Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Bu prosedürün genel amacı, mRNA'nın hangi bölgelerinin proteinlere çevrildiğini belirlemek, tomurcuklanan maya saccharomyces cerevisiae'deki protein translasyonunu genom çapında düzeyde kantitatif olarak ölçmektir. Ribozom profillemesi, proteinlerin ve hastalıkların oranını izlemek ve translasyonel düzenleme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer yöntemlere kıyasla çok daha fazla hassasiyet katması ve bunlardan proteinleri ve hastalıkları in vivo olarak tek temas çözünürlüğünde ölçmesidir.

Bu protokol tomurcuklanan maya için spesifik olsa da, memeli hücreleri ve dokuları gibi diğer model sistemlerde ribozom profili oluşturmaya çalışan araştırmacılar için de yararlıdır. Ekstraktlar, orta log fazına kadar büyütülen maya hücrelerinden hazırlanacaktır. Kültürü 0,45 mikro membran filtrelerden filtrelemek için bir cam tutucu filtre tertibatı kullanın.

Peleti spatula ile kazıyın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üç krom çelik 3.2 milimetre boncuğu 1.8 mililitre paslanmaz çelik tüpe koyun ve tüpü sıvı nitrojen içinde önceden soğutun. Dondurulmuş peletleri ekleyin ve çelik boruyu silikon kauçuk bir kapakla kapatın.

Numuneyi 4200 rpm'de 10 saniye boyunca kriyo-öğütme ile homojenize edin. Numuneleri tüm öğütme prosedürü boyunca donmuş halde tutmak için, tüpü her öğütme arasında en az 10 saniye sıvı nitrojen içinde soğutmak çok önemlidir. Homojenizasyon tamamlandığında, numuneye sikloheksimid içeren bir mililitre lizis tamponu ekleyin.

Pipetleyerek iyice karıştırın ve numuneyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez g santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Poli(A)mRNA izolasyonu için 100 mikrolitre lizatı başka bir yeni 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Sıvı nitrojende ayak izi ekstraksiyonu için kullanılacak olan lizatın geri kalanındaki mRNA örnekleriyle tüpleri hızlı dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ayak izi ekstraksiyonundan önceki gece, önceden hazırlanmış sakaroz gradyanlarını dört santigrat derecede çözdürün.

Ertesi gün, hücre lizatını buz üzerinde çözün. 50 OD260 birimi içeren bir hücre lizat alikotunu yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın, bir mililitreye kadar taze lizis tamponu ve 10 mikrolitre RNase ekleyin. Oda sıcaklığında, bir saat boyunca topuklu bir döndürücü üzerinde hafifçe döndürerek inkübe edin.

Daha sonra, lizat örneğini polimer tüplerde %10 ila %50 sükroz gradyanının üzerine nazikçe katmanlayın. Bir SW41 ti rotor kullanarak, üç saat boyunca dört santigrat derecede 35.000 rpm'de ultra santrifüj edin. Ultra setifrigasyon sırasında, gradyan fraksiyonlama sistemini kurun.

Bileşenleri açın ve UV monitörünün en az 30 dakika ısınmasına izin verin. Şırıngayı kovalama solüsyonu ile doldurun ve şırınga ve kanül içindeki hava kabarcıklarını temizleyin. Ultrasantrifüjleme tamamlandığında, sükroz gradyanını içeren ultrasantrifüj tüpünü takın ve delin.

Şırınga pompasını dakikada bir mililitre ile başlatın ve A254 değerlerini izlerken bir mililitre fraksiyonları toplayın. ADS monozom zirvesini temsil eden fraksiyonlar toplanır ve bir araya getirilir. Fraksiyonları 0.5 mililitrelik santrifüj filtrelerden 12.000 kez g'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede süzün, akışı atın ve hacim 100 mikrolitreden az olana kadar tekrarlayın.

Pipetleme ile karıştırılan 400 mikrolitre serbest bırakma tamponunda 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, üniteyi yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Akışı toplayın. Daha sonra, ayak izi parçalarını saflaştırın ve metin protokolünde açıklandığı gibi etanol çökeltme kullanarak numuneleri çökeltin.

Bu prosedüre başlamak için, çökeltilmiş ayak izini ve parçalanmış mRNA örneklerini 30 dakika boyunca 20.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Etanolü çıkardıktan ve peletleri havayla kuruttuktan sonra, her peleti 7.75 mikrolitre suda askıya alıyoruz. Her pelete bir mikrolitre 10XT4 polinükleotid kinaz tamponu, bir mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ve 0.25 mikrolitre RNaz inhibitörü ekleyin.

Bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her ayak izi ve mRNA örneğinin 10 mikrolitresine 10 mikrolitre 2X TBE üre örnek tamponu ekleyin. Numuneleri ve uygun kontrolleri 75 santigrat derecede üç dakika inkübe edin, döndürün ve bir dakika boyunca buza koyun.

Her numuneyi %15'lik bir TBE üre jelinin iki kuyucuğuna yükleyin ve RNA parçalarını bir saat boyunca 180 voltta jel elektroforezi ile ayırın. Jeli, beş dakika boyunca ışıktan korunan bir nükleik asit jel lekesi ile boyayın. Jeli mavi ışıklı bir transilluminatör altında görselleştirirken, ayak izi örnekleri için 28 ila 32 nükleotid ve mRNA örnekleri için yaklaşık 50 ila 70 nükleotid arasında uygun bandı kesin.

