Name: Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Öğrenin farelerde Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun muhabir enzim floresansı ile optik görüntüleme yöntemini. Bu teknik, patogenez ve aşı araştırmalarında duyarlı tespit sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hayvan çalışmaları yönergeleri ve İleri Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Texas A & M Üniversitesi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Gözden geçirme ve onay bir biohazard emniyet amiri veya komite toplantısında, kurum-ebilmek var olmak gerekli.
Dikkat: Tüm yordamlar BSL3 koruma gerektirir. Personel her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek için gereklidir. Tüm manipülasyonlar Biyogüvenlik Kabini (BSC) içinde gerçekleştirilir ve tüm "Sharps", "Sharps" kaplarda imha. Çalışma yüzeyleri ve BSC tamponlu fenol ve % 70 etanol ile iş başlatma öncesi ve işten sonra temizlenir. Yordamlar normalde 3 Biyogüvenlik düzeyinde Mycobacterium tüberkülozbitmiş olurdu ama illüstrasyon ve filme amacıyla yazarlar Biyogüvenlik seviye 2 daha az öldürücü bakteri ile bu yordamlar göstermektedir.
1. suşları ve kültür koşulları
Not: M. tuberculosis zorlanma CDC1551 bu çalışmada kullanılır, ancak herhangi bir M. tuberculosis zorlanma aynı şekilde kullanılabilir.
<ol><li>M-OADC-TW içinde bakteri büyümesi (7H %9 0.5 gliserol, oleik asit cinsinden % 10 dekstroz katalaz karmaşık ve 0,05 ile desteklenmiş suyu % ara-80) 37 ° c 0,5 OD600 ile orta ayakta (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>M-OADC-TW içinde kültür seyreltik (1:10 dizi dilutions bakteri). Bakteri dilutions plaka (105, 106, 107, 108) nüsha CFU belirlenmesi izin vermek için seçici 7H 11 plakaları üzerine içinde.</li>
	<li>Tabakları dört hafta 37 ° C'de veya koloniler doğru sayabiliriz kadar kuluçkaya.</li>
	<li>Bakteriyel inoculum 8,534 x g bir Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi. Pelet kez 10 mL serum fizyolojik ile yıkayın (% 0.9 NaCl) ve Pelet 15 mL serum fizyolojik yeniden askıya alma (% 0.9 NaCl).</li>
</ol>2. aerosol enfeksiyon bir Madison odaya kullanarak fare
<ol><li>Fareler yeni çevre için bir hafta boyunca alışmana izin.</li>
	<li>Odanın içine yükleme önce fareler tartın.</li>
	<li>Üç ses tellerini güç uzatma kablosuna takın: Ana odaya güç, vakum pompası ve o sırada hava kompresörü.</li>
	<li>Cam Kavanoz dikkatlice sökün. Cam Kavanoz Biyogüvenlik kabine getirmek ve serum 15 mL askıya meydan inoculum ekleyin (% 0.9 NaCl) elde etmek için ~ 104 - 106 CFU bakteri akciğerlerde.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini cam kavanoza kapağını kapatın. Kavanoz Nebulizatör birimine bağlamak ve alt (alımı) son çeyrek inç kavanozun içinde sıvı seviyesinin altında Dikey paslanmaz çelik boru ayarlamak.</li>
	<li>Odanın içine (odası 90 fareler tutabilir) deney için gerekli bütün hayvanlar takın ve tüm kilitler kapısını kapatın.</li>
	<li>(Oda) ana kontrol hava AKIS METRESI. Float (top) ortasına yaklaşık 50 L/soldaki ölçekte ölçülen min çalıştığından emin olun.</li>
	<li>Odası kontrol panelindeki Başlat düğmesine basın. Kompresör hava AKIS METRESI (sol küçük metre) aracılığıyla hava debisi oranı 4 L/dak ölçek üzerinde ayarlayın. Görsel meydan inoculum nebulize olduğunu emin olun.</li>
	<li>15 dk sonra kırmızı ışık ön kontrol panelinin görünür ve sesli bir sinyal Çalıştır sonunu gösterir zaman Sayaçlarý sýfýrlamak için kontrol panelinin sağ alt köşesinde sıfırlama düğmesine basın.</li>
	<li>Vakum serbest bırakmak için odasının kapısında küçük kırmızı düğmeye basılı tutun.</li>
	<li>Odası kapıyı aç ve hayvanlar kaldırın. Fareler onların kafes yerleştirin.</li>
	<li>Nebulizatör cam kaldırmak ve bir kapalı, sızıntı geçirmez taşıma kapsayıcısına getirin. Biyo-güvenlik kabini kapsayıcı yerleştirin ve meydan okuma süspansiyon belirlenmiş bir atık konteyner içine atın.</li>
	<li>Bir biohazard çanta içinde kullanılan Nebulizatör kavanoz yerleştirin ve çantayı otoklav taşınmaya mühür.</li>
	<li>Enfeksiyon yordamın sonundaki odasının içi tampon fenol ve % 70 etanol ile sprey ve 10 dakikadır oturacak odası sağlar.</li>
	<li>Ardından, tüm erişilebilir iç yüzeyleri çok iyice silin. Tüm kirli kağıt havlu vb.atmayın. biohazard çöpe. Otoklav Çöp konteyner atık ve Nebulizatör kavanoz kullanılır.</li>
	<li>Hayvanlar koruma odasına görüntüleme saat noktaya kadar yerleştirin.</li>
	<li>Görüntüleme günü, ikincil bir kapsayıcı hayvanlarda görüntüleme odasına aktar.</li>
</ol>3. hayvan anestezi
<ol><li>Fareyi kullanarak özelleştirilmiş gaz anestezi sistemi isoflurane ile anestezi.</li>
	<li>Her bir anestezi ünitesi üzerinde bulunan iki kömür filtre teneke kutu tartın.</li>
	<li>Ağırlığı 50 g ilk ağırlık yukarıda ise yeni bir tüple değiştirin.</li>
	<li>Buharlaştırıcı birim yordamı için yeterli isoflurane emin olmak için denetleyin.</li>
	<li>Burun konisi tutucu görüntüleme odası yerleştirin. Burun koni yordamı için gerekli sayıda koyun ve burun konisi blokerleri ile kalan açıklıklar mühür.</li>
