Name: DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Keşfedin DNA bağlanma özelliklerini manyetik parçacıklar üzerinde dinamik ve elektroforetik ışık saçılma ile. Bu yöntem biyoteknoloji ve moleküler tanı alanlarında parçacık boyutu, polidispersite ve zeta potansiyeli analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çek Bilim Vakfı (proje GA CR 17-12816S) ve CEITEC 2020 (LQ1601) tarafından mali destek büyük ölçüde kabul edilmektedir.

1. manyetik nano tanecikleri sentez <ol><li><ol><li>FeCl 3 Ekle 20 mmol sitrat (MNPs) ile manyetik nano tanecikleri sentezi stabilize &#8729; 6 H 2 O (5.406 g) ve FeCl 10 mmol 2 &#8729; 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated Çift Kişilik distile su (ddd su) 20 ml. Kabı kadar şeffaf bir çözüm elde edilen mekanik karıştırıcı kullanarak N 2 atmosfer altında şiddetle çözümde elde heyecan.</li>
		<li>Hızlı mekanik karıştırma altında 150 mL 1 M NH 4 OH, damla damla bırakarak huni (take 1 saat veya daha fazla gerekirse) kullanarak ekleyin. Tüm NH 4 OH ekledikten sonra çözüm beceremeyeceğin bir kap aktarın. 30 dakika süreyle 75 ° C'de gemi ve ısı çözüm vida 
		Dikkat: NH 4 OH aşındırıcı ve çevre için tehlikeli olarak sınıflandırılır. 
		Not: NH 4 OH çözüm yüksek dereceli % 28 NH 4 OH deoxygenated su kullanılarak su hazırlayın.</li>
		<li>Mıknatıs ve yıkama 100 mL ddd su kullanarak kullanarak siyah çökelti toplamak. 3 kez tekrarlayın. 50 mL 0.5 M tri sodyum sitrat dihydrate çökelti ekleyin. Gemi vida. 
		Not: tri sodyum sitrat dihydrate deoxygenated çözüm kullanın.</li>
		<li>Yeniden dağıtmak çökelti sonication (35 kHz, % 100 genliği) ve 1 h için 80 ° C'de ısı damar yolu ile 
		Not: Bir sonicator yeterli güç gereklidir.</li>
		<li>Oda sıcaklığında için çözüm soğumaya bırakın. Bir mıknatıs kullanarak çökelti toplamak ve süpernatant kaldırın. Ddd su sonicator (35 kHz, % 100 genliği) kullanarak 50 ml siyah çamur yeniden dağıtmak.</li>
		<li>Aliquots (~ 25 mL) 50 mL santrifüj tüpler içine aktarmak ve 20 mL aseton ekleyin. Santrifüj kapasitesi 2400 x g 10 dk de ve supernatants kaldırmak.</li>
		<li>Yeniden dağıtmak çökelti ve su uygun hacminin düşük moleküler ağırlıklı kesme diyaliz cihaz (500-1000 Da) için 24 h kullanarak karşı çözüm diyaliz 
		Not: diyaliz cihaz üretici göre hazırlamak &#39; s gereksinimleri.</li>
	</ol></li> <li>Manyetik nano tanecikleri dallı polyethylenimine (MNPs_PEI) ile modifiye sentezi <ol><li>elde edilen MNPs çözüm (~0.1 g/mL) 2 mL bir cam kabı ekleyin. 38 mL ddd su ekleyin ve süspansiyon (10 dakika) (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>10 mL % 10 dallı polyethylenimine (ortalama 25 kDa) hızlı mekanik karıştırmaya altında eklenir. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin</li>
		<li>Toplamak mıknatıs kullanarak çökelti ve süpernatant kaldırın. Çökelti 20 mL ddd su yeniden dağıtmak. 5 kez yineleyin sonra son süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li> <li>Manyetik nano tanecikleri parçacıklar sentezi silis (MNPs_TEOS) ile modifiye <ol><li>elde edilen MNPs çözüm (~0.1 g/mL) 10 mL bir cam kabı ekleyin. 60 mL su ve 130 mL etanol ekleyin. Çözüm solüsyon içeren temizleyicide ve % 28 NH 4 OH 6 mL ekleyin.</li>
		<li>Tetraethyl orthosilicate 1 mL hızlı mekanik karıştırma altında ekleyin. Çözüm için sonraki 12 h. ilave edin</li>
