Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması
25 Ocak 2018
Bu iletişim kuralı sıçan hindlimb iskelet kas uyarımı kaynaklı uyarlamalar gözlemlemek için egzersiz kronik contractile etkinlik modeli açıklar.
Egzersizin kronik kasılma aktivitesi modeli, in vivo olarak egzersiz eğitimi uyaranlarına iskelet kası adaptasyonlarını incelemek için yararlıdır. Özellikle, bu model yedi gün içinde altı haftalık bir eğitim protokolünün fenotipik adaptasyonlarını ortaya çıkarır. Bu yöntem, mitokondriyal biyogenez, otofaji ve egzersizle ilişkili diğer birçok hücresel adaptasyon gibi kas fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, birkaç ay gerektiren diğer egzersiz eğitim protokollerine kıyasla yedi günlük kısa bir süre boyunca kas spesifik adaptasyonların gözlemlenmesine izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, kas atrofisi yaşlarının tedavisine kadar uzanır, çünkü kronik kas stimülasyonunun yaşlanmaya bağlı kas zayıflığını iyileştirmede bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, ortak peroneal siniri işaretleme ve her iki uca elektrik bobinleri takma zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir, çünkü bunlar pratik ve hassasiyet gerektirir.
Sıçanı oksijenle% bir ila 3 izofluran inhalasyonu altında uyuşturarak başlayın ve arka bacak ayak parmağı tutamına yanıtı kontrol ederek ve solunum derinliğini ve hızını gözlemleyerek tam sedasyonu onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere oküler kayganlaştırıcı uygulayın ve fareyi düşük ila orta ayarda bir ısıtma yastığına yerleştirin. Sol arka bacak ve boynun arkasından gövdenin etrafına, ön ayakların arkasına ve ön göğüs boyunca bir şeridi nazikçe tıraş edin.
Dezenfekte etmek için traşlı alanları iyot ve etil alkol ile nazikçe silin. Hayvan yüzüstü yatarken, traş edilen bölgenin ortasında, boynun arkasında yaklaşık 0,5 santimetrelik küçük bir kesi yapmak için 10 numara bıçaklı steril bir neşter kullanın. Daha sonra hayvanı sağ tarafına yuvarlayın ve sol arka bacak derisinde diz ekleminin çukuru arasında ve kuyruğun kökenine yakın iki ila üç santimetrelik bir kesim yapın.
Künt uçlu kavisli cerrahi makas kullanarak, deri altı bölgesini yaklaşık 3,5 ila dört santimetreye kadar inceleyin ve açık cilt ile alttaki kas arasında bir cep oluşturmak için cildi alttaki kastan ayırın. Ardından, pazı femoris kası üzerinde 0,5 santimetreden daha küçük bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve makasın uçlarının doğrudan kasın içinden geçtiğinden emin olun. Ardından, iç kas grupları ve ortak peroneal sinir görünene kadar kesilen alanı yavaşça açın.
Siniri kesmemek veya zarar vermekten kaçınmak için çok dikkatli olun. Daha sonra 50 ila 60 santimetre PTFE kaplı ince paslanmaz çelik tel hazırlayın ve ikiye katlayın. Telin katlanmış kısmını 30 santimetre paslanmaz çelik çubuğun yarığına asın.
Boynun arkasındaki küçük kesi alanına ulaşmak için teli arka bacağın açık cebinden ve sırtın merkezi boyunca L şeklinde bir desende geçirmek için çubuğu kullanın. Pencereyi, peroneal sinir pencerenin ortasında olacak şekilde pencerenin boyutu yaklaşık 1,5 santimetre kare olana kadar metal ekartörlerle çekerek sabitleyin. Bir neşter kullanarak, telin uçlarını dikkatlice 1,5 santimetre soyun.
Bir bobin yapmak için soyulmuş tel uçlarını körelmiş 21 gauge bir iğnenin etrafına beş kez sarın. Bobinler düzgün bir şekilde yapıldıktan sonra, iğneyi onlardan serbest bırakın. Bobinin en ucundan bir düğüm yapın ve bobinin sinirden 1,5 ila 2,5 milimetre uzakta olduğundan emin olarak sinirin sol tarafına dikin.
Bobini sabitlemek için, bobin boyunca iki veya üç ek dikiş uygulayın. Bu adım, sinire ve alttaki kaslara zarar vermekten kaçınmak ve tüm hayvanlarda tüm tutarlı stimülasyon koşullarını elde etmek için önemli ölçüde pratik ve sabır gerektirir. Bir çalışma sırasında tüm cerrahi prosedürleri tamamlamak için yetenekli bir araştırmacıya sahip olmak en iyisidir.