	<li>Yüksek basınç silindir oksijen kaynağından açmak ve 55 PSI ayarlayın.</li>
	<li>Anestezi biriminin önünde bulunan tahliye pompası açmak ve 8 L/dak için ayarlayın.</li>
	<li>Anestezi biriminin önünde bulunan oksijen iki durumlu açın.</li>
	<li>1, 5 L/dak dönüş gaz akışını gaz akışı yola anestezi indüksiyon odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>Gaz akışı 0,25 L/dak dönüş gaz akışını yola görüntüleme odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>İsoflurane Buharlaştırıcı açın ve 2-%2,5 olarak ayarlayın. Sayı ve ağırlık denemenin yanında dönme isoflurane Buharlaştırıcı (~ 20 g ağırlığında bir fare için % 2-2.5; %4 300 gr ağırlığında bir kobay için) aramada kullanılan hayvanların göre isoflurane düzeyini ayarlayın.</li>
	<li>Fareler anestezi odasında yerleştirin ve kapağını kapatın. Anestezi indüksiyon odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>5-10 dk kadar tamamen anestezi anestezi indüksiyon odasında fareyi bırakın.</li>
	<li>Fareler anestezi sonra görüntüleme sırasında onları korumak için göz optik bir merhem uygulamak.</li>
	<li>Öyle ki burunlarını görüntüleme işlemi sırasında anestezi farelerin kolaylaştırmak için burun konisi yerleştirilir fareler ventral veya sternal recumbency yerleştirin.</li>
</ol>4. gazeteci enzim floresan (REF) görüntüleme
<ol><li>Belgili tanımlık substrate (20 µM, ağırlığının 2,5 µL/g) enfekte içine mayi enjeksiyon yanı sıra kontrol fareler tarafından enjekte. Fareler görüntüleme odası için az 1 dk içinde anestezi altında değildir.</li>
	<li>Görüntüleme sistemini başlatın.</li>
	<li>Sistem başlatma üzerinde tıklatarak başlatın. Sıcaklık çubuğu yeşile döner kadar bekleyin. Not: Görüntüleme sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için ısıtmalı bir platform görüntüleme odası oluşmaktadır.</li>
	<li>Satın alma ayarı görüntüleme için floresan seçin | Bütün hayvan ya da akciğer dokusu, yapısı ve edinme Denetim Masası'ndaki yerleşimi için Epi-aydınlatma için Trans-aydınlatma.</li>
	<li>Görüş alanı tek fare ve lamba düzeyini Yüksek B olarak ayarlayın.</li>
	<li>Pozlama süresi için otomatik, orta binning, 2-3 f/durdur ve uyarma süzgeci 745 nm ve emisyon filtreleri, 780--dan ayarla nm 840 için nm.</li>
	<li>Sıra kurulumu için sıra yapısı'nı tıklatın, 9-12 Trans-aydınlatma noktaları akciğer alanında seçin.</li>
	<li>Al üzerinde resim alma için düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Fare geri kafes sonrası görüntüleme içine yerleştirin.</li>
	<li>Tamamen iyileşti kadar fareler izlemek veya bir zaman-noktada deneme Imaging Eğer CFU miktarının için feda. Farelerin sonrası görüntüleme esenlik izlemek için değiştirilmiş bir Karnofsky skoru gerçekleştirin.</li>
</ol>5. REF görüntüleme analizi
<ol><li>Görüntüleme yazılımını açın.</li>
	<li>Görüntü dosyaları Gözat simgesini tıklatarak yükleyin.</li>
	<li>Spektral unmixing, spektral Unmixing üzerinde araç paleti tıklatın ve ayıramayacağız için gerekli spectra'ı tıklatın. Başlangıç unmixing'ı tıklatın.</li>
	<li>Optik yüzey imar için yüzey topografya üzerinde'yi tıklatın.</li>
	<li>Dorsal, kürk fare tabi yönlendirmeye seçin ve Generate yüzey'i tıklatın.</li>
	<li>Görüntüyü Kırp çizmek ve ilgi bir bölge için eşik resmi. Bitti'yi tıklatın.</li>
	<li>Organ kayıt için 3D optik araçlar açılan menüsü kayıt sekmesine gidin.</li>
	<li>Organları bir organ atlas ilgi kayıt.</li>
	<li>Organ boyutu veya açık/kapalı paneli-kayıt araçlar üzerinde bulunan dönüştürme aracı kullanarak oluşturulan yüzey topografyası konuma ayarlayın.</li>
	<li>Floresan tomografi (ZAMMINI) 3D imar gidin ve seçin sekmesini analiz için dahil edilmesi, resim türü normalleştirilmiş iletim floresan (NTF) verimlilik için Başlat'ı tıklatın için görüntüleri analiz.</li>
	<li>Tümünü Seç denetleyin ve veri Önizleme sekmesinde yeniden.</li>
	<li>Floresans miktar için faiz bölge (ROI) araçlar için yatırım Getirisi küp faiz organ için ekleme ve küp boyutu faiz organı kapsayacak şekilde ayarlamak gidin. Tıkırtı üstünde 3D ROIs ölçmek.</li>
	<li>Yatırım Getirisi ölçümleri penceresinde, 3D ROI ölçümleri için et, kaynak pmolM-1cm-1voxels ve ölçüm birimine için veri türü seçin.</li>
	<li>Kaydetmek ve/veya ZAMMINI 3D imar analizi sonucu bir şekil veya veri dosyasına verir.</li>
</ol>6. miktar CFU bakteri
<ol><li>Fareler 0.1 mL Fentobarbital sodyum (390 mg/mL) mayi enjeksiyonu ile ötenazi.</li>
	<li>İçin pedal refleks ayak refleks tepki yok olduğundan emin olmak için fare yastıkları sıkarak kontrol edin.</li>
	<li>Steril forseps ve makas kullanarak fare akciğer dokusundan explant. 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) akciğer dokusunda lunaparkçı.</li>
	<li>Akciğer homogenate 10 kat seri dilutions steril 1 x PBS içinde olun.</li>
	<li>Kaplama, 20 µL her ilgili seyreltme üç aliquots agar plaka üzerinde spot.</li>
	<li>Plakayı Bakteriyel büyüme için bir kuluçka-37 ° C ve monitör kuluçkaya.</li>