		<li>Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. Yeniden dağıtmak parçacıklar ddd 10 mL su ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li> <li>Amino grupları ile (MNPs_APTES) değiştiren manyetik nano tanecikleri sentezi <ol><li>elde edilen MNPs_TEOS çözüm (~0.1 g/mL) 5 mL bir cam kabı ekleyin. 45 mL su ve 50 mL etanol ekleyin. Çözüm (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Hızlı mekanik karıştırma altında (3-aminopropyl) triethoxysilane 0.5 mL ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin</li>
		<li>Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. Yeniden dağıtmak parçacıklar ddd 5 ml su ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li></ol> 2. Manyetik Microparticles sentez <ol><li><ol><li>Ekle 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH ve ddd beceremeyeceğin bir gemi suya 205.875 mL manyetik microparticles sentezi sitrat (MMPs) ile stabilize. 6.675 mL 1 M FeSO 4 manyetik karıştırma sırasında ekleyin. 2 h. için Önceden ısıtılmış su banyosu (90 ° C) hemen gemiye transfer 
		Not: KNO 3 ve ddd çözümlerinde KOH su hazırlayın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında için çözüm soğumaya bırakın. Mıknatıs ve yıkama ddd su 50 mL (5 kez) kullanarak kullanarak siyah çökelti toplamak. 50 mL 0.5 M tri sodyum sitrat dihydrate çökelti ekleyin. Gemi vida.</li>
		<li>Yolu ile sonication (35 kHz, % 100 genliği) ve ısı gemi 1 h. toplamak siyah çökelti mıknatıs ve yıkama ddd su 50 mL (10 kez) kullanarak kullanarak için 80 ° C'de çökelti redisperse.</li>
		<li>Değiştirmek MMPs dallı polyethylenimine (MMPs_PEI), ile silis (MMPs_TEOS) ve amino grupları (MMPs_APTES) MNPs iletişim kuralına benzer. Daha fazla bilgi için sırasıyla 2.2, 2.3 ve 2.4, bölümlerine bakın.</li>
	</ol></li> <li>Manyetik microparticles dallı polyethylenimine (MMPs_PEI) ile modifiye sentezi <ol><li>5 mL MMPs çözeltisi (~0.1 g/mL) bir cam kabı ekleyin. 38 mL ddd su ekleyin ve çözüm (35 kHz, % 100, 10 min genliği) solüsyon içeren temizleyicide. Hızlı mekanik karıştırma altında 10 mL % 10 polyethylenimine (ortalama 25 kDa) dallı ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin</li>
		<li>Bir mıknatıs kullanarak çökelti toplamak ve süpernatant kaldırın. Çökelti Çift Kişilik distile su 20 ml redisperse. 5 kez yineleyin sonra nihai çözüm (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li> <li>Manyetik microparticles silika (MMPs_TEOS) ile modifiye sentezi <ol><li>5 mL MMPs çözeltisi (~0.1 g/mL) bir cam kabı ekleyin. 60 mL su ve 130 mL etanol ekleyin. Süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide ve % 28 NH 4 OH 6 mL ekleyin.</li>
		<li>Tetraethyl orthosilicate 1 mL hızlı mekanik karıştırma altında ekleyin. Çözüm için sonraki 12 h. ilave edin</li>
		<li>Siyah çökelti bir mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 kere) yıkayın. 5 mL ddd su parçacıkları redisperse ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li> <li>Manyetik microparticles amino grupları (MMPs_APTES) ile modifiye sentezi <ol><li>MMPs_TEOS çözüm (~0.1 g/mL) 3 mL bir cam kabı ekleyin. 45 mL su ve 50 mL etanol ekleyin. Süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Hızlı mekanik karıştırma altında (3-Aminopropyl) triethoxysilane 0.5 mL ekleyin. Sonraki 3 h. için çözüm ilave edin</li>
		<li>Siyah çökelti mıknatıs kullanarak toplamak ve 50 mL etanol (3 kere) kullanarak ve 50 mL su (3 saat) yıkayın. 3 mL ddd su parçacıkları redisperse ve süspansiyon (35 kHz, % 100 genliği) solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	</ol></li></ol> 3. Manyetik partikül boyut analiz DLS kullanarak bir arka saçılma dedektörü açısı (173 °) ve ışın dalga boyu 633 geçerlidir <ol><li>partikül büyüklüğü suda <ol><li>kullanımı bir DLS enstrüman nm. 
