Name: Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, silikon kültür insertleri kullanarak bronşiyal epitel hücrelerinin göçünü değerlendirmek için bu yara iyileşme analizini. Bu yöntem, hücre göçü ve yara kapanışı hakkında hızlı, tekrarlanabilir nicel veriler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Sapienza Roma Üniversitesi ve İtalyan Kistik fibrozis araştırma Vakfı (proje Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny ve Pavia FFC heyetleri tarafından benimsenen FFC #11/2014) fon tarafından desteklenmiştir. Bu eser parçası da FILAS Grant Prot FILAS-RU-2014-1020 tarafından desteklenmiştir.
Bronş epitel hücreleri sağlamak için Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, İtalya) için minnettarız.

1. hücre hazırlık
<ol><li>Tohum 2.5x106 hücre 10 ml, en az gerekli orta (2 mM glutamin (MEMg), ile desteklenmiş MEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), antibiyotik (penisilin ve streptomisin 0.1 mg/mL) ve puromisindir (0,5 µg/mL seçimi ve bakımı için hücre satırı) bir T75 şişesi içinde. 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye 2 gün kuluçkaya. Deneme başlamadan önce kesiştiği yerde ters bir mikroskop altında hücre kontrol. Not: deneme için kullanılan ölümsüzleştirdi insan bronş epitel hücreleri puromisindir direnci veriyor lentiviral bir vektör ile transduced hücrelerdir. Stabil bir işlevsel CFTR14,15hızlı.</li>
	<li>Hücre izdiham 90-0 ulaşmıştır sonra şişeye ortamından Aspire edin ve biyolojik güvenlik kabin sınıfı II altında bir atık şişe içine atın. 6 mL tamponlanmış fosfat hücrelerle serum kalsiyum ve magnezyum (CMF-PBS) yıkayın. Yavaşça şişeye el ile kaya ve CMF-PBS atın. Not: pipet ile hücre monolayer dokunmamaya dikkat et.</li>
	<li>CMF-PBS 10 mL ekleyin ve 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
	<li>CMF-PBS Aspire edin ve o atın. Sonra tripsin/EDTA 2 mL şişe için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça tamamen hücreleri ceket ve hücreleri gözle görülür bir mikroskop altında müstakil kadar 10 dk 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya çözüm sağlayan şişesi, rock. Not: kuluçka süresi sonunda, yuvarlak ve değil bağlı plastik yüzey hücreleri görünmelidir. Hücreleri de müstakil değilseniz, manuel ajitasyon gerekli olabilir.</li>
	<li>MEMg artı % 10 10 mL ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakın ve şişeye alt yıkayarak hücreleri toplamak için. Birimin bir konik 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>Tüp 80 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve MEMg artı % 10 6 mL hücrelerde yeniden askıya FBS. Tekrar tekrar herhangi bir kümeleri kadar kırmaya pipet.</li>
	<li>Bir micropipette ile hücre süspansiyon 10 µL çıkar ve birimin kapak daha önce Burker veya Neubauer odası üzerinde koymak cam altında enjekte.</li>
	<li>Hücre sayısı.</li>
</ol>2. hücre kültüründe tohum ekler
<ol><li>12-şey plaka her kuyuya, kültür Ekle steril cımbızla (şekil 1) aktarın. Plaka yüzeyine düzeltmek için ekler kenarları boyunca basın için cımbız kullanın. Not: Yapışma sağlar bir yapışkan alt ekler var.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> Resim 1 : Düzgün bir 12-şey plaka kuyu koymak silikon kültür ekler, şematik gösterimi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>Düzgün hücre süspansiyon MEMg artı % 10 oranında seyreltin FBS. Her Bölmesi ekleme hücre süspansiyon (yaklaşık 3.5x104 hücreleri/odası), 70 µL ile doldurun. Not: Her kompartımanda uygulanan hücre yoğunluğu hücre türüne göre değişir. Bu izdiham 24 h içinde tamamlamak için yol açar bir hücre yoğunluğu kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Mikroskop altında Hücre Ekle bölmeleri sızıntı değil ve 37 ° C ve % 5 CO224 h 12-şey plaka kuluçkaya kontrol edin.</li>
