Name: Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Öğrenin, Drosophila oositlerinde meiyotik kol uyumunu FISH probu üreterek ve floresan görüntüleme yaparak incelemeyi. Bu yöntem, kromozom ayrışması mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH Grant Sharon E. Bickel için ödül GM59354 tarafından desteklenmiştir. Huy s. Nguyen floresan kol probları, Ann Lavanway confocal mikroskobu ile ilgili yardım ve J. Emiliano Reed teknik yardım için oluşturmak için protokol gelişmekte olan yardım için teşekkür. Ayrıca çok sayıda meslektaşları için yararlı tartışmalar ve tavsiye Drosophila toplumda teşekkür ediyoruz.

<ol><li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3536341/">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li>
<li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li>
<li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li>
<li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Down+Syndrome+Project%3A+design+and+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li>
<li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710(2014).</li>
<li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
<li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li>
<li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2666492/">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li>
<li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li>
<li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).</li>
<li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08608808">Method Cell Biol</a>. 53, Academic Press. 187-233 (1998).</li>
<li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Securin%2C+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li>
<li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li>
<li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li>
<li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Balık kullanımını değerlendirmek için kol uyum içinde prometafaz durumunu ben ve metafaz probları ben Drosophila yumurta Drosophila mayoz alanında önemli bir gelişme olduğunu. Tarihsel olarak, Drosophila araştırmacılar erken kol uyum olgun yumurta11,18,19kaybı anlaması için genetik testler için sınırlı olmuştur. Şimdi, burada sunulan yöntemleri ile doğrudan balık kullanarak kol uyum durumunu denetlesin...