		Not: Arka saçılma DLS nerede birden çok saçılma önlenebilir konsantre örnekleri için uygundur. Yan saçılma (Dedektör açısı 90°) ve ileri saçılma (Dedektör açısı 15°) DLS daha küçük parçacıklar için uygundur ve parçacıklar, sırasıyla karışık.</li>
		<li>Önceden su, ölçümü için solüsyon içeren temizleyicide parçacıklar 3 dakika süreyle 
		Not: parçacıkların seyreltilmiş çözüm kullanın. Bu amaçla, parçacıkların 9,6 µL su 96 µL ile karıştırmak.</li>
		<li>Dikkatle 50 µL parçacık çözüm polistren lateks pipet cuvettes ve kabarcıklar oluşumunu önlemek. 
		Not: her örnek için tek kullanımlık küvet (malzemelerin tablosuna bakın) kullanın.</li>
		<li>Küvet netliğini ve ışık demeti yönüne dikkat edin. Hücre içinde örnek sahibinin Ekle ve odası kapatın.</li>
		<li>Ölçüm için aşağıdaki parametreleri kullanın: sıcaklık: 25 ° C; dağıtıcı faz (demir) Kırılma indisi: 2.344; Kırılma indisi dağıtıcı ortamı (su): 1,333 
		Not: özellikle roman ya da hibrid malzemeler geliştirirken daha kesin sonuçlar için bir Refraktometre kullanarak Kırılma indeksi ölçümü gerçekleştirmek.</li>
	</ol></li></ol> 4. DNA hisse senedi, manyetik parçacıklar ve bağlayıcı arabelleğe hazırlama <ol><li>DNA hisse senedi <ol><li>Kullanım 10 mM Tris-HCL tampon (pH = 8) seyreltme ve DNA'ın depolama için. Özellikle Laboratuvarı (Bölüm 5.2 tepki ayarları ve koşullar için bakın) doğrudan bir PCR protokolü ile çoğaltılabilir standart bir DNA örneğini kullanın. 498 baz çifti (bp) eksen gen bakteriyofaj λ denetiminden yükseltmek için aşağıdaki astar kullanın. İleri astar: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Astar ters: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>ticari DNA arıtma kit kullanarak arındırmak PCR ürünü. 
		Not: ticari kitleri silis sütunlara göre yordamı kullanarak verim &#62; 100 ng/µL saf DNA'sı.</li>
		Spektrofotometrik yöntemle DNA <li>ölçü konsantrasyonu (260 Absorbans nm). 10 çalışma çözümleri için yukarıda belirtildiği gibi 10 11 kopya/µL DNA stokunun seyreltik 10, 10 9, 10 8 ve 10 7 kopya/µL. 
		Not: PCR ürünü kopya sayısı ortalama molekül ağırlığı her bp için 650 Da olduğunu varsayarsak aşağıdaki denklemi göre hesaplanabilir: DNA kopya/µL = (ng/µL miktar * 6.022x10 23 kopya/mol) / (498 bp * BP 650 g/mol * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>manyetik parçacıklar <ol><li>parçacıklar tortu mıknatıs olmadan için izin ve süpernatant kaldırın. 1:20 mix v/v oranı ddd su ile manyetik parçacıkların (parçacıklar: su). 
