Name: Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Öğrenin ribozom profil oluşturma yöntemiyle Saccharomyces cerevisiae'de genom çapında protein çevirimini nicel olarak ölçmeyi. Bu hassas teknik translasyonel regülasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser sağlık hibe AG040191 ve AG054566 için VML Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. VML yaşlanma araştırma Amerikan Federasyonu AFAR araştırma bursu alıcıdan iken bu araştırma yapılmıştır.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Ribo Seq yaklaşım mRNA çeviri vivo içinde genom çapında düzey 3analizi için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Çeviri ile tek-kodonu kararlılık izleme sağlar, bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar translasyonel yönetmelik anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Avantajları rağmen Ribo Seq bazı sınırlamaları vardır. Ribozomal RNA (rRNA) her zaman sırasında yalıtım Ribo Seq deneyler 9,25' elde edilebilir yararlı sıralama okuma veri...

Hücredeki protein ifade yönetmelikte önemli bir rol oynayan temel işlemlerden biri mRNA çevrilmiştir. Bu nedenle, mRNA çeviri sıkı farklı iç ve dış fizyolojik uyaranlar 1,2yanıt olarak kontrol edilir. Ancak, translasyonel düzenleme mekanizmaları çöküşünde kalır. Burada, biz genom çapında miktar mayası çeviri için protokol ribozom profil oluşturma açıklanmaktadır. Ribozom profil çıkarma tekniği genel amacı çalışma ve çeşitli hücresel koşullarda belirli mRNA'ların çeviri ölçmek etmektir. Bu teknik ribozom doluluk genom boyunca kantitatif analiz için yeni nesil sıralama kullanır ve protein sentezi vivo içinde tek kodon çözünürlük 3,4oranı izleme sağlar. Şu anda, bu yöntem protein çeviri düzeyde ölçmenin en gelişmiş araçlar sağlar ve mevcut diğer tekniklerle, örneğin microarrays ortaya bilgi veren yararlı keşif aracı olduğu ispatlanmıştır veya Çeviri Durumu dizi analizi (TSAA) 5. Transkript düzeyleri ve çevirim çıkış birleştirilmiş değişiklikleri ile ilgili raporlar profil oluşturma ribozom da diğer yöntemlerine göre çok daha fazla hassasiyet sağlar.
Bu yaklaşım mRNA parçaları 3ribozom korumalı derin sıralama üzerinde temel alır. Ribozomlarda protein çeviri sırasında korumak ~ 28 nt bölümlerini (ayak izleri olarak adlandırılır) mRNA 6. Ribozom tarafından korunan parçaları dizisi belirleyerek, Ribo Seq ribozomlara çevrilmiş mRNA üzerinde konumunu harita ve mRNA hangi bölgelerinde aktif protein 3,7olarak tercüme edilebilir muhtemeldir tanımlamak. Buna ek olarak, biz kantitatif mRNA tercümesi verilen bir mRNA transkript hizalamak ayak izleri sayısını sayarak ölçebilirsiniz.
Ribozom tarafından korunan parçaları ayırmak için hücre lysates başlangıçta ribonükleaz sindirim tarafından takip ribozomlara oyalamak için bir çeviri önleyici ile tedavi edilir. Ücretsiz mRNA ve ribozomlar tarafından korunmamasına çevrilmiş mRNA'ların bölümlerini ribonükleaz tarafından bozulmuş ise, ribozom korumalı mRNA parçaları sağlam ribozom-ayak izi kompleksleri arındırıcı tarafından elde edilebilir. Bu mRNA ayak sonra cDNA kitaplığa dönüştürülür ve derin sıralama (şekil 1) tarafından analiz. Ribozom profil oluşturma için paralel olarak sağlam mRNA aynı örneğinden ayıklanmış ve sıralı. MRNA bereket ölçümleri ile Ribo-Seq tarafından tanımlanan çeviri düzeyini karşılaştırarak, biz özellikle up - veya aşağı-düzenlenmiş çeviri düzeyde olan genlerin tanımlamak ve mRNA genom geneli düzeyinde verimliliğini çeviri hesaplamak. Bu makalede açıklanan protokol için Maya belirli olmakla birlikte, aynı zamanda diğer sistemlerde Ribo Seq Protokolü kurmaya çalışacağız araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; M membran filtreler</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL santrifüj filtreler (100 kDa MWCO)</td><td>Milipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 4 ° C; C)</td> <td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>%10 TBE-üre jeli</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>%15 TBE-üre jeli</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-üre numune tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>İnvitrojen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenilaz (10 U/&mu; L)</td> <td>Merkez üssü</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Nükleik