	<li>Koloniler halinde her noktaya kuluçka süre sonra ve CFU hızlı sayısı / mL cilt ve seyreltme için düzeltme tarafından aşağıdaki denklemi kullanarak: CFU / mL (C/V) = M x Nerede C koloni sayıları başına nokta, V = hacim = her plaka (mL) ve M aşı Örnek çarpım faktörü (devrik değerlerin kullanılan seyreltme) =. Not: 0.002 mL Numune dilüsyonu, 10-4, örnek hacmi için bir noktada 11 koloniler sayılır Eğer denklemi kullanarak koloni sayısı olarak hesaplanır. (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol><li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Official+American+thoracic+society%2Finfectious+diseases+society+of+America%2F+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines%3A+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Ch%22%5BJournal%5D)">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li>
<li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+transmission%2C+diagnosis%2C+and+management+of+multidrug-resistant%2C+extensively+drug-resistant%2C+and+incurable+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Resp+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li>
<li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li>
<li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li>
<li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li>
<li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+D%22%5BJournal%5D)">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li>
<li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+%CE%B2-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li>
<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).</li>
<li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).</li>
<li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/8565/1/Multi-scale-fluorescence-imaging-of-bacterial-infections-in-animal-models/10.1117/12.2004690.short">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).</li>
<li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.896553">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).</li>
<li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li>
<li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li>
<li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li>
<li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).</li>
<li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tuberculosis+with+endogenous+%CE%B2-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li>
<li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li>
<li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest%3A+characteristic+findings+and+role+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li>
<li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography%2C+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li>
<li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li>
<li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li>
<li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice%2C+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).</li>
<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/9715/1/Whole-animal-imaging-of-bacterial-infection-using-endoscopic-excitation-of/10.1117/12.2213820.short">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150(2016).</li>
<li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40475-015-0043-1">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+in+vivo%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li>
<li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li>
<li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717(2017).</li>
<li>2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).</li>
<li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Covalent+Reporter+of+%CE%B2-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li>
<li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+%CE%B2-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li>
<li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion%3A+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT%5BTitle%5D)+AND+%22BRIT+J+RADIOL%22%5BJournal%5D)">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li>
<li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li>
</ol>

Hakem gibi görüntüleme teknikleri kullanırken üretimi, sağlam ve tutarlı veriler izin anahtar stratejiler vardır. Optik görüntüleme her yöne yayılan ışık yakalamak zor olduğundan hangi penetrasyon, derinliği etkileyebilir dokularda dağınık ışık üretir. Kullanım bir yakın kızıl ötesi fluorophore (Nur) substrat 700-900 nm Querange içinde bir uyarma ve emisyon dalga boyuna sahip Imaging REF için floresan sinyal minimal absorpsiyonu memeli dokular ile kolaylaştırır. Özel tasarlanmış substrat bir nur fluorophore, IRDye 800Cw bir içki için bağlama tarafından inşa edilmiş IRDye QC-1, Floresans rezonans enerji transferi tabanlı Şoklama izin laktam halkası. IRDye mükemmel doku penetrasyonu ve özellikleri saçılma ışık ve memeliler36üzerinde belirgin herhangi bir zararlı etkisi yok, kan ve organları oluşmuş 24 h floresan işaretli sinyal önemli ölçüde artar 4 h sonra başlayan substrat yönetim, maksimal ulaşan 6 h sonra Yönetim düzeyleri.