		Not: Birim dayalı yaklaşım MNPs ve MMPs eşit kitlelerin kolayca karşılaştırmak zor olduğundan manyetik parçacıklar miktarlarda tanımlamak için kullanılır.</li>
	</ol></li> <li>Bağlama arabellek <ol><li>0,75 M sodyum asetat-HCL çözüm hızlı hazırlanması için (pH = 6), 3 M sodyum asetat 1 mL 1 mM HCL ile 3 mL karıştırın. 
		Not: tüm çözümler bağlamada kullanılan 4'te saklanabilir ° C. Not düşük sıcaklık bağlama etanol çözüm durumunda özellikle önemli ölçüde artırır. Dikkatli bir şekilde daha iyi tekrarlanabilirlik için çözümler sıcaklığını ve tarama doğruluğunu kontrol.</li>
	</ol></li></ol> 5. Verimlilik, DNA yalıtım kullanarak kantitatif PCR test <ol><li>tarafından değiştirilmiş MMPs veya MNPs DNA izolasyon <ol><li>96-şey plaka ve küçük hacimli deneyler için 96-şey plaka için özelleştirilmiş bir mıknatıs kullanın.</li>
		<li>Aşağıdaki bağlama çözüm karışımı kullanın: 8 µL modifiye MMPs veya MNPs, 10 µL sodyum asetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL % 85 etanol, 10 µL DNA (10 10 kopya çözüm).</li>
		<li>Mix pipetting tarafından iyi ve plaka 3 dk için mıknatıs yerleştirin. Plaka üzerinde mıknatıs olsa da, çözümü kaldırın ve 100 µL % 85 etanol yıkama ekleyin.</li>
		<li>Kaldır etanol. 
		Not: birkaç saniye boyunca kurumaya etanol izin ama çatlaklar gösterme veya aşırı kuru parçacıklar izin vermeyin. Parçacıklar aşırı kuru onlar elüsyon çözüm ile çözülmeye zor olacak.</li>
		<li>Plaka mıknatıs kaldırın ve 40 µL elüsyon çözüm ekleyin. De pipetting tarafından karıştırın. Plaka üzerinde geri mıknatıs yerleştirin ve eluted DNA toplamak (~ 37 µL). Eluent-20 ° c kadar daha fazla çözümleme depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Kantitatif PCR <ol><li>Haddad ve ark tarafından protokolüne göre stok DNA adım 4.1.1 xis gen kopyalarını ölçmek için hazırlamak için kullanılan astar kullanın. 10</li> <li>ana mix çözüm örnekleri test edilecek miktarına göre hazırlamak, sonra karışımı PCR tüpleri veya beyaz arka plan 96-şey plaka dağıtmak.</li>
		<li>Aşağıdaki miktarları 20 µL PCR karışımı tam bir birim için kullanın: 10 µL polimeraz / boya karışımı enterkalasyon (malzemelerin tabloya bakın), 2 µL DNA örneği, 2 µL ileri astar (10 µM), 2 µL ters astar (10 µM)</li>
		<li>Thermocycler göre aşağıdaki programı kurun: 95 ° C için 120 s, 40 döngüsü (95 ° C 15 s, 15 64 ° C s, 68 ° C 45 için s), 5 dk. 68 ° C</li>
		<li>Kullanma triplicates standartlar ve örnekleri, döngüsü eşik hesaplamak ve her örnek alındı DNA kopya sayısını tahmin etmek için standart bir eğri oluşturur. Burada kullanılan alet bu otomatik olarak gerçekleştirir.</li>
		<li>Burada, DNA'ın kopya sayısını toplam elüsyon birim (~ 40 µL) için tahmin edilmektedir. Alındı DNA çözüm (tamamen 10 11 kopya) bağlama için eklenmiş orijinal tutar karşılık gelen yüzdesi 0-100 aralığı dışında farklı.</li>
	</ol></li></ol> 6. DNA-manyetik parçacıklar bağlama Analysis DLS kullanarak <ol><li>Bağlama DNA <ol><li>büyük bir hacim için deneylerde (1,5 mL tüp), aşağıdaki bağlama çözüm karışımı kullanın: 96 µL modifiye MMPs veya MNPs, 120 µL sodyum asetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL % 85 etanol, 120 µL DNA (10 10 kopya çözüm) veya 120 µL Tris-HCL tampon (10 mM, pH = 8) denetimi için.</li>
	</ol></li> <li>Zeta potansiyel analizi <ol><li>hazırla iki ciltleme çözümleri, bir DNA ve başka Tris-HCL tampon 6.1.1. adımda anlatıldığı gibi denetim için. Kabarcıklar oluşumunu önlemek için dikkatli bir şekilde 800 µL bağlama karışımı bir tek kullanımlık pipet. 