asit numune yükleme tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>%8 TBE jel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Asit-Fenol: Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125: 24: 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Mavi ışık transilluminatörü</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Krom-çelik boncuklar, 3.2 mm</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Biospec ürünü</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Veri Toplama Sistemi</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Deoksinükleotid (dNTP) çözelti karışımı (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Gradyan fraksiyonlama sistemi</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli DNA polimeraz (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>5X Phusion HF Tamponu ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>Yeni nesil dizileme kitaplığı miktar belirleme kiti</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Nükleik asit jel lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) mRNA izolasyon kiti</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J eksonükleaz (10 U/&mu; L)</td> <td>Merkez üssü</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkriptaz (200 U/&mu; L)</td> <td>İnvitrojen</td><td>18080093</td><td>5X birinci iplikçik tamponu ve 0.1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA parçalanma tamponu</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu; L)</td> <td>İnvitrojen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNaz inhibitörü (20 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Silikon kauçuk kapaklar</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligaz (100 U/&mu; L)</td> <td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>10X CircLigase II tamponu ve 50 mM MnCl ile birlikte verilir < alt > 2 < / alt ></td></tr> <tr><td>paslanmaz çelik mikroşişeler, 1.8 mL</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Yeni Çağ Pompa Sistemleri</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinükleotid kinaz (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>10X T4 polinükleotid kinaz tamponu ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz 2 kesik KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>10X T4 RNA ligaz tamponu ve %50 PEG8000 ile birlikte verilir</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>İnce duvarlı poliallomer tüpler, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV monitörü</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae suşu BY4741</td><td>Açık Biyosistemler</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genom çapında quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

MRNA tercüme proteinler düzenleme birkaç kat içeren karmaşık bir işlemdir. Bu kez değişiklikleri protein sentezi mRNA transkripsiyon değişiklikleri yansıtmak, ama pek çok özel durumlar gözlenmiştir varsayılır. Son zamanlarda, ribozom profil oluşturma (Ribo Seq) adında bir teknik veya kimlik, mRNA hangi bölgelerinde protein ve miktar çeviri genom geneli düzeyinde çevriliyor yüksek doğrulukla sağlar güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Burada, genom çapında miktar Ribo Seq mayası içinde kullanarak çeviri için Genelleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, mRNA bereket ölçümleri ile Ribo Seq veri birleştirerek aynı anda mRNA transkript aynı örnek içinde binlerce çeviri verimliliğini ölçmek ve bu parametreler deneysel cevaben değişiklikleri karşılaştırmak için bize izin verir işlemler veya farklı fizyolojik devletler. Biz üretimi ile birlikte uygun derin sıralama için nükleaz sindirim, bozulmamış ribozom-ayak izi kompleksleri Sükroz degrade ayırma ile yalıtım ve hazırlık DNA kütüphanelerinin kullanarak ribozom ayak izi için detaylı bir protokol tarif Kalite denetimleri doğru analiz vivo içinde çeviri sağlamak için gerekli.

Veri profil oluşturma ribozom bioinformatic çözümlenmesi için detaylı boru hatları-si olmak be daha önce açıklanan 8,9. Buna ek olarak, birçok araştırma grupları farklı gen ifade analizi ve ribozom yöntemi 10,11,12 profil oluşturma için özel sıralama veri işleme için Biyoinformatik araçlarını geliştirdik ,13<...