Bakteriyel enfeksiyon doz, bulaşıcı doz ve substrat İdaresi hem de zaman-mesaj enfeksiyon pilot çalışmalar gerçekleştirerek Imaging Puan şekli üzerinde büyük, karmaşık, deney başlamadan önce standart. Pilot çalışmalar büyük ölçüde zaman ve maliyet Standart bir prosedür anahtar deney yaparken önce optimize edilebilir çünkü çok sayıda hayvan Imaging küçültebilirsiniz. Bakteriyel yükler ve organ/dokularda tüm vücut görüntülemesi trans-aydınlatma ve ex vivo akciğer görüntüleme sinyalin kaynağını doğrulamak ve korelasyon kalitesini belirlemek için epi-aydınlatma kullanarak kullanarak aşağıdaki ilgi tespit edilmelidir Bakteriyel numaraları ile mevcut8. Pilot çalışmalar algılama eşiğinin, dinamik alan tekniği yanı sıra görüntüleme için en iyi deneysel koşullar belirlenmesi görmemizi sağlar.
Birincil olarak Imaging REF kullanmanın avantajları diğer floresan ve kollarındaki stratejileri için karşılaştırılır, yüksek hassasiyet ve doğal M. tuberculosis resim yeteneği suşları. Imaging REF catalytically sağlam enzim tüm M. tuberculosis klinik yalıtır ve Tüberküloz Kompleks suşları korunmuş BlaC kullanır. Imaging REF büyük duyarlılık hızlı katalitik oranı BlaC birlikte ile saklama cleaved floresan ürünün ana hücre kaynaklanmaktadır. Belgili tanımlık substrate enfekte hücreleri ve doku içinde sinyal neredeyse sınırsız birikmesi debisi olduğu sürece sürekli artar sinyal. Imaging REF artan bu duyarlılığını görüntüleme alternatif yaklaşımlar için karşılaştırıldığında M. tuberculosis belirli algılama her iki vitro sağlar ve in vivo8,23,24, 29.
Imaging REF-ebilmek var olmak kullanılmış için bakteriyel algılama genetik değişiklik herhangi bir enfeksiyon, her iki laboratuvar hayvanları8,37 veya insan klinik malzeme29,38 için doğrudan uygulama etkinleştirme olmadan . REF algılayıp fluorogenic yüzeylerde proteaz, kinaz, ureases ve β-galactosidases gibi BlaC dışında birçok enzimatik hedefleri için geliştirilen bu yana patojenler39,40, geniş bir dizi görüntü için kullanılabilir. Ancak, dikkatli düşünce emin olmak için hedefe verilmesi gerektiğini bu görüntüleme için en uygun özellikleri görüntüler. BlaC iyi model enzim bu stratejinin başarılı uygulama sağlayacak özellikleri için temsil eder. Imaging REF hemen bir eşleştirmeyi bakteri yükü akciğerlerde mevcut enfeksiyonlar sırasında ilerleme çalışmada, tüberküloz Patogenez, bakteriyel numaraları belirlenmesi normalde üç ila altı hafta gerektirdiğinden, fakat bile daha büyük ölçüde hızlandıran sağlar Bu yaklaşım çok şey kazandıracak hızlı büyüyen organizmalar zaman. REF tüberküloz, hastaların41,42Nodüler lezyonlar tanısında önemli bir sorun gelen karsinomlar ayırımcılık için de kullanılabilir. REF translasyonel tüberküloz görüntüleme hızlandırmak için yeni bir araç olarak hizmet vermektedir ve hatta potansiyel olarak tedavi edici sonuçlar hızlı tahmin izin insanlar için uygulanabilir.