Poliakrilamid jelden RNA'yı çıkarmadan önce eksize edilen poliakrilamid jel parçalarını eksi 80 santigrat derecede en az 10 dakika dondurun. Ters transkripsiyondan önce, üç ana adaptör ligasyonu gerçekleştirin ve numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi çökeltin. Her peleti 11,5 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.

Daha sonra 0.5 mikrolitre sekiz mikromolar ters transkripsiyon astarı ve bir mikrolitre dNTP karışımı ekleyin. 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. Her numuneye dört mikrolitre 5x birinci iplikçik tamponu, iki mikrolitre 0.1 molar DTT, 0.5 mikrolitre RNaz inhibitörü ve 0.5 mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.

48 santigrat derecede 30 dakika, 65 santigrat derecede bir dakika ve 80 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Her numuneye 0.8 mikrolitre iki molar sodyum hidroksit ekleyerek ve 98 santigrat derecede 30 dakika inkübe ederek hemen RNA'nın hidrolizine geçin. Reaksiyonu nötralize etmek için 0.8 mikrolitre iki molar hidrojen klorür ekleyin.

Numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi çökelttikten sonra, her peleti beş mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ve beş mikrolitre 2x TBE üre numune tamponu ekleyin. 75 santigrat derecede üç dakika inkübe edin, döndürün ve bir dakika buzlayın. Numuneyi %10 TBE üre jelinin bir kuyucuğuna yükleyin.

Ters transkripsiyon reaksiyonunun ürünlerini 50 dakika boyunca 180 volt jel elektroforezi ile ayırın. Jeli, beş dakika boyunca ışıktan korunan bir nükleik asit jel lekesi ile boyayın. Bir mavi ışık transilluminatörü kullanarak, bandı yaklaşık 128 nükleotid ve daha yüksek çıkarın.

Poliakrilamid jelden DNA'yı çıkarmadan önce poliakrilamid jel parçalarını eksi 80 santigrat derecede en az 10 dakika dondurun. DNA'yı dairesel hale getirmek için, her bir DNA peletini 16.75 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. İki mikrolitre 10x tek sarmallı DNA ligaz tamponu, bir mikrolitre 50 milimolar manganez klorür ve 0.25 mikrolitre tek sarmallı DNA Ligaz ekleyin.

Bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin, ardından 10 dakika boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Çökeltme olmadan, tek sarmallı DNA ligasyon reaksiyonu ürününü eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi PCR kütüphane amplifikasyonunu ve ardından kütüphane nicelleştirmesini ve yüksek verimli dizilemeyi gerçekleştirin.

PCR amplifiye edilmiş ayak izi kütüphanesinin temsili biyoanalizör profilleri ve mRNA örnekleri için elde edilen dizileme kütüphanesi gösterilmektedir. Ayak izi kütüphanesinin beklenen ortalama boyutu 148 ila 152 nükleotiddir ve mRNA kütüphanesinin beklenen boyutu 170 ila 190 nükleotiddir. Bu grafik, vahşi tip bir numunenin iki bağımsız biyolojik kopyası ve hbs1 delesyon mutantı için elde edilen mRNA, ayak izi ve rRNA okumalarının birleşik sayısını gösterir.

Ayak izi kitaplıklarındaki tüm sıralı okumaların %50 ila %60'ı ribozom korumalı ayak izi parçalarına karşılık geldi. Buna karşılık, mRNA kütüphanelerinde rRNA fragmanlarının sadece %3'ü gözlendi, bu da poli(A)mRNA izolasyonunun rRNA okumalarının etkili bir şekilde ortadan kaldırılmasına izin verdiğini gösterdi. Hem ayak izi hem de mRNA numune kitaplıkları, eşleşen numuneler arasında yaklaşık 0,99'luk bir Pearson korelasyon katsayısı ile gösterildiği gibi iyi tekrarlanabilirlik gösterir.

mRNA bolluk ölçümleri ile birleştirildiğinde, ribozom profili, deneysel koşullar arasındaki translasyon verimliliğindeki değişikliklerin ölçülmesine izin verir. Hbs1 delesyon mutantındaki önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genler, mRNA transkripsiyonundaki bir değişiklikten, translasyon verimliliğinden veya ortak bir etkiden etkilenip etkilenmediklerine göre gruplandırılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm protokol yaklaşık 11 gün içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, RNaz kontaminasyonunu önlemek ve numunelerde RNA bozulması riskini azaltmak için eldiven giymeyi ve tüm adımları RNaz içermeyen reaktifler ve sarf malzemeleri kullanarak gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, nükleaz sindirimi kullanarak ribozom ayak izlerinin nasıl oluşturulacağını, sakaroz gradyan fraksiyonasyonu ile bozulmamış ribozom ayak izi komplekslerinin nasıl izole edileceğini ve derin dizileme için DNA kitaplıklarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Sıvı nitrojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve aşırı soğuk malzemelerle çalışırken her zaman koruyucu gözlük ve kriyo eldiven takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.