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Bu prosedürün genel amacı, mRNA'nın hangi bölgelerinin proteinlere çevrildiğini belirlemek, tomurcuklanan maya saccharomyces cerevisiae'deki protein translasyonunu genom çapında düzeyde kantitatif olarak ölçmektir. Ribozom profillemesi, proteinlerin ve hastalıkların oranını izlemek ve translasyonel düzenleme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer yöntemlere kıyasla çok daha fazla hassasiyet katması ve bunlardan proteinleri ve hastalıkları in vivo olarak tek temas çözünürlüğünde ölçmesidir.Bu protokol tomurcuklanan maya için spesifik olsa da, memeli hücreleri ve dokuları gibi diğer model sistemlerde ribozom profili oluşturmaya çalışan araştırmacılar için de yararlıdır. Ekstraktlar, orta log fazına kadar büyütülen maya hücrelerinden hazırlanacaktır. Kültürü 0,45 mikro membran filtrelerden filtrelemek için bir cam tutucu filtre tertibatı kullanın.Peleti spatula ile kazıyın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üç krom çelik 3.2 milimetre boncuğu 1.8 mililitre paslanmaz çelik tüpe koyun ve tüpü sıvı nitrojen içinde önceden soğutun. Dondurulmuş peletleri ekleyin ve çelik boruyu silikon kauçuk bir kapakla kapatın.Numuneyi 4200 rpm'de 10 saniye boyunca kriyo-öğütme ile homojenize edin. Numuneleri tüm öğütme prosedürü boyunca donmuş halde tutmak için, tüpü her öğütme arasında en az 10 saniye sıvı nitrojen içinde soğutmak çok önemlidir. Homojenizasyon tamamlandığında, numuneye sikloheksimid içeren bir mililitre lizis tamponu ekleyin.Pipetleyerek iyice karıştırın ve numuneyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez g santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Poli(A)mRNA izolasyonu için 100 mikrolitre lizatı başka bir yeni 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Sıvı nitrojende ayak izi ekstraksiyonu için kullanılacak olan lizatın geri kalanındaki mRNA örnekleriyle tüpleri hızlı dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ayak izi ekstraksiyonundan önceki gece, önceden hazırlanmış sakaroz gradyanlarını dört santigrat derecede çözdürün.Ertesi gün, hücre lizatını buz üzerinde çözün. 50 OD260 birimi içeren bir hücre lizat alikotunu yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın, bir mililitreye kadar taze lizis tamponu ve 10 mikrolitre RNase ekleyin. Oda sıcaklığında, bir saat boyunca topuklu bir döndürücü üzerinde hafifçe döndürerek inkübe edin.Daha sonra, lizat örneğini polimer tüplerde %10 ila %50 sükroz gradyanının üzerine nazikçe katmanlayın. Bir SW41 ti rotor kullanarak, üç saat boyunca dört santigrat derecede 35.000 rpm'de ultra santrifüj edin. Ultra setifrigasyon sırasında, gradyan fraksiyonlama sistemini kurun.Bileşenleri açın ve UV monitörünün en az 30 dakika ısınmasına izin verin. Şırıngayı kovalama solüsyonu ile doldurun ve şırınga ve kanül içindeki hava kabarcıklarını temizleyin. Ultrasantrifüjleme tamamlandığında, sükroz gradyanını içeren ultrasantrifüj tüpünü takın ve delin.Şırınga pompasını dakikada bir mililitre ile başlatın ve A254 değerlerini izlerken bir mililitre fraksiyonları toplayın. ADS monozom zirvesini temsil eden fraksiyonlar toplanır ve bir araya getirilir. Fraksiyonları 0.5 mililitrelik santrifüj filtrelerden 12.000 kez g'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede süzün, akışı atın ve hacim 100 mikrolitreden az olana kadar tekrarlayın.Pipetleme ile karıştırılan 400 mikrolitre serbest bırakma tamponunda 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, üniteyi yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Akışı toplayın. Daha sonra, ayak izi parçalarını saflaştırın ve metin protokolünde açıklandığı gibi etanol çökeltme kullanarak numuneleri çökeltin.Bu prosedüre başlamak için, çökeltilmiş ayak izini ve parçalanmış mRNA örneklerini 30 dakika boyunca 20.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Etanolü çıkardıktan ve peletleri havayla kuruttuktan sonra, her peleti 7.75 mikrolitre suda askıya alıyoruz. Her pelete bir mikrolitre 10XT4 polinükleotid kinaz tamponu, bir mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ve 0.25 mikrolitre RNaz inhibitörü ekleyin.Bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her ayak izi ve mRNA örneğinin 10 mikrolitresine 10 mikrolitre 2X TBE üre örnek tamponu ekleyin. Numuneleri ve uygun kontrolleri 75 santigrat derecede üç dakika inkübe edin, döndürün ve bir dakika boyunca buza koyun.Her numuneyi %15'lik bir TBE üre jelinin iki kuyucuğuna yükleyin ve RNA parçalarını bir saat boyunca 180 voltta jel elektroforezi ile ayırın. Jeli, beş dakika boyunca ışıktan korunan bir nükleik asit jel lekesi ile boyayın. Jeli mavi ışıklı bir transilluminatör altında görselleştirirken, ayak izi örnekleri için 28 ila 32 nükleotid ve mRNA örnekleri için yaklaşık 50 ila 70 nükleotid arasında uygun bandı kesin.Poliakrilamid jelden RNA'yı çıkarmadan önce eksize edilen poliakrilamid jel parçalarını eksi 80 santigrat derecede en az 10 dakika dondurun. Ters transkripsiyondan önce, üç ana adaptör ligasyonu gerçekleştirin ve numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi çökeltin. Her peleti 11,5 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.Daha sonra 0.5 mikrolitre sekiz mikromolar ters transkripsiyon astarı ve bir mikrolitre dNTP karışımı ekleyin. 