M. tuberculosis yavaş büyüme oranı büyük bir barikat tüberküloz1,2,3hızlı tanı olduğunu. Tanı sonuçları üretmek için hafta sürer kültür dayalı iken, acid-fast smear tanılama sınırlamalar4 çocuklar5 ve insan immün yetmezlik virüsü6,7ile koenfekte Hastalar vardır. Optik görüntüleme teknolojileri son zamanlarda geleneksel tanı yöntemleri tüberküloz8,9için alternatif olarak kabul edilmiştir. Floresan ve bioluminescence optik, gerçek zamanlı10,-11,12,13,14Canlı hayvanlarda M. tuberculosis görüntü için kullanılabilir, 15,16,17,18,19. Optik görüntüleme bir enfeksiyon M. tuberculosis20,21,22ile hızlı ve spesifik bir değerlendirmenin yararı vardır.
M. tuberculosis optik görüntüleme ürün kodu kullanarak canlı farelerde ayrıntılarını anahat. Bu yöntem çok özel ve hassas23,24 ve, daha az görme duyusuyla ilgili diğer yöntemlere benzer diğer yöntemler tüberküloz (TB)25Bilgisayarlı Tomografi (CT)26, manyetik dahil olmak üzere, görüntüleme daha pahalı rezonans görüntüleme (MRG)27ve F-florodeoksiglikoz Pozitron emisyon tomografi/CT (F-FDG PET/BT)28. REF bir floresan ürün8,29üreten bir bakteriyel enzim tarafından bölünme üzerine özel floresan veya kollarındaki yüzeylerde kullanır. Bu nedenle, bir rekombinant Mikobakteriyel muhabir zorlanma30,31gerektirmeyen bir avantaja sahiptir. Açıklanan FRET substrat, bir fluorochrome ve BlaC (β-lactamase), doğal olarak yapısal Tüberküloz Kompleks Mycobacterium8tarafından, ifade tarafından hidrolize bir β-laktam halkası ile bağlı bir içki oluşur 32. bakteri doğrudan sinyal nedeniyle birçok büyüklük ve hassas M. tuberculosistespiti tarafından amplifikasyon sağlar REF katalitik aktivitesi oluşturmak.
Bu çalışmada kullanılan REF substrat canlı hayvan mükemmel doku penetrasyonu vardır ve arka plan nedeniyle, uzun dalga boyu düşük. Bu uzun dalga boyu substrat ile yaklaşık 100 M. tuberculosis için algılama eşik ulaşmak mümkündür birimleri (CFU) vitro oluşturan colony ve < 1000 CFU fareler vivo içinde (bütün hayvan)8, akciğerlerde 33. REF bir tanı aracı balgam, klinik malzemeler için ve hatta doğrudan onun yüksek duyarlılık ve özgüllük nedeniyle mikro endoskopik sistemleri16,32,33,34 olan hastalarda kullanılabilir. Tüm suşların mevcut algılama için doğal olarak üretilen bakteriyel enzim, BlaC, kullandığı için REF herhangi bir tüberküloz klinik zorlanma için uygulanabilir. Bu özellikleri önceden klinik tüberküloz araştırmasında değerli bir araç genel olarak tedavi kolaylaştırmak için Imaging REF ve aşı değerlendirme aynı zamanda Patogenez analizini yapmak, ama da sonuçta tüberküloz tanısında uygulanabilir hastalar.

<table><tbody><tr><td>İzofluran</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Özel sentezlenmiş</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus çözeltisi</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook suyu</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook zenginleştirme</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Odası IVIS Spektrumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 gazlı Anestezi Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Görüntüleme yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf burun konileri</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tüberküloz suş CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dişi BALB/C fareleri, 5-7 hafta</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim floresans farelerde görüntüleme

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Muhabir enzim floresan (REF) için mevcut faiz hedef organizmalarda yansıması oluşturma veya floresan veya bioluminescence tarafından algılamayı enzimler belirli yüzeylerde kullanır. Biz BlaC, yapısal tüm M. tuberculosis suşlarının tarafından ifade edilen bir enzim kullanmaktadır. REF bakterilerin akciğerlerde virüslü fareleri hızlı miktar sağlar. Fareler aynı grup büyük ölçüde maliyetlerini azaltarak, bakteri daha hızlı numaralandırma, roman gözlemler ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde izin ve istatistiksel güç, grup başına daha fazla hayvan kolayca korunur bu yana artan birçok zaman noktalarda, yansıma . REF son derece hassas BlaC enzimatik muhabir katalitik doğası gereği ve belirli özel flourescence rezonans enerji transferi (FRET) veya fluorogenic yüzeylerde kullanılan nedeniyle. REF rekombinant suşları, normal ev sahibi-patojen etkileşimleri sağlanması gerektirmez. M. tuberculosis enfeksiyonu ile 800 maksimal emisyon FRET substrat kullanarak görüntüleme tarif nm. Dalga boyu substrat memelilerde hassas derin doku görüntüleme sağlar. M. tuberculosis, anestezi farelerin, REF substrat ve optik görüntüleme yönetimi ile fareler aerosol enfeksiyon açıklayacağım. Bu yöntem, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve M. tuberculosishedefleme antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmek için başarıyla uygulandı.

