Name: 3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, viral transkripsiyon fabrikalarında aktif transkripsiyonu görselleştirmek için nascent RNA-FISH ve amino boyama yöntemlerini birleştirin. Bu teknik, viral reaktivasyon sırasında genomik mimari değişikliklerin moleküler detaylarını incelemek için indüklenebilir viral mini-kromozom modeli kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01-DE025985) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-13-383-MPC) tarafından desteklenmiştir. Bu eser, Davis de ABD Tarım Bakanlığı (2015-67015-23268 ve 2014-67015-21787) ve University of California, yeni araştırma girişimi bursu gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Bu yordamda kullanılan hücre hatları bulaşıcı virüs içerebilir, dikkatli olun ve yalnızca düzey 2 BSL tesis veya daha yüksek devam edin.
1. hücre hazırlık ve bakım
<ol><li>Kültür TREx-K-RTA BCBL-1 hücreleri (veya başka bir KSHV enfekte PEL hücre hatları) RPMI1640 orta % 15 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin streptomisin glutamin çözüm ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Sürekli olarak büyümeye ve 2 – 4 günde 1:4 oranında tarafından hücreleri bölmek için emin hücreleri ile %5 karbondioksit (CO2), 37 ° C'de büyümek.</li>
	<li>Hücre kültürleri iyi hücre büyümesini ve hücre kültürü yeniden başlatmak veya hücre kültür koşullar buna göre ayarlamak için tavsiye edilir Morfoloji, aksi takdirde onaylamak için her gün bir ışık mikroskobu ile izleyin.</li>
</ol>2. timidin eşitleme ve litik indüksiyon
<ol><li>Bir 10 cm Petri dish, plaka TREx-K-Rta BCBL-1 hücrelerde taze hazırlanan medya (1 x 106 hücreler/2 mL medya)</li>
	<li>200 mM timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM) çanak, mix ve 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 8 h S-faz çıkmak izin verir.</li>
	<li>Timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM), mix ve 16 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Viral reaktivasyonu ikna etmek için 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, son konsantrasyonu 20 ng/mL) ve Doksisiklin (DOX, nihai toplama 100 ng/mL) hücre kültürü ekleyin, karıştırın ve 4 h için kuluçkaya. K-Rta indüklenebilir kaset olmadan hücre hatlarında TPA (son konsantrasyonu 20 ng/mL ve sodyum bütrat (1 mM)) kullanarak yeniden etkinleştirme teşvik.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve komple kültür medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Tam kültür medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 24 h büyümeye izin.</li>
</ol>3. fiksasyon ve Permeabilization
Not: devam etmeden önce sabitleme çözüm (% 3.7 formaldehit DEPC tedavi PBS), Dietil pyrocarbonate tedavi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DEPC-PBS), glisin DEPC PBS olun (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) ve permeabilizating çözüm (% 50 aseton, % 50 metanol) hazırlanır. Genellikle, her slayt en az 0,5 milyon hücre gerektirir, gerekirse çarp ve özellikle hücreleri sağlıklı olmayan ilave hücreler için arka kadar içerir.