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. Her numuneye dört mikrolitre 5x birinci iplikçik tamponu, iki mikrolitre 0.1 molar DTT, 0.5 mikrolitre RNaz inhibitörü ve 0.5 mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.48 santigrat derecede 30 dakika, 65 santigrat derecede bir dakika ve 80 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Her numuneye 0.8 mikrolitre iki molar sodyum hidroksit ekleyerek ve 98 santigrat derecede 30 dakika inkübe ederek hemen RNA'nın hidrolizine geçin. Reaksiyonu nötralize etmek için 0.8 mikrolitre iki molar hidrojen klorür ekleyin.Numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi çökelttikten sonra, her peleti beş mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ve beş mikrolitre 2x TBE üre numune tamponu ekleyin. 75 santigrat derecede üç dakika inkübe edin, döndürün ve bir dakika buzlayın. Numuneyi %10 TBE üre jelinin bir kuyucuğuna yükleyin.Ters transkripsiyon reaksiyonunun ürünlerini 50 dakika boyunca 180 volt jel elektroforezi ile ayırın. Jeli, beş dakika boyunca ışıktan korunan bir nükleik asit jel lekesi ile boyayın. Bir mavi ışık transilluminatörü kullanarak, bandı yaklaşık 128 nükleotid ve daha yüksek çıkarın.Poliakrilamid jelden DNA'yı çıkarmadan önce poliakrilamid jel parçalarını eksi 80 santigrat derecede en az 10 dakika dondurun. DNA'yı dairesel hale getirmek için, her bir DNA peletini 16.75 mikrolitre nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. İki mikrolitre 10x tek sarmallı DNA ligaz tamponu, bir mikrolitre 50 milimolar manganez klorür ve 0.25 mikrolitre tek sarmallı DNA Ligaz ekleyin.Bir saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin, ardından 10 dakika boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Çökeltme olmadan, tek sarmallı DNA ligasyon reaksiyonu ürününü eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi PCR kütüphane amplifikasyonunu ve ardından kütüphane nicelleştirmesini ve yüksek verimli dizilemeyi gerçekleştirin.PCR amplifiye edilmiş ayak izi kütüphanesinin temsili biyoanalizör profilleri ve mRNA örnekleri için elde edilen dizileme kütüphanesi gösterilmektedir. Ayak izi kütüphanesinin beklenen ortalama boyutu 148 ila 152 nükleotiddir ve mRNA kütüphanesinin beklenen boyutu 170 ila 190 nükleotiddir. Bu grafik, vahşi tip bir numunenin iki bağımsız biyolojik kopyası ve hbs1 delesyon mutantı için elde edilen mRNA, ayak izi ve rRNA okumalarının birleşik sayısını gösterir.Ayak izi kitaplıklarındaki tüm sıralı okumaların %50 ila %60'ı ribozom korumalı ayak izi parçalarına karşılık geldi. Buna karşılık, mRNA kütüphanelerinde rRNA fragmanlarının sadece %3'ü gözlendi, bu da poli(A)mRNA izolasyonunun rRNA okumalarının etkili bir şekilde ortadan kaldırılmasına izin verdiğini gösterdi. Hem ayak izi hem de mRNA numune kitaplıkları, eşleşen numuneler arasında yaklaşık 0,99'luk bir Pearson korelasyon katsayısı ile gösterildiği gibi iyi tekrarlanabilirlik gösterir.mRNA bolluk ölçümleri ile birleştirildiğinde, ribozom profili, deneysel koşullar arasındaki translasyon verimliliğindeki değişikliklerin ölçülmesine izin verir. Hbs1 delesyon mutantındaki önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genler, mRNA transkripsiyonundaki bir değişiklikten, translasyon verimliliğinden veya ortak bir etkiden etkilenip etkilenmediklerine göre gruplandırılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm protokol yaklaşık 11 gün içinde gerçekleştirilebilir.Bu prosedürü denerken, RNaz kontaminasyonunu önlemek ve numunelerde RNA bozulması riskini azaltmak için eldiven giymeyi ve tüm adımları RNaz içermeyen reaktifler ve sarf malzemeleri kullanarak gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, nükleaz sindirimi kullanarak ribozom ayak izlerinin nasıl oluşturulacağını, sakaroz gradyan fraksiyonasyonu ile bozulmamış ribozom ayak izi komplekslerinin nasıl izole edileceğini ve derin dizileme için DNA kitaplıklarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Sıvı nitrojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve aşırı soğuk malzemelerle çalışırken her zaman koruyucu gözlük ve kriyo eldiven takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Öğrenin ribozom profil oluşturma yöntemiyle Saccharomyces cerevisiae'de genom çapında protein çevirimini nicel olarak ölçmeyi. Bu hassas teknik translasyonel regülasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Daha fazla video keşfet