduğunu gösteren düz, yatay bir taban çizgisini gözlemleyin. Pipet 10 mikrolitre deiyonize su doğrudan kristalin ortasına ve Ölçü Örneği'ni tıklatın. Tüy bırakmayan bir silme ve hafif dairesel bir hareket kullanarak kristali kurulayın.Pipet 10 mikrolitre numune kristalin ortasına ve Ölçü Örneği'ni tıklatın. Kristali numuneler arasında temizleyin. Bu gösteride MATLAB kullanılarak çok değişkenli veri analizi yapılacaktır.Veri işlemeye başlamak için, grafik kullanıcı arabirimini açmak için komut penceresine giriş çözümlemesi. Alma Verilerini bulmak için X kutusuna sağ tıklayın. Çözümleme için dosya türünü seçin.Her kümedeki tüm spektrumları ayrı ayrı seçerek, Aç'ı tıklatarak ve her kümeye kısa bir ad vererek, örnek, su ve temel spektrumları işyerine veri kümesi olarak aktarın. Komut penceresinde Yeni Değişken'i tıklatın ve vektöre Parazitmia adını verin. Her numunenin Paraziti'ni girdirin.Çizim Verilerini bulmak için X kutusuna sağ tıklayın. Verileri çizmek için Verileri Çiz simgesini tıklatın. Zum'u tıklatarak ve 1, 800-1, 400 santimetreyi yakınlaştırarak su buharı etkileri için spektrumları inceleyin, en açık şekilde Amide I ve Amide II bantlarının yamaçlarında kısa, keskin, dar zirveler olarak gözlendi.Aşırı su buharı durumlarında, İşlem Öncesi Edit veri sekmesini açın ve Düzleme'yi seçin. Numuneyi ve su spektrumlarını yumuşatarak gürültüyü ve/veya güçlü su buharı katkılarını azaltın. Metin protokolünde açıklandığı gibi daha fazla veri işlemden sonra Verileri Edit sekmesini açın ve sütun değişkenlerinde yalnızca kutularının işaretli olduğundan emin olarak 2980-2800 santimetre ve 1750-850 santimetre seçin.Veriler analiz için hazır. Ana bileşen çözümlemesi veya PCA gerçekleştirmek için Çözümlü Çözümayrış'ı tıklatın ve PCA'yı seçin. Model Oluştur'u tıklatın.PC 1 ve PC 2 arasındaki skorlar arsa% 95 güven sınırı, kesik halka, gözlemleyin. Örnek spektrumları, sınırın dışında potansiyel aykırılayıcılar olarak gösteren puanlarla işaretlemek için Spectra'yı seç aracını kullanın. Kısmi en az kareregresyon veya PLSR gerçekleştirmek için Çözümleme Regresyonu'na tıklayın ve PLSR'yi seçin.Sağ tıklayın Y bloğu ve vektör Paraziti yapı modeli seçin. Regresyon modelini ve regresyon vektörü analiz edin ve biyolojik bantları tanımlayın. RBC'lerin kısmi en az kareregresyon çizimi sıfır ile yüzde bir arasında yükselir Parasitemi0,87 R kare değeri ve %0,13 Parazitmi kök ortalama kare çapraz doğrulama hatası oluşturmıştır.Bu, modelin x ekseninde bilinen Parazitmia ve y ekseninde öngörülen Parazitmiye ile her örnekte Parazitmi tahmin etme yeteneğini gösterir. İlişkili regresyon katsayısı, her bandın modelin tahmin yeteneğine katkısını açıklar. Grup ne kadar yoğunsa, modele o kadar çok katkıda bulunur ve böylece parazitin kanın kimyasal bileşimini nasıl değiştirdiği.Sonuçlar, parazitlerden gelen sinyalin RBC'lerden yeterince farklı olduğunu ve gelecekteki veri kümelerinde parazitlerin tahmini için doğrusal bir regresyon modeli oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa örnek başına üç dakikadan az sürebilir. Bu prosedürü çalışırken, tüm kalıntı ATR kristalleri temizlemek için hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, P vivax ve P sıtma gibi diğer sıtma türleri gibi sorulara cevap vermek için modellenebilir, ATR-FTIR spektroskopisi türler arasında ayrım yapmak için yeterince duyarlı mı? Bu teknik, geliştirildikten sonra biyospektroskopi alanında araştırmacıların kanyoluyla bulaşan diğer patojenlerin tespiti ve niceliklerini keşfetmelerinin ve hatta kanda glikoz ve üre gibi analizlerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir regresyon modeli oluşturmak için ATR-FTIR spektroskopisi ve NVDA analizi iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.Hasta kan ve sıtma örnekleri ile çalışan tehlikeli olabilir unutmayın, ve uygun biyogüvenlik düzeyi eğitim ve çevreleme her zaman bu prosedürü çalışırken yapılmalıdır.

detection-quantification-plasmodium-falciparum-aqueous-red-blood

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu video, monositler tarafından etiketlenmiş ve opsonize edilmiş Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositleri içeren akış sitometrisi tabanlı bir fagositoz testini göstermektedir. Akış sitometrisi, monositlerdeki floresansı tanımlar ve fagositoz yoluyla opsonize eritrositlerin başarılı bir şekilde tanımlandığını doğrular.

Parazitle Enfekte Eritrositlerin Antikor Aracılı Fagositozunun Ölçülmesi İçin Bir Test

Hemozoin bir paramanyetik özelliklerinin geç aşamalarında izole etmek için...

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.  Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Öğrenin, ATR-FTIR spektroskopisi ve çok değişkenli veri analizi kullanarak Plasmodium falciparum enfeksiyonunu hızlı ve düşük maliyetli tespit etmeyi. Bu yöntem, nokta bakım tanılarında hasta sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olur.

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi (Video) | JoVE Journal

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Daha fazla video keşfet