Mitoz ve mayoz sırasında kromozomların uygun segregasyon gerektirir bu kardeş Kromatit uyum olmak kurulan, muhafaza ve bir eşgüdümlü moda1,2' serbest bırakmak. Uyum S aşamasında kurulur ve kız kardeşi tutun fiziksel bağlantıları oluşturan cohesin tarafından karmaşık, aracılık ettiği chromatids birlikte. Mayoz, uyum bir crossover için distal, aynı zamanda rekombinant homologs bir arada tutmak için çalışır ve bu fiziksel ilişki uygun yönlendirmeyi sağlamaya yardımcı olur, metafaz üzerinde bivalent (şekil 1)3,4, iğ 5. Serbest bırakmak-in kol uyum anafaz, ters iğ Polonyalılar için ayırmak homologs sağlar. Ancak, kol uyum ise zamanından önce kayıp rekombinant homologs onların fiziksel bağlantı kesilirse, rastgele, hangi aneuploid gametler (şekil 1) neden olabilir ayırmak.
İnsan yumurta, kromozom segregasyon hataları Düşükler ve doğum kusurları, Down sendromu6gibi önde gelen neden olan ve onların insidansı katlanarak maternal yaş7ile artar. Kardeş Kromatit uyum içinde fetal yumurta kurulur ve segregasyonun rekombinasyon doğumdan önce tamamlanır. Yumurta sonra tutuklama orta profaz ben yumurtlama kadar ve bu tutuklama sırasında rekombinant homologs devam eden fiziksel Derneği kardeş Kromatit uyum dayanır. Bu nedenle, mayoz ve normal gebelik sonuçları sırasında doğru segregasyon gerektirir uyum 50 yıl kadar olduğu gibi kalır.
Uyum insan yumurta uzun süreli segregasyonun tutuklanması sırasında erken kaybı maternal yaş etkisi katkıda bulunmak için önerilen ve kanıt birkaç satırlık bu hipotez8,9çekmek için. Ancak, insan yumurta segregasyonun uyum eğitim sorunları göz önüne alındığında, bu olayın bizim anlayış çok fazla model organizmalar5,10,11,12, kullanımına dayanıyor 13,14,15.
Drosophila melanogaster yumurta segregasyonun uyum ve kromozom segregasyon çalışma için birçok avantaj sunar. Basit bir genetik tahlil bir döl aneuploid gamet kurtarmak ve Xkalitesini ölçmek sağlar-kromozom segregasyon büyük ölçekli11,16,17. Ayrıca, bir de ben kol uyum11,18, Prematüre kaybı ile tutarlı bir fenotip mayoz sırasında rekombinant homologs missegregate çünkü kromozom segregasyon hataları ortaya olup olmadığını belirlemek 19. Drosophila yumurta segregasyonun uyum durumunu gözlem yeri de Floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak doğrudan. Her ne kadar floresan oligonucleotides bu tekrarlayan uydu serileri melezlemek için bir on yıl içinde pericentromeric uyum olgun Drosophila yumurta4,20, kol analizini izlemek için kullanılmış uyum çok daha zor olmuştur. Görselleştirme kol uyum devleti tek kopya büyük bir bölgeye yayılan bir sonda dizileri ve kol uyum yok olduğunda görünür sinyaller bireysel kız kardeşi için chromatids neden yeterince parlak gerektirir. Buna ek olarak, oosit fiksasyon koşulları ve etiketli DNA'lar boyutunu penetrasyon21 büyük olgun Drosophila oosit (200 µm geniş 500 µm uzun tarafından) içine kolaylaştırmak gerekir. Son zamanlarda, bir kol başarıyla yoklamaydı kullanılan görselleştirmek için Drosophila oosit chromatids anafaz sırasında ben, ama yazarlar onlar bir sinyal içinde prometafaz-ebil değil bulmak olduğunu ifade veya metafaz yumurta22tutuklandı. Burada Xüretimi için detaylı bir protokol sağlar-kromozom kol balık probları ve bizi kardeş Prematüre kaybı için Kromatit uyum içinde prometafaz tahlil için ben ve metafaz sağladı oosit hazırlanması koşulları ben yumurta. Bize segregasyonun uyum bakımı için gerekli olan gen ürünleri tanımlamak etkinleştirdiyseniz, bu teknikler, kardeşi için tahlil başkalarına sağlayacak Kromatit uyum kusurları farklı genotip olgun Drosophila yumurta içinde.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kitler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Midi Hazırlık kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Hazırlık BAC klon DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Komple Tüm Genom Amplifikasyonu (WGA) Kiti</td><td>Sigma</td><td>WGA2</td><td>BAC klon DNA'sını Amplifiye</td></tr><tr><td>edin ARES Alexa Fluor 647 DNA etiketleme kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Etiket BAC klon DNA</td></tr><tr><td>PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>BAC klon DNA'sının etiketlenmesinin ardından konjuge olmayan boyayı çıkarın</td></tr><<tr><td>güçlü>Ad<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kimyasallar ve Çözeltiler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Not: </güçlü>Tüm çözeltiler steril ultra saf su kullanılarak hazırlanır ve otoklav veya filtre sterilizasyonu ile sterilize edilmelidir.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>%10 stok hazırlayın Dondurma alikotları</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)</td><td>Invitrojen</td><td>D1306</td><td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin. 100 & mikro hazırlayın; % 100 etanolde g / ml stoğu, -20 ° C'de alikotlarda saklayın 1 & mikro hazırlayın; Kullanmadan önce 2X SSCT'de g / ml çözeltisi.</td></tr><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Driyerit</td><td>Kurutucu Şirketi</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>İnvitrojen</td><td>15508-013</td><td>10 mM stok</td></tr><tr><td>dTTP (10 ve mikro; mol, 100 ve mikro; l)</td> <td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>1 mM stok</td></tr><tr><td>hazırlayın EDTA (Disodyum etilendiamin tetraasetik asit)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>250 mM stok</td></tr><tr><td>hazırlayın %100 etanol (moleküler dereceli, 200 kanıt)</td> <td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Saf)</td> <td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Etilenbis (oksietilennitrilo) tetraasetik asit)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>%16 formaldehit</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma kullanın</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü > aşınma uygun koruma</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4<</td><td>güçlü>Toksik: < / güçlü> uygun koruma kullanın.</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin.</td></tr><tr><td>Hidroksilamin</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>3 M stok hazırlayın</td></tr><tr><td>4.9 M Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H 2 O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO 4 &Yuml; 2H 2 O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin (0.1mg / ml)</td> <td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>3M stoğu</td></tr><tr><td>hazırlayın Sodyum kakodilat</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü > uygun koruma giyin. 400mM stok hazırlayın</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>%10 Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Yüzey Aktif-Amper</td></tr><tr><td>%10 Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Yüzey Aktif-Amper</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Not: Tüm solüsyonlar steril ultra saf su kullanılarak hazırlanır ve otoklav veya filtre sterilizasyonu ile sterilize edilmelidir.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td></tr><tr><td>20X SSC (Salin Sodyum Sitrat)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM sodyum sitrat</td></tr><tr><td>2X kakodilat fiks çözeltisi</td><td></td><td></td><td><güçlü>Toksik: < / güçlü> uygun koruma kullanın. 200 mM sodyum kakodilat, 200 mM sükroz, 80 mM sodyum asetat, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1.1X Hibridizasyon tamponu</td><td></td><td></td><td>3.3X SSC, %55 formamid, %11 dekstran sülfat</td></tr><tr><td>Düzeltme çözeltisi</td><td></td><td></td><td><güçlü>Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin. % 4 formaldehit, 1X kakodilat fiksasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS,% 0.5 BSA,% 0.1 Trisyon X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS,% 1 Trisyon X-100</td></tr><tr><td>Ekstraksiyon tamponu (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS,% 1 Trisyon X-100, 100 & mikro; g / mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC,% 0.1 Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT +% 20 formamid</td><td></td><td></td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin. 2X SSC, %0.1 Tween 20, %20 formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + %40 formamid</td><td></td><td></td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin. 2X SSC, %0.1 Tween 20, %40 formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + %50 formamid</td><td></td><td></td><td>< güçlü > Toksik: < / güçlü> uygun koruma giyin. 2X SSC,% 0.1 Tween 20,% 50 formamid</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>HaeIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NEB enzimleri ile birlikte gelir</td></tr><tr><td>10X NEB tamponu #2</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Restriksiyon enzimi sindirim tamponu. NEB enzimleri ile birlikte gelir</td></tr><tr><td>Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) 400 U/&mikro; l</td><td>Roche / Sigma</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td>TdT tamponu</td><td>Roche / Sigma</td><td></td><td>TdT enzimi</td></tr><tr><td>Kobalt klorür</td><td>Roche / Sigma</td><td></td> <td>< güçlü > Toksik: < / güçlü > uygun koruma sağlar. TdT enzimi</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg / mL)</td> ile birlikte gelir <td>Termo-Bilimsel</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cytology Tools vb.< / strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td> <td># 5 INOX, Biyoloji</td></tr><tr><td>9" Tek kullanımlık cam Pasteur pipetleri</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td>Sterilize etmek için otoklav</td></tr><tr><td>Sığ cam diseksiyon kabı</td><td></td><td></td><td>Özel yapım</td></tr><tr><td>Derin kuyu tabağı (3 kuyulu)</td><td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>Derin kuyu bulaşıklarını kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Buzlu cam slaytlar, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar, 3 x 1 inç, 1 mm kalınlık</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 10 x 10 mm, No. 1.5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten iğne</td><td></td><td></td><td>ev yapımı</td></tr><tr><td>Prolong GOLD montaj ortamı</td><td>Moleküler Problar</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Teneke kutuda basınçlı hava</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, spektrofotometre</td><td>Termo-Bilimsel</td><td></td><td>mikro hacimli spektrofotometre</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Çeşitli Oda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sıcaklığında masa üstü mikrofüj</td><td>4</td> &° C'de Çeşitli <td></td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü mikrofüj; C</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını veya döndürücülü inkübatör</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutatör</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSi lazer tarama konfoal</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X yağ Planı Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr> <tr><td><güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket < / güçlü></td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Sarf malzemeleri vb.</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrofüj tüpleri</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ve mikro; l mikrofüj tüpleri</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; l PCR tüpleri</td><td>Sıkı</td> oturan kapaklı çeşitli <td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kap</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Drierite</td></tr><tr><td>Kimwipes</td> tutmak için <td>Çeşitli</td><td></td><td>tek kullanımlık mendiller</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>parafin filmi</td></tr> <tr><td><güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü></td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diğer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC saflaştırılmış 5' etiketli oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>X kromozomunun 359 bp uydu tekrarını tanıyan Cy3 etiketli problar</td></tr><tr><td>Volocity 3D Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Sürüm 6.3</td></tr></tbody></table>

kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben drosophila yumurta

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

İnsanlarda kromozom segregasyon hataları yumurta Düşükler ve doğum kusurları çoğunluğu için sorumlu olan. Ayrıca, kadınların yaşlandıkça, hamile kalma aneuploid bir fetus önemli ölçüde artırır ve bu olay riskini maternal yaş etkisi bilinir. Doğru kromozom ayrışma sırasında segregasyonun bölümler için bir gereklilik olduğunu bakım kardeş Kromatit uyum yumurta deneyim genişletilmiş profaz döneminde. Hem insanlar hem de model organizmalar saytolojik kanıtlar segregasyonun uyum süreci yaşlanma sırasında bozulur gösteriyor. Buna ek olarak, insan yumurta segregasyon hataları mayoz sırasında en yaygın olan ben, kol uyum Prematüre kaybı ile tutarlı. Model organizmalar uyum yaş bağımlı kaybı altında yatan mekanizmaları çözülüyor için kritik kullanımıdır. Drosophila melanogaster segregasyonun uyum içinde yumurta Yönetmeliği çalışmak için birçok avantaj sunar. Ancak, yakın zamana kadar sadece genetik testler kol uyum içinde yumurta farklı genotip veya farklı deneysel koşullar altında kaybı için tahlil mevcut idi. Floresans in situ kullanmak için hibridizasyon (balık) doğrudan görselleştirmek için kusurları kol uyum içinde prometafaz içinde ben ve metafaz Drosophila yumurta tutuklandı, detaylı bir iletişim kuralı sağlanmıştır. X kromozomu distal koluna hybridizes bir balık sonda üreten ve confocal Z yığınları toplama, bir araştırmacı, birçok bireysel balık sinyalini üç boyutlu görselleştirme ve kardeş olup olmadığını belirlemek Kromatit kolları ayrılmış. Özetlenen yordamı kol uyum kusurları Drosophila yumurtalar yüzlerce ölçmek olanak sağlar. Bu nedenle, bu yöntem uyum bakım yanı sıra onun ölümü için yaşlanma sürecinde yol açan faktörler katkıda mekanizmaları araştıran için önemli bir araç sağlar.

Şekil 5 saytolojik bölge 6E-7B X kromozomu üzerinde hybridizes bir kol sonda ile elde edilen görüntüler sunar. Bu araştırma sonuçlarında DAPI Bununla birlikte yerelleştirir, arka plandan kolayca ayırt edilebilir ve başarıyla kol uyum kusurları farklı genotip19ölçmek için kullanılan bir sinyal. Miktar uyum kusurların kısıtlı prometafaz için ben ve metafaz ben aşamaları; Yumurtalar önce nükleer zarf arıza analizi<sup class="xref...

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Bu prosedürün genel amacı, FISH probları oluşturmak ve prometafaz bir ve metafaz bir sırasında drosophila oositlerinde mayotik kol kohezyon durumunu görselleştirmektir. Bu tekniğin ana avantajı, prometafaz ve metafaz birde tutuklanan drosophila oositlerinde kol kohezyon durumunu test etmeye izin vermesidir. Bu yöntem, drosophila mayoz bölünme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hangi koşullar kol uyumunun erken kaybına yol açar?Bu teknik, insanlarda, en azından kısmen, mayotik kohezyonun oositlerin yaşlandıkça bozulması nedeniyle meydana gelen anne yaşı etkisi hakkındaki anlayışımızı genişletme potansiyeline sahiptir. Bu protokole, FISH için kol probunun oluşturulmasının yanı sıra metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi oositlerin diseksiyonu ve fiksasyonu ile başlayın. Geç evre oositleri ayırmak için, önce sığ bir diseksiyon kabına bir mililitre PBSBTX ekleyin.Ardından, sabit yumurtalıkları sığ tabağa aktarmak için BSA kaplı uçlu bir P-200 kullanın. Olgun oositleri daha az olgun oositlerden çıkarmak için BSA kaplı pipet ucuyla yumurtalıkları yukarı ve aşağı pipetleyin. Geç evre oositler yeterince ayrıldığında, tüm dokuyu 500 mililitrel

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva optik loblarında hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibridizasyonu (HCR-FISH) gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Prob tasarımı, hibritleşme, amplifikasyon ve doku montajı prosedürleri, gelişmekte olan optik lobun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı olarak hazırlanmıştır.

Gelişen Drosophila optik lobunda hibridizasyon zincirleme reaksiyonu FISH

Öğrenin, Drosophila oositlerinde meiyotik kol uyumunu FISH probu üreterek ve floresan görüntüleme yaparak incelemeyi. Bu yöntem, kromozom ayrışması mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta (Video) | JoVE Journal

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Daha fazla video keşfet