REF görüntüleme bulaşmamış kontrol fare ile birlikte M. tuberculosis ile enfekte farelerin şekil 1içindeAgösterilir. Virüslü fareler üretilen bir anlamlı (P = 0.0057) akciğer 6 hafta sonrası enfeksiyon sonrasında substrat yönetim denetimi ile karşılaştırıldığında, daha yüksek Floresans sinyal. M. tuberculosis REF kullanarak karşı tedavi edici etkinliği çalışma için tipik süresi ders hafta görüntüleme 1, 2, 4, 6, 15, 24 sonrası enfeksiyon. Floresan yoğunluğu epi-aydınlatma akciğer dokusu (şekil 1B) kullanarak sayılabilir. Hafta 6 virüslü fareleri akciğerlerde için hafta 2 sinyal sürekli artan ürün kodu başarıyla M. tuberculosis içinde vivotespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir. Bir damla daha sonraki bir zamanda noktada (şekil 1B) denetim farelerin arka plan sinyalinde vücut artış atfedilen olabilir kütlesi ve hacmi fareler böylece uyarma dalga boyu penetrasyon azaltarak 6 haftalık bir süre içinde. M. tuberculosis ile enfekte farelerde Floresans kaynaklarının 3D ZAMMINI imar Şekil 2içindeAtemsil edilir. Görüntü sıralarını fare aynı uyarma ve emisyon filtreleri bir dizi kullanarak birden çok trans-aydınlatma noktalarda elde edilir. Bu görüntü sıralarını daha sonra floresan kaynak paketinin içinde hayvan konu için 3D ZAMMINI yeniden inşası için kullanılır. Resim 2 A-D fare tomografi akciğer organ kaydı ile farklı yönlere (koronal, sagittal ve transaxial) gösterir. NTF verimliliği imar kalite Resim 2'Etemsil kontrol etmek için eşleştirir. NTF arka plan ışık sızıntısı ilave bir görüntü ile trans-aydınlatma görüntülerden çıkararak nötr yoğunluk filtresi ile yakalanan sağlar. Belirli uyarma filtre ile (Şekil 2E ölçülen) alınan görüntü aynı emisyon filtresi ve bir açık uyarma filtresi (vermek içinŞekil 2E - simüle) ile ölçülen iletim görüntü için normalleştirilmiş Yalnız substrat tarafından üretilen sinyal. Benzer ölçülen ve NTF verimlilik profili hem yatay (Şekil 2F) ve dikey (Şekil 2G) profilleri neredeyse % 0 yüzde hata (Şekil 2E-% hata) ile simüle kaliteli 3D imar kanıtı azaltılmış eserler ve geliştirilmiş sinyal Yerelleştirme ve duyarlılık ile sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Resim 1 . M. tuberculosis ile REF. görüntüleme (a) vivo görüntüleme bulaşmamış ve M. tuberculosis ile 2, 4 ve 6 hafta sonrası enfeksiyon enfekte farelerin. Renk çubuğunu fotonlar cm2 başına saniyede floresan sinyalin yoğunluğunu (sarı) düşük yüksek (kırmızı) temsil eder. (B) floresan yoğunluğu M. tuberculosisile enfekte fareler gelen miktar. Her iki denetim (siyah) floresan değer verir ve virüslü (kırmızı) her zaman için standart hata ile birlikte gösterilir. Sonuçları önemi öğrenciler ttarafından belirlendi-testi, p değerleri &lt; 0,05 önemli kabul. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Resim 2 . M. tuberculosisile enfekte farelerde Floresans kaynaklarının 3D ZAMMINI yeniden yapılanma. Fare tomografi farklı yönlere temsil; A) Koronal, B) sagittal ve C) transaxial D) akciğer organ kaydı ile. Faiz (ROI) 3D bölgenin kaynak ölçümleri için akciğer kırmızı bir küp olarak temsil edilir. (E) NTF verimliliği ölçülen ve yeniden yapılanma kalite kontrol etmek için benzetimli eşleştirir. 3D yeniden yapılanma (benzer ölçülen ve simüle NTF verimliliği) iyi kalite sağlayan ölçülü ve simüle NTF verimliliği profil karşılaştırıldı. F) yatay ve G) dikey sinyal temsil eden ölçülen (mavi) profilleri ve (kırmızı) NTF verimi eğrisi simüle. Yatay ve dikey Kırmızı çubuklar kaynak konumunu gösterir. Renk çubuğunu fotonlar cm2 başına saniyede floresan sinyalin yoğunluğunu (mavi) düşük yüksek (kırmızı) temsil eder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Bu raportör enzim floresan görüntüleme prosedürünün genel amacı, patogenez, terapötikler ve aşı araştırmaları için klinik öncesi hayvan modellerinde mikobakteri tüberkülozunun hassas ve spesifik tespitini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, bakteri türlerinin virülans mekanizmalarının yanı sıra terapötikler oluşturma ve aşıları anlama da dahil olmak üzere tüberküloz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu tekniğin ana avantajı, aynı hayvan grubunun birden fazla zaman noktasında görüntülenmesine izin vermesidir.Bu, maliyeti büyük ölçüde azaltır, konakçı patojen etkileşimlerini incelememize