İki veya üç damla antibiyotik solüsyonu uygulayın ve ardından 5-0 numara ipek kullanarak pencereyi dikkatlice dikin. Kalan tel gevşekliğini gevşek bir şekilde sarın ve kalçanın üzerindeki pazı femoris kasının dikişli kesisinin üzerindeki deri altı cebe itin. İki ila üç damla antibiyotik solüsyonu uygulayın ve açık cildi zımbalayarak kapatın.
Daha sonra, hayvanı sternal pozisyona getirin ve iki tel ucu oluşturmak için boynun üst kısmındaki kesikten çıkan tel halkayı kesin. Bir neşter kullanarak, tellerin uçlarını 0,5 santimetre soyun. Yıpranmış kabloları kesin.
Tellerin soyulmuş kısımlarını yavaşça pim yuvalarının deliğine itin ve bir havya kullanarak telleri pim yuvalarına lehimleyin. Pime bağlı tel uçlarını 4,4 santimetrelik steril bir gazlı bez pedinden geçirin. Ardından telleri stimülatör kutusunun tabanındaki delikten geçirin.
Pimleri CCA ünitesindeki bağlantı soketlerine takın. CCA ünitesini haznenin altına sabitlemek için yapışkan bir çivi kullanarak CCA ünitesini yavaşça hazneye yerleştirin. Tıraşlı gövdenin etrafındaki hazneyi sabitlemek için atletik bant veya gözenekli cerrahi bant kullanın.
Haznenin üst kısmını üç kat bantla kapatın. Ve kutuyu sabitlemek için stimülatör kutusunun kenarlarına bant sararak bitirin. Üniteyi taşınabilir bir kızılötesi flaş ışığı tarafından yayılan tek bir kızılötesi ışık darbesine maruz bırakarak CCA'nın çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
CCA düzgün çalışıyorsa, arka bacak kasları kızılötesi ışığa tepki olarak kasılır. CCA prosedüründen sonra vücut ağırlığının değişmesinden kaynaklanan herhangi bir ciddi stres veya yan etkiyi belirlemeye yardımcı olmak için bir temel ölçüm kaydetmek için CCA prosedürüne başlamadan kısa bir süre önce hayvanları tartın. CCA stimülasyonu gününde, stimülatör ünitesini taşınabilir bir kızılötesi flaş ışığı ile tek bir kızılötesi ışık darbesine maruz bırakarak CCA'yı açın ve üç veya altı saatlik 10 hertz CCA stimülasyonu uygulayın.
Stimülasyonu ve hayvanı her 30 ila 60 dakikada bir kontrol edin. İstenen CCA süresinin ardından, kızılötesi ışığa maruz kalma yoluyla CCA ünitesini kapatın. Günde altı saat boyunca yedi günlük CCA'ya maruz kalan sıçanlar, uyarılmamış kontralateral arka bacak ile karşılaştırıldığında, uyarılmış kasta gelişmiş mitokondriyal biyogenez gösterir.
Mitokondriyal biyogenezdeki bu artış, PGC-1 alfa'nın protein ekspresyonunun artmasıyla gösterilir. Mitokondriyal solunum kapasitesini ölçmek için geçirgen kas liflerinin incelenmesi, CCA'nın kontrol kasına göre kasın maksimum solunum kapasitesinde bir artışa neden olduğunu ortaya koymaktadır. Hem subsarkolemmal hem de intermiyofibriller mitokondriyal popülasyonlar, yedi günlük CCA'nın ardından uyarılmamış kasın kontrolüne kıyasla artmıştır.
Otofaji ve lizozomal sistemlere adaptasyonlar da CCA ile sağlanabilir. Lizozomal biyogenezin ana düzenleyicisi olan Transkripsiyon faktörü EB'nin protein bolluğunda bir artış, CCA'dan sonra tüm zaman noktalarında gözlenir. Bu işlemi takiben, kolşisin tedavisi ile otofaji aküsünün tahmini gibi ek sorulara cevap vermek için genel subkutan veya intraperitoneal enjeksiyonlar gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, dayanıklılık antrenmanını takiben kas fenotipik değişikliklerini incelemek için mevcut kronik kasılma aktivite modelini nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, sıçan arka uzuvunda stimülasyona bağlı iskelet kası adaptasyonlarını gözlemlemek için kronik kasılma aktivitesi egzersiz modelinin kullanımını açıklamaktadır. Bu model, araştırmacıların iskelet kası fenotipik adaptasyonlarını kısa bir zaman diliminde incelemesine olanak tanıyarak kas fizyolojisi hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kas Fizyolojisi
- Egzersiz Bilimi
- Eğitime Uyumlar
Arka Plan
- Kronik kasılma aktivitesi modeli, in vivo çalışmalar için etkilidir.