<ol><li>Hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne toplamak.</li>
	<li>Hücreler için 200 x g. yıkama, 2 dk santrifüj kapasitesi 3 kez ile 1 mL steril DEPC PBS hücreleri. 1.2 mL DEPC PBS resuspend.</li>
	<li>(Deneysel Kur tarafından belirlenen) coverslips uygun sayıda 6-şey plaka dipleri yerleştirin.</li>
	<li>Her coverslip DEPC PBS karışımı hücrenin 200 µL pipet, en az 0,5 milyon hücre her slayt üzerinde olduğundan emin olun. Hücreler 2 min için yerleşmek izin ve aşırı DEPC hücreleri sadece ince bir tabaka bırakarak PBS Aspire edin. Bu süreçte kaldırılacak hücreleri normaldir. Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde çözüm (DEPC PBS % 3.7 formaldehit) her kapak kayma sabitleme 1 mL ekleyin. 10 dakikadır düzeltmek hücreleri izin.</li>
	<li>Coverslips 3 kez DEPC PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Dikkatle glisin DEPC PBS 1 mL ekleyin (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) her kapak kayma. 5 min için gidermek için hücreleri izin.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca ama hafifçe el 1 dk. aspiratı aşırı DEPC PBS sallamayın. Hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle her kapak notu için çözüm (% 50 aseton, metanol % 50) permeabilizing 1 mL ekleyin. 15 dakikadır permeabilize hücrelere izin. Not: Bu noktada, coverslips-20 ° C-dondurucu için artık bir hafta daha saklanabilir. Donma önlemek veya görüntü kalitesi hızla düşebilir gibi dondurucuya harcanan zamanı en aza indirmek. Hücreleri kalır dondurucu ne zaman ıslak ve kapalı metanol/aseton ve onlar düzgün DEPC PBS ile dondurucu kaldırılması sonra suyla temasa olduğunu emin olmak için emin olun.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca sallamak ama hafifçe el 1 dk. için aşırı DEPC PBS Aspire, hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
</ol>4. IFA ve RNA-balık
Not: RNA balık sonda etiketleme ve hazırlık ile ilgili olarak: için K-959 baz çifti, 31 farklı probları intron olduğunu Rta oluşturulan bu 20 baz bir GC içeren çifti her, yaklaşık % 50 içerik. Çalışma ve hisse senedi çözümleri sondalar, sırasıyla 100 µM ve 2.5 µM konsantrasyonları, bölünmemeli idi.
<ol><li>Mikroskop slaytlar ile gerekli deneysel bilgi ya da bir çeşit ayırt etiket etiket.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile yapışmalı plastik konteyner alt çizgi.</li>
	<li>
Birincil antikor çözüm hazırlamak (1,5 µL LANA antikor, RNA Pol II antikor 0,75 µL, baker'ın 3 µL Maya tRNA, DEPC PBS 30 µL kadar) ve her coverslip mevcut tarifini çarpın. Birincil antikor çözüm her yer 30 µL mikroskop slayt etiketli.
	<ol>
<li>İlk faiz birincil antikor titre ve en uygun miktarda kullanın. Serum (asit sıvı) RNase büyük miktarda içerebilir olarak saflaştırılmış IgG, kullandığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip (çözüm dış yüzey hücreleri) etiketli mikroskop slaytlar yerleştirin ve nemli kağıt havlu ile konteyner içine slaytlar hareket. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun. Kapsayıcı plastik wrap ile dış kapak. Konteyner 37 ° C için 1 h için bir kuluçka içine taşıyın.</li>
	<li>Bir balık yıkama arabellek (2 x serum sodyum sitrat tampon (SSC) (son), % 10 formamide, % 90 DEPC dH2O) hazırlayın.</li>
	<li>2 x hibridizasyon arabellek hazırlamak (4 x SSC, % 20 dextran sülfat).</li>
	<li>İkincil antikor ve balık intron sonda arabellek hazırlamak (2 hibridizasyon arabellek (son 1 x Hyb arabellek) x 20 µL, fırıncı mayası 4 µL tRNA (son %10), formamide (son %10), intron K-Rta sonda 4 µL (son 125 nM), 0.8 ikincil antikor, DEPC dH2 µg O kadar 40 µL). Gerekli her slayt için reçete çarpın.</li>
	<li>Kuluçka sonra hücreleri 3 kez DEPC PBS 5 min için 6 iyi plaka ile yıkayın.</li>
	<li>Balık yıkama arabellek 5 min için 3 kez yıkayın. Coverslip balık-yıkama arabellekte karışımı ikincisi antikor ve intron sonda (Adım 4.7) hazırlama bitiş kadar tutun.</li>
	<li>Temiz cam slaytlar için birincil antikor kuluçka hibridizasyon için kullanılan.</li>
	<li>40 µL ikincil antikor ve her bir cam slayt üzerine solüsyon içeren balık intron sondası yerleştirin.</li>