</ol>3. sözde yara iyileşme tahlil
<ol><li>Kuluçka sonra hücreleri Konfluent hücre monolayers oluşmuş doğrulamak için ters mikroskop altında görselleştirin.</li>
	<li>Test bileşikler (Örneğin, amper) 1 mL MEMg yeniden askıya alma. Not:-20 ° C'de depolanan stok çözüm başlayarak taze amper dilutions hazırlamak</li>
	<li>Yavaşça ekler tarafından steril cımbız kaldırmak. Hücre monolayers kırmamaya dikkat et. Ekler emici kağıt üzerine aktarın. Not: aynı ekler yeniden kullanmak için onlara en az 3 h için % 70 etanol içinde sterilize. Bu daha sonra çöpe önerilir.</li>
	<li>Yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için iyi bir micropipette kullanarak başına MEMg 1 mL ekleyin. Plaka kapatın ve yavaşça salla. Not: Orta kendi kesintileri önlemek için doğrudan hücre monolayers üstüne eklemeyin.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve MEMg 1 mL de başı ile değiştirin. Plaka kapatın ve bir video kamera ile donatılmış 4 X büyütme, ters mikroskop altında (ekler tarafından oluşturulan) boş hücre boşlukları görselleştirmek. Görüntüleri (T0) zaman sıfır ve bir .jpg biçiminde kaydedebilirsiniz.</li>
	<li>Orta kuyulardan kaldırmak, PBS ile 1 mL yıkar ve o atın.</li>
	<li>(3.2 noktada hazır) test bileşikler wells için ekleyin. Tedavi edilmemiş kontrol örnekleri için MEMg 1 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>15, 20 ve 24 h tedavi sonra 4 X büyütme, mikroskop altında hücre göç gözlemlemek ve görüntüleri. Not: Bu adım sırasında esir alma imge T0 gelince aynı alanlarda çalışın. Hangi imge esir alma zaman aralıkları seçim hücre geçiş hızına bağlıdır.</li>
	<li>Bazı seçmeli inhibitörleri, Yani AG1478, hücre göç, etkisini incelemek için ekler kaldırmadan önce her INSERT bölmesi ortamından Aspire edin.<ol>
<li>Her bölmesi taze MEMg ile yıkayın ve MEMg AG1478 ile desteklenmiş 70 µL ile doldurun.</li>
		<li>3.3 noktasından açıklandığı gibi kuluçka 37 ° C ve %5 CO230 dk sonra devam. Not: çamaşır adım ve hücre monolayers belirli inhibitörleri ile ön sırasında ekler kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Üzerinde ikmal-in deneme, görüntüleri çeşitli deneysel grupları en iyi temsil eden örnekleri seçin ve T0, T15, T20 ve T24 h tek görüntüleri içeren bir ZIP dosyası oluşturun. Not: Tek görüntüleri tüm örnekleri için seçilen zaman aralıklarında alınır. Triplicates en az üç kez tekrarlanan her deneme için çalıştırın. Sonunda, tüm deneysel grupları, en az 3 fotoğraf ("a", "b", "c", her bağımsız deneyden türetme vb,) için her zaman noktası analiz edilir.</li>
	<li>Belgili tanımlık fermuar eğe içine otomatik olarak seçilen zaman noktalarda (yüzde) olarak cep kaplı ve kazı bölgelerinden deneysel verileri içeren bir elektronik tablo Özet dosya e-posta yoluyla sağlayan görüntü analiz yazılımı yükleyin. Not: Öncü ve gap alanının tanınması büyük ölçüde kenar algılama yöntemi (hangi keskin görüntü parlaklığını değiştirir noktaları belirlenmesi amaçlı) temel alır.</li>
	<li>Verileri kaydetmek ve onları toplamak. Ortalama değer açısından tüm verilerin zaman sıfır normalleştirmek. Her zaman noktası ve göreli standart hata (SEM) tüm çoğaltır normalleştirilmiş veri ortalama değerini hesaplamak. İki yönlü Varyans analizi (ANOVA) kullanarak, uygun istatistik yazılımı ile istatistiksel analiz yapmak. Peptid tedavi grupları ve farklı zaman aralıklarında kontrol grubu arasında farklılıklar istatistiksel olarak signiﬁcant bir piçin olmak olarak kabul edilir &lt; 0,05.</li>
	<li>Elde edilen verileri seçili zaman aralıkları tüm örnek gruplar karşı hücre bölgeyi yüzdesini gösteren bir çubuk grafik, bir grafik çizmek.</li>