- Bu model, yedi günlük kısa bir süre içinde adaptasyonları ortaya çıkarabilir.
- Mitokondri biyogenezi ve otofaji konularındaki önemli soruları ele alır.
- Kronik kas stimülasyonu, yaşa bağlı kas güçsüzlüğünü hafifletmeye yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Egzersiz eğitimi uyaranlarına iskelet kası adaptasyonlarını gözlemlemek.
- Altı haftalık bir eğitim protokolünü yoğun bir zaman diliminde araştırmak.
- Egzersizle ilişkili hücresel adaptasyonları daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kas stimülasyonu için kronik kasılma aktivitesi modeli.
- Kas spesifik adaptasyonların gözlemlenmesi.
- Ortak peroneo nervi ile ilgili elektrik stimülasyon teknikleri.
- Mitokondri ve otofaji tepkilerinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yedi gün içinde önemli iskelet kası adaptasyonları gözlendi.
- Stimülasyona yanıt olarak artmış mitokondri biyogenezi belirlendi.
- Otofaji ile ilgili hücresel değişikliklerin kanıtı.
- Yaşlanma ile ilgili kas atrofisi için potansiyel terapötik etkiler.
Sonuçlar
- Kronik kasılma aktivitesi modeli, kas adaptasyonlarını incelemek için değerli bir araçtır.
- Kısa süreli gözlemler, kas fizyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
- Dahası araştırmalar, kas güçsüzlüğü için terapötik uygulamaları araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The chronic contractile activity model enables rapid assessment of skeletal muscle phenotypic adaptations, providing a compressed timeline for evaluating exercise-induced molecular changes. This approach supports target validation in muscle physiology by isolating contraction-specific effects from systemic confounders, enhancing predictive confidence in preclinical studies of metabolic and atrophy-related pathways. The model’s utility in studying mitochondrial biogenesis and autophagy positions it as a mechanistic de-risking tool for early discovery programs focused on muscle health and aging.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing muscle-specific adaptations independent of humoral or neurological factors.
- Operational Value: Achieves phenotypic changes typically requiring six weeks of training within seven days, accelerating target engagement studies.
- Translational Value: Supports functional validation of targets involved in mitochondrial biogenesis and autophagy pathways relevant to metabolic disease and sarcopenia.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable biological systems with enhanced mitochondrial respiratory capacity and PGC-1α expression for downstream compound screening.
- Reproducibility: Standardized stimulation parameters (10 Hz, 3–6 hours/day) enable consistent induction of subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondrial adaptations.
- Scalability: Surgical implantation of chronic stimulation coils allows for longitudinal monitoring and repeated tissue sampling across study cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models endurance training adaptations applicable to preclinical evaluation of interventions for muscle atrophy and aging-related weakness.
- Mechanistic De-risking: Permits assessment of autophagy flux and lysosomal biogenesis via TFEB upregulation, supporting target modulation studies.
- Predictive Confidence: Links acute stimulation protocols to chronic adaptive phenotypes, improving translation of exercise-mimetic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for programs investigating exercise-mimetic compounds or muscle-specific regulators.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on contraction-induced signaling pathways by isolating direct muscle responses to chronic stimulation.
- Screening: Produces standardized, stimulated muscle tissue suitable for ex vivo assays measuring respiratory capacity and protein markers of adaptation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of mitochondrial biogenesis (via PGC-1α) and autophagy (via TFEB) as pharmacodynamic readouts.
- Translational Research: Bridges acute stimulation responses to chronic adaptive states, supporting dose-response modeling in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and stimulation platform for iterative testing of multiple compounds or genetic manipulations across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing cell-autonomous muscle adaptations from systemic exercise effects.
- Operational Value: Delivers reproducible, time-efficient induction of mitochondrial and lysosomal adaptations, minimizing animal use and study duration.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, contraction-specific phenotypic data before investing in long-term efficacy studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting muscle metabolic pathways through rapid validation of target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent microsurgery, particularly for precise identification and handling of the common peroneal nerve.
- Dependent on specialized instrumentation including stimulator units, infrared activation systems, and soldered wire-electrode interfaces.
- Necessitates cross-team standardization of surgical protocols, stimulation parameters, and tissue harvest timing to ensure inter-animal consistency.
- Involves adaptation considerations when translating the model to different muscle groups or species due to nerve accessibility and coil placement variability.
- Limited by the technical learning curve associated with coil suturing and nerve-proximal electrode placement, which demands consistent operator skill to maintain stimulation fidelity.