izin verir ve aynı anda daha fazla sayıda hayvanın bakımı kolayca yapılabildiği için istatistiksel gücü artırır. Başlamak için, MOADCTW ortamında 37 santigrat derecede herhangi bir M.tuberculosis bakterisini 600 nanometrede ölçülen 0,5'lik bir optik yoğunluğa kadar büyütün. Enfeksiyöz materyallerin manipülasyonunu içeren tüm prosedürler, biyogüvenlik kabinleri veya diğer onaylanmış fiziksel muhafaza cihazları içinde gerçekleştirilmelidir.Hazır olduktan sonra, aynı ortamda kültürün bir ila 10 seyreltmesinden oluşan bir dizi yapın. Ardından, CFU'nun doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için seyreltmeleri seçici 7H11 plakaları üzerine üçlü olarak yerleştirin. Plakaları 37 santigrat derecede dört hafta boyunca veya CFU'yu belirlemek için koloniler doğru bir şekilde sayılana kadar inkübe edin.Bir aşı kurmadan önce, her zaman biyogüvenlik başlığının dakikada 50 litre hava akıttığından emin olun. 90 fareye kadar enfekte edebilecek bir aşı hazırlamak için, istenen CFU'yu 15 mililitrelik bir şahin tüpünde ölçün. Tipik olarak 10.000 ila 1 milyon CFU kullanılır.Sonra bakterileri topaklayın. Daha sonra bakterileri 10 mililitre tuzlu su ile bir kez yıkayın. Sonra onları 15 milileter tuzlu su içinde askıya alın.Daha sonra bir biyogüvenlik kabininde, aşıyı bir nebülizöre takılabilen bir cam kavanoza yükleyin. Daha sonra nebulizatör ünitesini bağlayın ve dikey paslanmaz çelik boruyu, alt uç süspansiyonun menisküsünün yaklaşık çeyrek inç altında olacak şekilde ayarlayın. Şimdi düzeneği sızdırmaz bir taşıma kabında aşılama odasına aktarın.Devam etmek için, ağırlığı bilinen hayvanları güçlendirilmiş aşılama odasına yükleyin. Hazne 90 fareye kadar sığabilir. Ardından kapıdaki tüm mandalları kapatın.Ardından, nebulizatörü çelik bir kelepçe kullanarak bağlayın. Ardından haznedeki başlat düğmesine basın. Ve hava akış hızını dakikada üç ila beş litre arasında ayarlayın.Basınçlı hava, inç kare başına yaklaşık 22 ila 26 pound arasında akacaktır ve daha da önemlisi, odadaki aşı sisini görmek mümkün olmalıdır. 15 dakika sonra, kontrol panelinin ön tarafında kırmızı bir ışık belirecek ve çalışmanın sona erdiğini sesli bir sinyal verecektir. Ardından zamanlayıcıları sıfırlamak için sıfırlama düğmesine basın.Vakumu serbest bırakmak için haznenin kapısındaki küçük kırmızı düğmeye basın. Ardından oda kapısını açın ve fareleri ev kafeslerine geri koyun. İleriye dönük olarak, hayvanları muhafaza odasında tutun.Daha sonra kavanozu ve taşıma kabını biyogüvenlik kabinine geri koyun. Orada, kalan bakteri süspansiyonunu belirlenmiş bir atık kabına atın. Daha sonra kullanılmış nebulizatör kavanozunu bir biyolojik tehlike torbasına yerleştirin ve torbayı otoklava taşınmak üzere kapatın.Hazneyi temizlemek için iç yüzeylere tamponlu fenol ve% 70 etanol püskürtün. Bu çözeltilerin bu yüzeylerde 10 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Sonra onları iyice silin.Tüm mendilleri biyolojik tehlike çöp kutusuna atın. Ardından çöpü, atık kabını ve kullanılmış nebulizatör kavanozlarını otoklavlayın. Hayvanları görüntüleme odasına aktarın.Orada, bir hayvanı metin protokolüne göre uyuşturun ve intraperitoneal enjeksiyon yoluyla kontrast substrat ile enjekte edin. Görüntüleme sistemleri yazılımında, sistemi başlatın ve sıcaklık çubuğu yeşile döndüğünde devam edin. Sistemi başlattıktan sonra, fareyi görüntüleme odasına yerleştirin.Burun deliklerinin burun konisinin içinde olduğundan emin olun, böylece görüntüleme sırasında anestezi alır. Şimdi bilgisayara geri dönün. Edinme kontrol panelinde, tüm hayvan görselleştirmesi için floresan, transillüminasyon veya akciğer dokularını görüntülemek için epi-aydınlatmayı seçin.Tek bir fare için, görüş alanını B ve lamba seviyesini yüksek olarak ayarlayın. Pozlama için otomatik süre, orta gruplama ve F/Stop için iki veya üç kullanın. Ardından uyarma filtresini 745 nanometreye ve emisyon filtrelerini 780 ila 840 nanometreye ayarlayın.Ardından, dizi kurulumuna gidin ve ilgilendiğiniz alanda dokuz ila 12 transillüminasyon noktası seçin. Şimdi görüntüleri toplamak için edin'e basın. Görüntü analizi metin protokolünde ele alınmıştır.Enfeksiyonun derecesini analiz etmek için, fareyi sodyum pentobarbital kullanarak ötenazi yapın. Hayvanın ötenazi yapıldığından emin olmak için