</ol>

<ol><li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25813429">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li>
<li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complicated+skin%2C+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li>
<li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+wound+healing%3A+biological+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li>
<li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li>
<li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li>
<li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology%3A+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li>
<li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPed+up+immunity%3A+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li>
<li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner%3A+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?</a> PLoS One. 10, e0128663(2015).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li>
<li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration%3A+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li>
<li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li>
<li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li>
<li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li>
<li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li>
<li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li>
<li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Hücre göç yara iyileşmesi, embriyonik gelişim ve kanser metastaz dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli bir süreçtir. Hücre göç vitro çalışma temel yordamı içerir: (i) bir hücre monolayer, (ii) hücreleri, Konfluent tabakası sözde bir yarada üretimi oluşturulması (III) yara kadar farklı zaman aralıklarında görüntüleri yakalama kapatma ulaştı , (iv) seçilen hücreleri geçiş hızını ölçmek için görüntü sırası analizi.
Sonuçlarımız kültür ekler uygulanması objekti...

Büyük ölçüde hayvanlarda yara iyileşmesi bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma1sonra yeniden kurmak için temel bir süreç olduğu bilinmektedir. Epitel yüzeyleri dış ortama (Örneğin, deri, solunum sistemi ve gastrointestinal yolları) maruz rağmen fiziksel ve kimyasal hakaret üzerinden koruyucu bir bariyer oluşturmak, yara oluşumu kolayca, özellikle sonra oluşabilir cerrahi veya mikrobiyal enfeksiyonlar2. Örnek olarak, akciğer dokusu tarafından Kistik fibrozis (CF) olanlar, özellikle de fırsatçı bakteriyel pathogen Pseudomonas aeruginosa, kolonizasyon sonucu solunum yetmezliği3airways epitel, zarar yol açar, 4. Yara iyileşmesi bir yaralı doku5normal mimarisini geri yüklemek için bir karmaşık ana bilgisayar onarım mekanizmadır. Epithelialization, anjiogenez ve kolajen üretimini ve hücre farklılaşması6,7,8 ile doku remodeling kapsayan bir yenilenme dönemi ardından ilk inflamasyon ile karakterizedir . Epitel bütünlüğünü güvenceye almak için ve mikrobiyal nükleer silahların yayılmasına karşı denetlemek için tüm canlıların savunma molekülleri, antimikrobiyal peptidler (Amper)9,10dahil üretmek. İşlem şifa yara vitro hücre artıkları ve farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler eksikliği nedeniyle benzetimini yapmak çok zordur. Ancak, uyararak sözde bir yara kapatma hızlandırmak için bir peptid vitro yeteneğini epitel hücrelerinin geçiş güvenliği aşılan bir epitel iyileşmek için onun yetenek gösterge. Gerçekten de, hücre göç yara iyileşmesinde hızı sınırlaması olay ve hücre geçiş etkileyen faktörler eğitim geliştirilmiş yara iyileşmesi için hedef tedaviler için yardımcı olacaktır.