		Not: tek kullanımlık küvet yüzey zeta potansiyel (malzemelerin tablosuna bakın) ölçümlerinde kullanın.</li>
	</ol></li> <li>DLS cihazda ölçüm için aşağıdaki parametreleri kullanın: Smoluchowski modeli ile bir F(ka) 1.5, sıcaklık: 25 ° C, Kırılma indisi dağıtıcı faz (demir): Dağıtıcı ortamı (su) 2.344, Kırılma indisi: 1,333. 
	Not: DNA-Manyetik Parçacık etkileşim oranı doğrudan çoğaltır ölçüm etkiler. Tek bir ölçüm aracı tarafından 60-70 s alır. Burada, enstrüman gecikme aralıkları ile 1 dk 10 ölçümler almak için talimat aldım. Kolaylık olması açısından, sonuçları zaman gösterilecek ilk okuma 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ve 18 dk =.</li>
</ol>

<ol><li>Kulinski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+module+for+bacterial+lysis+and+isolation+of+DNA+from+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).</li>
<li>Loonen, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Pathogen+DNA+Isolation+Methods+from+Large+Volumes+of+Whole+Blood+to+Improve+Molecular+Diagnosis+of+Bloodstream+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).</li>
<li>Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+from+processed+and+unprocessed+wood%3A+Factors+influencing+the+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).</li>
<li>Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308698261_Potential_of_Magnetic_Nanoparticles_for_Hepatitis_B_Virus_Detection">Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection.</a> J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).</li>
<li>Ulbrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+polymers+and+magnetic+nanoparticles%3A+covalent+and+noncovalent+approaches%2C+release+control%2C+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies.</a> Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).</li>
<li>Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1070/RC2014v083n04ABEH004412/meta">Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems.</a> Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).</li>
<li>Xu, R. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674200108000357">Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement.</a> Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).</li>
<li>Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669017302169">Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements.</a> Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).</li>
<li>Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+DNA+by+Polycharged+Magnetic+Particles%3A+An+Analysis+of+the+Interaction+by+Zeta+Potential+and+Particle+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).</li>
<li>Tenorio-Neto, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+magnetic+core+conducting+polypyrrole+polymer+shell%3A+Preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).</li>
<li>Baharvand, H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/272536835_Encapsulation_of_ferromagnetic_iron_oxide_particles_by_polyester_resin">Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin.</a> e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10965-013-0199-0">Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin.</a> J Polym Res. 20 (7), (2013).</li>
<li>Heger, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+Nanoparticles+as+a+Platform+for+FRET-Based+Sarcosine+Picomolar+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25451956">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için zeta potansiyel ile manyetik parçacıklar DNA bağlanma açıklar teorik ilkeleri altında soru vardı. Protokol sentez ve manyetik nano tanecikleri ve microparticles değişiklik açıklar. DNA kontrolü ve bağlama çözüm hazırlanması için yöntemi ayrıca açıklanmıştır. İki strateji DNA-parçacık etkileşimleri ile taranması için burada gösterilir: kantitatif PCR ve DLS yaklaşıyor. DLS sağlar parçacıklar olarak fizikokimyasal değişiklikler üç göstergeleri: partikül büyüklüğü, polydispersity dizini ve zeta potansiyel. ...