bir pedal refleksi olup olmadığını kontrol ettiğinizden emin olun. Ve sonra standart bir diseksiyon kullanarak akciğerleri çıkarın.Daha sonra akciğer dokusunu bir mililitre PBS'de homojenize edin. Daha sonra PBS kullanarak homojeninin on kat seri seyreltmesini yapın. Seyreltilmiş homojeni üç kopya halinde tabaklayın ve koloniler sayılana kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.Ardından enfeksiyonun ciddiyetini ölçmek için CFU skorunu kullanın. Fareler tarif edildiği gibi tedavi edildi. M. tuberculosis'in ilerlemesini görüntülemek için bir REF substratı kullanıldı.Floresan, transillüminasyon kullanılarak ölçüldü. Ve enfekte farelerde ikinci haftadan altıncı haftaya yükseldi. Kontrol farelerinde sinyaldeki hafif düşüş, altı haftalık süre boyunca vücut kütlesi ve hacmindeki artışa bağlanabilir.Floresan kaynaklarının 3D FLIT rekonstrüksiyonu, aynı uyarma ve bir dizi emisyon filtresi kullanılarak birden fazla transillüminasyon noktasından yapılmıştır. Rekonstrüksiyon kalitesini kontrol etmek için NTF verimlilik haritaları çıkarıldı. Spesifik uyarma filtresinden alınan görüntü, aynı emisyon filtresi ve açık bir uyarma filtresi ile yapılan iletim görüntüsüne normalize edildi.Bu, tek başına alt tabaka tarafından üretilen bir sinyal sağlar. Rekonstrüksiyonda neredeyse hiç hata yoktu. Verilerin NTF etkinliğinin hem yatay hem de dikey görünümde incelenmesi sıkı bir korelasyon göstermiştir.Bu nedenle, 3D rekonstrüksiyonda az sayıda artefakt, gelişmiş sinyal lokalizasyonu ve diğer yöntemlere göre geliştirilmiş hassasiyet vardı. Bu teknik, tüberküloz alanındaki araştırmacıların mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaçların terapötik etkinliklerini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, REF substratı kullanılarak takip optik görüntüleme ile mycobacterium tuberculosis ile aerosol yolu yoluyla farelerin nasıl enfekte edileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Kaynak: Behera, R. K. ve diğerleri. Enfekte dokularda bakteriyel gen düzenlemesini incelemek için floresans tabanlı bir yöntem. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, enfekte fare böbrek dokusunun hazırlanması, DNA'nın boyalanması ve bakteriyel gen ekspresyonunun çift floresan muhabirler kullanılarak tespit edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Kırmızı tüm bakterileri işaretlerken, yeşil enfeksiyona duyarlı hücreleri vurgular.

Fare böbrek dokusunda bakteriyel kolonizasyonun floresans görüntülemesi

Bu video, Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun in vivo tespiti için raportör enzim floresan (REF) görüntülemeyi göstermektedir. Enfekte farelere intraperitoneal olarak REF görüntüleme için bir substrat enjekte edilir. Bakteriyel β-laktamaz enzimi tarafından hidrolize edildikten sonra, substrat floresan yayar ve bunun tespiti enfeksiyonun değerlendirilmesine yardımcı olur.

Bakteriyel Enfeksiyonun İn Vivo Takibi için Raportör Enzim Floresan Görüntüleme

Bu videoda, rekombinant lusiferaz ve floresan protein eksprese eden bi-raportör Influenza A virüsü kullanılarak fare modellerinde viral enfeksiyonları izlemek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem, hem in vivo hem de ex vivo çalışmalara olanak tanıyarak araştırmacıların viral dinamikler ve müdahalelerin etkileri hakkında bilgi edinmelerini sağlar.

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu...

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

Staphylococcus aureus bir biyolojik olarak ışık veren mühendislik suşu kullanılarak, ortopedik protez enfeksiyonun bir fare modelinde, optik ve uCT görüntüleme birlikte, invaziv olmayan uzunlamasına ve bakteriyel enfeksiyonun dinamikleri, hem de karşılık gelen enflamatuar yanıtı ve anatomik değişiklikleri izlemek için bir kapasite sağlamadığı Kemik.

Kombine<em&gt; In vivo</em&gt; Optik ve uCT Görüntüleme Farelerde bir Ortopedik İmplant Enfeksiyon Enfeksiyon, Enflamasyon ve Kemik Anatomisi Monitör

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Öğrenin farelerde Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun muhabir enzim floresansı ile optik görüntüleme yöntemini. Bu teknik, patogenez ve aşı araştırmalarında duyarlı tespit sağlar.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Daha fazla video keşfet