Burada, bir çok tekrarlanabilir deneysel tahlil hücre göç içinde vitrodeğerlendirmek için özel silikon kültür ekler göre sağlanır. Konfluent hücre monolayer üzerinde 500 mikron boşluk (sözde yara) oluşturulması dayanmaktadır. Hücreler yapay "yaralı" alanının kenarındaki boş hücre alanına geçiş, yeni hücre-hücre kişiler şekillendirme başlar. Kültür Ekle hızlı yara deneyler şifa için yeni bir araç temsil eder. 500 mikron duvar tarafından ayrılmış iki rezervuarlar sağlanır ve düzgün bir 3 cm tabak tabak içine veya iyi bir 12-şey plaka yerleştirilebilir. Her Bölmesi ekleme bir hücre süspansiyon ile doldurma hücreleri ekleme kaldırma yaklaşık 500 mikron (ayrılık duvar aynı genişlikte) bir temiz boş hücre boşluk doğurmak iken izdiham kadar belirlenmiş her alanda büyümeye sağlar. Bir uygun hücre kültür testi karışımla takıma orta sonra amacına eklenebilir plaka/iyi. Daha sonra boşluğu kapatma ters bir mikroskop, tercihen bir resim alma için bir video kamera ile donatılmış altında farklı zaman aralıklarında görüntülenir. Son olarak, ölçüm değişiklikleri web tabanlı otomatik görüntü analiz programı tarafından cep kaplı alanda yaranın kapanması ve hücre geçiş hızını miktar sağlayacaktır. Genel olarak, bu yöntem klasik tahlil, burada bir çizik bile el ile steril bir iğne ile Konfluent hücre monolayers incising tarafından yapılır veya bir pipet ipucu11ile ilgili bir adım olur. Nitekim, son işlem plastik alt yemeğin yok edebilir plaka/iyi ve kırışıklıkları oluşturma yüzey kaplama. Buna ek olarak, bu son derece iğne/ipucu için araştırmacılar tarafından uygulanan basınç bağlı olarak "yaralı" alan iyi tanımlanmış genişlik boşluğu, tüm uzunluğu boyunca sahip değil. Ayrıca, yerinden çıkar hücreleri çizik kenarları canlı ve ölü hücreleri kümeleri oluşturabilir; Ayrıca, canlı hücreler "yaralı" alanının Yayilim sigara tekrarlanabilir sonuçlar12üreten hücre geçiş hızı ile etkileyebilir.
Ayrıca, sıfırdan görüntü analiz platformu sayesinde kullanıcılar hızla (dakika içinde) ek yazılım edinme gerekliliği olmadan Seçili hücrelerin göç davranışı üzerinde Nicel veri alabilir. Bu platform faz kontrast mikroskobu görüntülerini düşük (~ 5 X), orta (~ 10 X) ve yüksek (~ 20 X) büyütme analiz yeteneğine sahiptir. Görüntülerin (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff biçimi) bir zip dosyası yükledikten sonra analiz otomatik olarak alan hücre örtülü ve Karalama alanı yüzdesini, hem de hücre hızını gösteren bir Özet dosyası oluşturmak için yapılır göç, farklı zaman aralıklarında.
Bu çalışmada, bir kurbağa-cilt AMP-Türev, Yani Esc(1-21) ve onun diastereomer Esc(1-21) - 1 c13ve fonksiyonel CF transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)14,15ifade bir bronş hücre satırı kullanarak, peptid indüklenen hücre göç tedavi edilmemiş (kontrol) örnekleri ile karşılaştırıldığında bir örnek sağlanmıştır. Hava yolu epitel ve CFTR akciğer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynamak unutmayın ve onarım16yara. Ayrıca, selektif inhibitörü (Örneğin, AG1478)17 epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) aracılığıyla, geçiş bronş hücre tarafından yukarıda belirtilen peptidler indüklenen kanıt EGFR12aktivasyonu içerir, 18 bildirilir.
Özet olarak, bu yordam nasıl böyle silikon kültür ekler kullanımı doğru göç yapışık hücreleri (Örneğin, bronş epitel hücreleri) ve moleküler belirlemek için hızlı ve kolayca erişilebilen bir tahlil temsil ettiğini göstermek için hedeftir Bu tür olayları kontrol mekanizmaları.

