3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

Yeni ortaya çıkan RNA-FISH'i viral latent proteinlerin amino boyaması ile birleştirmenin genel amacı, viral transkripsiyon fabrikası oluşumuna bağlı aktif transkripsiyonu görselleştirmektir. Bu yöntem, genetik, hücre biyolojisi, viroloji ve hücre biyolojisi virolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, genomik mimari değişikliklerin arkasındaki moleküler detayları incelemek için indüklenebilir bir viral mini kromozom modeli kullanmasıdır.

Hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın. Hücreleri 200 Volt yerçekiminde iki dakika santrifüjleyin. Hücreleri bir mililitre steril DEPC PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, hücreleri 1.2 mililitre DEPC PBS'de yeniden askıya alın. Kapak fişlerini altı oyuklu bir plakanın dibine yerleştirin. Her bir kapak fişine 200 mikrolitre hücre DEPC PBS karışımını pipetleyin.

Hücreler iki dakika boyunca yerleştikten sonra, fazla DEPC PBS'yi aspire edin ve geriye sadece ince bir hücre tabakası bırakın. Her bir kapak kızağına dikkatlice bir mililitre sabitleme solüsyonu ekleyin. Hücrelerin 10 dakika sabitlenmesine izin verin.

Kapak fişlerini DEPC PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, her bir kapak fişine 100 milimolar nihai glisin konsantrasyonuna dikkatlice bir mililitre glisin DEPC PBS ekleyin. Hücrelerin beş dakika sönmesine izin verin.

1,5 mililitre DEPC PBS ekleyin ve beş dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine koyun ve bir dakika boyunca elinizde sıkıca ama nazikçe sallayın. Fazla DEPC PBS'yi aspire edin ve hücreleri bozmamaya dikkat edin. Her bir örtü fişine dikkatlice bir mililitre geçirgenleştirici solüsyon ekleyin.

Hücrelerin 15 dakika boyunca nüfuz etmesine izin verin. 1,5 mililitre DEPC PBS ekleyin. Hücreleri beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bir dakika boyunca sıkıca ama nazikçe elinizde sallayın.

Fazla DEPC PBS'yi aspire edin ve hücreleri bozmamaya dikkat edin. Mikroskop slaytlarını etiketleyin ve bir kağıt havluyu nemlendirin, ardından sızdırmaz bir plastik kabın altını havluyla hizalayın. Daha sonra, birincil antikor çözeltisini hazırlayın ve mevcut her kapak fişi için tarifi çarpın.

Her etiketli mikroskop lamına 30 mikrolitre primer antikor solüsyonu yerleştirin. Kapak kaymasının köşesini tutarak ve hafifçe vurarak birincil antikor konsantrasyonunun doğru olduğundan emin olun. Ek olarak, bir mendilin köşesi fazla nemi emmek için kullanılabilir.

Ardından, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek kapak fişini etiketli mikroskop slaytlarının üzerine yerleştirin. Kabın dışını streç filmle örtün. Kabı bir saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre taşıyın.

Kuluçka sırasında gerekli reaktifleri hazırlayın. İnkübasyondan sonra, hücreleri her biri beş dakika boyunca altı oyuklu bir plakada DEPC PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, hücreleri FISH yıkama tamponu ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ve kapak fişini, ikincil antikor, bir intron prob karışımı hazırlanana kadar FISH yıkama tamponunda tutun. Daha sonra, sabunlu su ile hibridizasyon için birincil antikor inkübasyonu için cam slaytları temizleyin. Kuruduktan sonra etanol ve laboratuvar mendili ile temizleyin.

Her bir cam slaytın üzerine 40 mikrolitre ikincil antikor ve çözelti içeren FISH intron probunu yerleştirin. Kapak fişlerini, hücrelerle birlikte, hücrelerin tarafı aşağı bakacak şekilde arabelleğin üzerine yerleştirin. Ve baloncukları sokmamaya dikkat edin.

Slaytları, altında nemli bir kağıt havlu bulunan plastik bir kaba koyun. Plastik kabı önce streç filme, ardından alüminyum folyoya sarın. Ve kabı slaytlarla birlikte inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kapak kızağını cam sürgünün kenarından dikkatlice kaydırın ve yukarı bakacak şekilde altı oyuklu plakalara geri yerleştirin. Hücreleri FISH yıkama tamponu ile altı oyuklu bir plakada her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri iki kat SSC ile iki kez yıkayın.

İki katlı SSC'ye bir ila 1000 konsantrasyonda DAPI ekleyin ve çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika bekletilmesine izin verin. Hücreleri iki katlı SSC ile iki kez yıkayın. Hibridizasyon için kullanılan cam kızakları temizleyin ve cam kızakların üzerine 10 mikrolitre montaj solüsyonu ekleyin.

Kapak kızaklarını yüzü aşağı bakacak şekilde montaj solüsyonunun üzerine yerleştirin. Bir laboratuvar dokusuyla, hücreleri ezmemeye dikkat ederek fazla montaj solüsyonunu nazikçe çıkarın. Oje kullanarak, kapak fişlerinin kenarına geniş bir tabaka halinde uygulayın ve cilanın kurumasını bekleyin.

Numune artık floresan mikroskobu için hazırdır. BCBL-1 hücreleri, aktif olarak kopyalanan viral epizomların nerede olduğunu ve Kaposi Sarkomu ile ilişkili Herpes virüsüne veya KSHV reaktivasyon uyaranlarına yanıtın heterojenliğini incelemek için LANA ve K-RTA RNA için boyandı. Viral epizomların dağılımıyla yakından eşleşen bölgelerdeki belirgin K-Rta floresansı, KSHV genomlarına yakın gerçekleşen aktif transkripsiyonun kanıtıdır.

Aynı örnekte, LANA ile önemli ölçüde örtüşmeyen çok daha zayıf ve yaygın K-Rta floresansı sergileyen hücreler gözlemlenebilir, bu da bir hücre popülasyonu içindeki reaktivasyon uyaranlarına verilen yanıtın önemli varyasyonunu ve derecesini gösterir. Daha sonra, timidin senkronizasyonunun etkinliği, senkronize hücrelerin reaktivasyon uyaranlarına senkronize olmayan popülasyondan daha fazla yanıt verdiğini açıkça gösteren viral proteinin ekspresyonunun görselleştirilmesiyle incelendi. DAPI boyama birkaç işleve hizmet edebilir, bu örnek açıkça bir yerine üç ayrı hücre olduğunu göstermektedir.

Bu tekniğin yanı sıra 3D mikroskopi, periferde noktalı KSHV genomları ile görülen halka benzeri RNA PII yapılarını ortaya çıkardı. Geliştirilmesiyle birlikte, mini viral kromozom, araştırmacıların gen ekspresyonunun özel zamansal organizasyonunu ve hücre çekirdeğinin gerilemesini keşfetmeleri için benzersiz araçlar sağlayacaktır.