DNA izolasyon Moleküler biyolojide en önemli adımlardan biri. Nükleik asit ayıklama yöntem geliştirme genomik, metagenomics, epigenetik ve transcriptomics ortaya çıkan alanların büyük etkisi vardır. Çok çeşitli tıbbi dahil olmak üzere DNA izolasyonu (adli/tanılama araçları ve prognostik biyolojik) için Biyoteknolojik uygulamaları ve çevresel uygulamalar (metagenomic biyolojik çeşitlilik, patojen yaygınlık ve gözetim) vardır. Arındırmak ve farklı malzemelerden ve kan, idrar, toprak, tahta ve diğer tür örnekleri gibi farklı ölçeklerde DNA izole etmek için artan talep oluştu. 1 , 2 , 3 , 4
Ne zaman bir manyetik alan tarafından immobilize Nano ve mikro ölçekli parçacıklar için DNA izolasyonu yüksek onların yüzey alanı nedeniyle ve özellikle uygundur. Parçacıkların boyutu veya şarj, fizikokimyasal özellikleri hedef biomolecules şekilde bağlanabilemeleridir büyük ölçüde etkileyebilir. 5 farklı kimyasal değişimleri (yüzey kaplama) bağlama biomolecules, daha fazla arttırmak ve parçacıklar stabilize etmek için kullanılabilir. Birçok farklı stratejileri bağlama için kovalent ve kovalent olmayan etkileşimleri göre sınıflandırılır. 6 parçacık kompozisyon metalik, alaşım ve yoğunluğu, porozite ve yüzey üzerinde etkili olabileceği diğer maddeleri birleşme tarafından uygun olabilir, ancak parçacıkların boyutunu doğrudan mıknatıslanma özelliklerini etkiler. 7 küçük parçacıkların yüzey şarj ölçmek için güvenilir yolu yoktur. Bunun yerine, kayan uçak (nanopartikül yüzey uzak mesafe), Elektrik potansiyeli ölçülebilir. 8 bu değer zeta potansiyel denir ve genellikle DLS yolu ile nano - ve microparticle istikrar değerlendirilmesi için kullanılan güçlü bir araçtır. 9 değerini sadece pH ve iyonik gücü dağıtıcı çevre, aynı zamanda parçacıkların yüzey özellikleri üzerinde son derece bağımlı olduğundan, bu da arasındaki etkileşim nedeniyle bu yüzey değişiklikleri kanıtlayabilirim parçacıklar ve molekül ilgi. 10
Öte yandan, B-DNA formu onun yağış (toplama) ne zaman karşılaştırmak için yaygın olarak kolaylaştırmak susuz koşulları (A-DNA formu) sergiler sıkıştırılmış biçimler DNA yapısında meydana gelen. (Elektrostatik iyonik ve H-bond) DNA bağlama diğer malzemelere onların sterically erişilebilir fosfat nedeniyle kontrol büyük güçleri ve azot (özellikle guanin) temelleri. 7 , 10
Bu çalışmada, manyetik nano tanecikleri ve microparticles üç temsilcisi kimyasal değişimleri analiz edilir (şekil 1A). Nano tanecikleri ve microparticles kimyasal modifikasyonu ve sentez yöntemi açıklanmıştır. Bu anlaşmaları DNA bulutlu (pH, iyonik gücü ve dehidratasyon) teorik ilkeleri için bir bağlama çözüm DNA bağlama ve elüsyon değerlendirmek için kullanılır. Kantitatif PCR DNA elüsyon verimliliğini temsilcisi nano tanecikleri ve microparticles (şekil 1B) değerlendirmek için kullanılır. Partikül Büyüklüğü, polydispersity dizini ve zeta potansiyel (şekil 1 c) parçacık yüzeyinde oluşan fizikokimyasal değişiklikleri görselleştirmek için kullanılan önemli parametreleridir. Manyetik partikül yüzeyine kimyasal karakterizasyonu vurgulamak önemlidir. Bu adımı bu iletişim kuralının kapsamı dışında iken, kimyasal değişimleri verimliliğini araştırmak için çeşitli modern teknikler uygulanabilir. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform Infrared spektroskopisi (FTIR) parçacık yüzey kızılötesi spektrum değerlendirmek ve ücretsiz kimyasal değiştiriciler spektrum karşılaştırmak için kullanılabilir. X-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) malzeme yüzeyi elemental kompozisyon tanımlamak için kullanılan bir tekniktir. Diğer elektrokimyasal, mikroskobik ve spektroskopik yöntemler parçacık sentez kalitesini ışık için kullanılabilir. DNA-Manyetik Parçacık etkileşimleri DLS yoluyla çözümlemek için yeni bir bakış açısı bu iş vurgulamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Demir(III) klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Demir(II) klorür tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Demir(II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Tetraetil ortosilikat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr> <tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Polietilenimin, dallı, ortalama Mw ~ 25.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Potasyum nitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>ow-moleküler ağırlık kesme membranı (Mw = 1 kDa)</td> <td>Spektrum laboratuvarları</td><td>G235063</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Üstten Karıştırıcı</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Manyetik parçacık sentezi</td></tr><tr><td>MARKA UV küvet mikro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Küvet boyut ölçümü için</td></tr><tr><td>UV küvet mikro için MARKA kapağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Boyut ölçümü için küvet kapakları</td></tr><tr><td>Katlanmış Kılcal Zeta Hücre</td><td>Malvern</td><td></td><td>DTS1070 Zeta potansiyeli ölçümü için küvet</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Boyut ve zeta potansiyeli ölçümü için cihaz</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO NanoQuant cihazı</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>DNA konsantrasyonunun ölçümü için cihaz</td></tr><tr><td>SYBR Yeşil Kantitatif RT-PCR Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>PCR kiti</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S enstrüman</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>MinElute kiti</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>DNA bağlanması</td></tr></tbody></table>

dna manyetik parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Manyetik parçacıklar kullanarak DNA izolasyonu Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Araştırma yüksek öneme sahip bir alandır. Bu iletişim kuralı DNA-manyetik parçacıklar dinamik ışık saçılma (DL) ve elektroforetik ışık saçılma (ELS) bağlama değerlendirilmesi açıklar. DLS göre analiz partikül büyüklüğü, polydispersity ve zeta potansiyel gibi parçacıklar fizikokimyasal özellikleri üzerinde değerli bilgiler sağlar. İkinci DNA gibi malzemelerin Elektrostatik bağlamadaki önemli rol oynayan parçacık yüzey ücretten açıklar. Burada, karşılaştırmalı bir analiz nano tanecikleri ve microparticles ve DNA bağlama ve elüsyon üzerindeki etkileri üç kimyasal değişimleri patlatır. Dallı tarafından kimyasal değişimleri polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate ve (3-aminopropyl) triethoxysilane incelenmiştir. DNA negatif yük sergileyen beri zeta potansiyel parçacık yüzey üzerine DNA'ın bağlama azalır bekleniyor. Kümeleri oluşturan parçacık boyutu da etkiler. Bu parçacıklar izolasyon verimliliğini ve DNA'ın elüsyon araştırmak için parçacıklar düşük pH (~ 6), yüksek iyonik gücü ve dehidratasyon çevre DNA ile karıştırılır. Parçacıklar mıknatıs üzerinde yıkanmış ve sonra DNA Tris-HCl tampon tarafından eluted (pH = 8). DNA kopya sayısı nicel Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak tahmin ediliyor. Zeta potansiyeli, parçacık boyutu, polydispersity ve kantitatif PCR veri değerlendirilen ve karşılaştırıldığında. DLS bir anlayışlı ve parçacıklar DNA izolasyonu için tarama işlemi için yeni bir bakış açısı ekler analiz yöntemi destekleyen var.