<table><tbody><tr><td>Minimum esansiyel ortam (MEM)&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>37 &°C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA 1X PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Kullanmadan önce oda sıcaklığında ısıtın</td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum (PBS) içeren DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Kültür-Insert 2 kuyulu</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Görüntü Analizi</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM yazılımı&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>sürüm 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

roman vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Bu çalışmanın amacı, antimikrobiyal peptidler (Amper), hücre göç teşvik etmek gibi bazı immunomodulatory molekülleri yeteneği değerlendirmek için yeni bir yöntem göstermektir. Önemlisi, hücre geçiş bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma sonra yeniden kurmak için yara iyileşme sürecinde bir hızı sınırlaması olayı değil. Bu yöntemin avantajı üzerinden el ile yapılan bir çizik içinde bir hücre monolayer dayanır, klasik tahlil özel silikon kültür kullanımı iyi tanımlanmış genişlik (500 mikron ile bir boş hücre sözde yara alan oluşturmak için sağlayan iki bölmeleri ekler olduğunu ). Buna ek olarak, bir otomatik görüntü analiz platformu nedeniyle hızla yaranın kapanması ve hücre geçiş hızı üzerinde nicel verileri elde etmek mümkündür. Daha doğrusu, iki kurbağa-cilt amper etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş-ecek var olmak göstermek. Ayrıca, ön bu hücrelerin belirli inhibitörleri ile bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizmaları üzerinde bilgi sağlar.

Bu iletişim kuralı etkisi Esc(1-21) ve Esc(1-21) - 1 c fonksiyonel CFTR ifade bronş epitel hücreleri indüklenen hücre göç etkinlik açısından şifa yara belirlemek için kullanıldı. Bu tahlil, kültür ekler bir 12-şey plaka wells yerleştirildi ve her bölmesi MEMg % 10 ile desteklenmiş 35.000 hücreleri ile seribaşı FBS. Hücreleri 24 h içinde tam izdiham sonra ulaştı, bir 500 mikron boşluk oluşturulur ve her şey peptid farklı konsantrasyonlarda içeren MEMg doluydu. Deneme dört kez tekrarlandı. ...

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Bu prosedürün amacı, bazı immünomodülatör moleküllerin, örneğin antimikropeptitlerin, yara iyileşme sürecinde hız sınırlayıcı bir olay olan hücre göçünü uyarma yeteneğinin nasıl değerlendirileceğini göstermektir. Genel olarak konuşursak, hücre göçünü in vitro olarak incelemek için temel prosedür, hücre tek tabakasının oluşturulmasını, yalancı yara üretimini, yara kapanmasına ulaşılana kadar farklı zaman aralıklarında görüntülerin yakalanmasını ve hücre göçünü ölçmek için görüntü dizisinin analizini içerir. Şimdi, bu yöntemin elle yapılan bir çiziğe dayanan klasik tahlillere göre avantajı, tamamen hücresiz ve çok iyi tanımlanmış bir genişliğe sahip olan 500 mikrometre yalancı yara alanını oluşturmak için özel silikon kültür eklerinin kullanılmasından kaynaklanmaktadır.Ek olarak, web tabanlı, otomatik bir görüntü analiz programı sayesinde, yara kapanma hızı ve hücre göçü ile ilgili nicel verileri dakikalar içinde hızlı bir şekilde almak mümkündür. Genel olarak, bu, çok yüksek veri tekrarlanabilirliğine sahip her türlü yapışık hücreye uygulanabilen güvenilir bir deneysel tekniktir. Burada, örnek olarak, bir kurbağa derisi antimikropeptidinin bronşiyal epitel hücrelerinin göçü üzerindeki etkisi ve bu hücrelerin spesifik inhibitörlerle ön tedavisinin bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizma hakkında nasıl bilgi verebileceği verilmiştir.Daha kesin olarak, peptit kaynaklı hücre göçünün epidermal büyüme faktörü reseptörünün aktivasyonunu nasıl içerdiği gösterilecektir. Deneye başlamak için, hücre içeren şişeyi hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve otomatik bir görüntü elde etme sistemi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta çevresini kontrol edin. Tam birleşmenin %90'ına ulaşılırsa, bir biyogüvenlik başlığına geçin ve steril koşullar altında 10 mililitrelik plastik bir pipet kullanarak kültür ortamını dikkatlice aspire edin ve ortamı yavaşça atık şişesine atın.Hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen altı mililitre PBS ile yıkayın, yani CMF. Şişeyi manuel olarak hafifçe sallayın ve CMF'yi atın. Ardından, hücre kalıntılarını ve bağlı olmayan hücreleri daha da temizlemek için başka 10 mililitre CMF ekleyin.Bu noktada, şişeyi kapatın ve 10 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Şişeyi çıkarın, CMF'yi atın ve hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için yavaşça iki mililitre tripsin-EDTA ekleyin. Şişeyi manuel olarak hafifçe sallayın, çözeltinin hücreleri tamamen kaplamasına izin verin ve şişeyi 10 dakika daha inkübe edin.Daha sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın ve tripsin ekleme işleminin tamamlanıp tamamlanmadığını kontrol edin. Bu durumda, hücreler süspansiyon halinde olacak ve mikroskop altında yuvarlak görünecektir. Tripsini inaktive etmek için,% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş sığır serumu ile desteklenmiş 10 mililitre kültür ortamı ekleyin ve şişeyi dikkatlice yıkayın.Hücre süspansiyonunu toplayın, bu hacmi konik 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve numuneyi santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, pelet oluşumunu kontrol edin, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini serum ile takviye edilmiş altı mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Herhangi bir topak oluşumunu parçalamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.Bu işlem birkaç dakika sürebilir. Daha sonra, bir mikropipet ucu ile 10 mikrolitre çıkarın ve hacmi bir Burker veya Neubauer odasının kapak camının altına enjekte edin ve hücre numarasını sayın. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, steril cımbız yardımıyla kültür ekini yerleştirin.Her bir parça, 500 mikrometrelik bir duvarla ayrılmış iki bölmeden oluşur ve yapışmayı sağlamak için yapışkan bir alt taraf vardır. Bununla birlikte, cımbız vasıtasıyla, plakanın yüzeyine sabitlemek için kesici uç kenarları boyunca biraz baskı uygulayın. Ek parçanın her bir bölmesini, oda başına yaklaşık 3,5 x 10 ila dördüncü hücre içeren 70 mikrolitre hücre süspansiyonu ile doldurun.Daha da önemlisi, her bir bölmeye uygulanan hücrelerin konsantrasyonu, hücrelerin tipine bağlıdır. 24 saat içinde tam birleşmeye yol açan bir hücre yoğunluğu kullanılması önerilir. Dört kat büyütmede mikroskop altında, hücrelerin ek bölmelerden sızmadığını kontrol edin ve ardından plakayı 24 saat inkübe edin.İnkübasyondan sonra, hücre tek katmanlarını kırmadan ekleri steril cımbızla nazikçe çıkarın ve eki emici kağıda aktarın. Hücreleri kuyucuk başına bir mililitre ortam ekleyerek yıkayın. Bozulmalarını önlemek için ortamı doğrudan hücre tek katmanlarının üzerine eklememeye dikkat edin.Plakayı kapatın ve elle hafifçe sallayın. Ortamı aspire edin ve oyuk başına bir mililitre taze ortam ile değiştirin. Hücresiz boşlukları mikroskop altında görselleştirin ve sıfır zamanında görüntüler elde edin.Ortamı kuyulardan çekin ve kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş PBS ekleyin. Plakayı sallayın, PBS'yi çıkarın ve son olarak test bileşiklerini kuyucuklara ekleyin. İşlenmemiş kontrol numuneleri için bir milimetre ortam kullanılır.Plakayı inkübe edin. Her numune için, mikroskop altında dört kat büyütmede hücre göçünü gözlemleyin ve 15, 20 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra görüntüler elde edin. Bu adım sırasında, sıfır zamanı ile aynı alanlarda görüntü yakalamaya çalışın.Görüntülerin yakalandığı zaman aralıklarının seçimi, seçilen hücrelerin geçiş hızına bağlıdır. Deneme bittiğinde, her örnek için farklı zaman aralıklarında görüntüler seçin ve bir zip dosyası oluşturun. Her zaman aralığında her numune için en az üç kopyaya sahip olmak önemlidir.Otomatik Görüntü Analizi Wimasis programını açın ve en düşük büyütme oranını kullanarak zip dosyasını yükleyin. Program, seçilen zaman noktalarında her bir numunenin, örneğin 1a ve 2a numunelerinin yüzdeleri olarak hücre kaplı alanın ve çizik alanlarının deneysel verilerini içeren bir özet dosyasını otomatik olarak e-posta ile sağlayacaktır. Sıfır zamanında tüm örneklerin ortalama değerini hesaplayın.Tüm verileri sıfır zamanındaki ortalama değere göre normalleştirin. Her bir zaman noktasındaki tüm numunelerin ortalama değerini ve ilgili standart hatayı hesaplayın. İki yönlü ANOVA testi kullanarak istatistiksel analiz yapın.Elde edilen veriler, farklı örnek grupları için farklı zaman noktalarında hücre kaplı alanın yüzdesini gösteren bir histogram olarak bir grafiğe çizilebilir. Bu histogramlar, kontrole kıyasla farklı konsantrasyonlarda antimikropeptit esculentin 1-21-1c veya esculentin 1-21 ile bronş hücrelerinin 15, 20 ve 24 saatlik tedavisinden sonra elde edilen yara kapanmasını göstermektedir. Histogramlar ve bazı temsili mikrograflar tarafından belirtildiği gibi, esculentin 1-21-1c, bir mikromolarda yaklaşık 20 saat içinde yara alanının neredeyse tamamen kapanmasında indüklenen bronşiyal hücrelerde yalancı yaranın yeniden epitelizasyonunu teşvik etmede daha etkilidir, esculentin 1-21, yani 10 mikromolar için daha yüksek bir konsantrasyon gereklidir.Epidermal büyüme faktörü reseptörü gibi bazı reseptörlerin hücre göçü üzerindeki rolünü incelemek için, hücre tek katmanlarını spesifik bir inhibitör, örneğin AG1478 bileşiği ile ön işlemden geçirin. Bu amaçla, eki çıkarmadan önce, ortamı her bölmede aspire edin, bir kez yıkayın ve beş mikromolar AG1478 ile desteklenmiş 70 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 30 dakika inkübe edin.Ardından, eki cımbızla çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi devam edin. Bunlar, peptit kaynaklı hücre göçünün epidermal büyüme faktörü reseptörünün aktivasyonunu içerdiğini gösteren nihai verilerdir. Gerçekten de, inhibitör AG1478 ile ön işlemden sonra, hücre kaplı alanın yüzdesi, hücreler peptit eklenmeden önce AG1478 ile önceden inkübe edilmediğinde bulunan sonuçlara kıyasla tüm zaman aralıklarında önemli ölçüde azalır.Sonuç olarak, tarif edilen yöntem, farklı hücre tiplerinin göç etme özelliğinin yanı sıra en umut verici yara iyileşme destekleyicilerinin ve / veya inhibitörlerinin seçimi konusundaki anlayışı kısa sürede ve yüksek doğrulukla önemli ölçüde geliştirme potansiyeline sahiptir.

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, murin miyoblastlarının göç kapasitesini değerlendirmek için temassız bir ko-kültür yara iyileşme testi açıklanmaktadır. Bu, in vitro olarak parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerinin sinyal gönderen ve sinyal alan bileşenlerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Murin Miyoblastlarının Ko-Kültürdeki Göç Kapasitesini Değerlendirmek için Yara Testi

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Burada, bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının bir yarı-yüksek verimli hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu protokol, bir hücre tek tabaka üzerinde tutarlı çizik yaraları oluşturmak için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.

In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Öğrenin, silikon kültür insertleri kullanarak bronşiyal epitel hücrelerinin göçünü değerlendirmek için bu yara iyileşme analizini. Bu yöntem, hücre göçü ve yara kapanışı hakkında hızlı, tekrarlanabilir nicel veriler sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Daha fazla video keşfet