Kimyasal sentez ve manyetik parçacıklar değiştirilmesi için burada açıklanan protokolünü kullanarak, altı manyetik parçacıklar sentezlenmiş ve DNA bağlama için analiz. Analiz bir özeti Tablo 1' de gösterilen. Partikül Büyüklüğü su ve bağlama çözüm karşılaştırarak, bu tüm parçacıklar 2-22 kıvrımlar tarafından çözüm bağlama içinde toplanan açıktır. Bazı parçacıklar daha fazla DNA varlığında daha fazla folds için toplanan; Ancak bu doğrudan kantitatif PCR (Tablo 1</s...

Bu iletişim kuralı manyetik parçacıklar sentezi ve değerlendirilmesi yolu ile dinamik ve elektroforetik ışık saçılma DNA'ya bağlanıcı özellikleri açıklar. Bu yöntem partikül büyüklüğü, onların polydispersity değişiklik izleme üzerinde odaklanır ve zeta potansiyeli oynamak parçacık yüzey Binbaşı bağlama DNA gibi malzemelerin rolü.

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Bu deneyin genel amacı, Dinamik ve Elektroforetik Işık Saçılımı yoluyla DNA ve Manyetik Parçacıkların bağlanmasını analiz etmektir.Bu yöntem, Biyoteknoloji alanındaki nükleik asit ve manyetik parçacıklar arasındaki bağlanmanın ne kadar hızlı ve güçlü olduğu gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, parçacıklar üzerindeki boyut, polidispersite veya zeta potansiyeli gibi fiziksel-kimyasal değişikliklerin görselleştirilmesidir. Bu tekniğin etkileri, hızlı ve hassas DNA izolasyonu için artan talep nedeniyle moleküler tanıya kadar uzanır. Bu prosedürde, 20 mililitre Oksijeni Giderilmiş Çift Damıtılmış Su içinde 20 milimol Demir Klorür ve on milimol Demir Klorür ekleyin.Daha sonra, elde edilen çözeltiyi, şeffaf bir çözelti elde edilene kadar mekanik bir karıştırıcı kullanarak Azot gazı atmosferi altında beher içinde kuvvetlice karıştırın. Daha sonra, hızlı mekanik karıştırma altında, bir saat boyunca damlatma hunisi kullanarak 150 mililitre bir molar sulu amonyak damla damla ekleyin. Daha sonra, çözeltiyi vidalanabilir bir kaba aktarın ve çözeltiyi 75 ° C'de ısıtın

dna-magnetic-particle-binding-analysis-dynamic-electrophoretic-light

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Düzlemsel örneklerinde manyetik parçacıkların görüntülenmesi için bir tarayıcı manyetik algılama tekniği karıştırma düzlemsel frekansı kullanılarak geliştirilmiştir. parçacıkların doğrusal olmayan nonhysteretic mıknatıslanma manyetik modülasyon ürünleri tepkisi iki frekans uyarım üzerine kaydedilir. İnce biyolojik örneklerin 2D görüntüleri çekmek için kullanılabilir.

Düzlemsel Örnekleri Manyetik tanecikler Görüntüleme Manyetik algılama Tarayıcı Karıştırma frekansı

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Kolloidal prob nanoskobu, kolloidal sistemlerin fiziksel stabilitesi ve pıhtılaşma kinetiği hakkında bilgi edinmek ve biyolojik sistemleri kullanarak ilaç keşfi ve formülasyon bilimlerine yardımcı olmak için çeşitli alanlarda kullanılabilir. İçinde açıklanan yöntem, bu tür sistemleri incelemek için nicel ve nitel bir araç sağlar.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

oksidatif dönüşümler için bir kofaktör - Biz hidrojen peroksidin ışık katalize nesil için bir protokol açıklar.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Keşfedin DNA bağlanma özelliklerini manyetik parçacıklar üzerinde dinamik ve elektroforetik ışık saçılma ile. Bu yöntem biyoteknoloji ve moleküler tanı alanlarında parçacık boyutu, polidispersite ve zeta potansiyeli analizi sağlar.

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

Daha fazla video keşfet