	<li>Slayda hücrelerle coverslips kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmanız hücre yüzü aşağı bakacak şekilde arabellek üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile plastik bir kap içine slaytlar altına yerleştirin. İlk plastik wrap ve sonra alüminyum folyo plastik kapta sarın.</li>
	<li>Kapsayıcı için 16-24 h 37 ° C'de slaytlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra dikkatlice coverslip cam slayt kenarından slayt ve geri yukarı dönük olacak şekilde 6 iyi tabak içine koymak ve balık-yıkama arabellekte 3 kere 6 iyi plaka 5 min için hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>DAPI (1:1, 000) 2 ekleyin x SSC ve oda sıcaklığında 5 min için oturmak için izin verir.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>Hibridizasyon için kullanılan cam slaytlar temiz ve çözüm cam slaytlar üzerine montaj 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Coverslips yüzü aşağı montaj çözümü üzerine yerleştirin. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>Laboratuvar doku ile yavaşça hücreleri ezmeye değil dikkatli olmak aşırı montaj çözüm çıkarın.</li>
	<li>Tırnak cilası kullanarak, coverslips kenarında geniş bir tabaka uygulayın ve kurumasını sağlar.</li>
	<li>Floresans mikroskobu gerçekleştirmek için devam edin.</li>
</ol>5. 3D Floresans mikroskobu
Not: protokoller floresan mikroskop sistem kullanılan türü ile değişir iken, aşağıdaki adımları en uygun görüntü verilerini nicel analiz edinimi sağlamak için yardımcı olacaktır.
<ol><li>Sabit örnekleri pretreat ve anti-fade medya floresan photobleaching görüntüleme sırasında geciktirmek için mount.</li>
	<li>Tüm cep telefonu (veya hücre çekirdeği)-ebilmek esir alma yüksek kalite hedefi (örneğin bir 60 X 1,42 N.A petrol-daldırma lens), alan bakış açısı içinde kullanın.</li>
	<li>Pozlama parametreleri (örneğin, uyarma güç, pozlama süresi) pozitif ve negatif kontrol örnekleri kullanarak her Floresans renk kanalı için ayarlayın. Floresans görüntüleri elde etmek. Not: yalnızca bir floresan etiketi pozitif kontrol örnekleri de renk kanalları arasında "çapraz karışma" düzeyini belirlemek için kullanılmalıdır. Görüntüleme sabit hücre numuneler için Floresans uyarma güç (biraz daha uzun pozlama süreleri ile) photobleaching en aza indirmek için azaltılabilir.</li>
	<li>Görüntüleme protokolü kurulduktan sonra aynı pozlama parametreleri bir çalışmada tüm örnekleri için tutarlı korumak — böylece görüntü verilerini doğru bir şekilde analiz ve karşılaştırıldığında.</li>
	<li>Sonrası edinme görüntü işleme ve 3D yeniden gerçekleştirin. K-Rta transkript RNA-balık sinyal (kırmızı), LANA molekülleri ayirt (yeşil) ve nükleer Kromatin DAPI (mavi) ile lekeli (uygun olduğunda) tanımlayın. Not: K-Rta ve LANA co kümelenmiş olan hücre çekirdeği bölgelerinde böylece viral transkripsiyon fabrika ve çoğaltma karmaşık ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.</li>
</ol>

<ol><li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression%3A+the+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics%3A+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li>
<li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li>
<li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies%3A+a+long+history+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li>
<li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li>
<li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factories%3A+gene+expression+in+unions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li>
<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li>
<li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma%3A+listening+to+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li>
<li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n10/full/nrc2888.html?foxtrotcallback=true">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li>
<li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
<li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+diversity+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li>
<li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192(2007).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly%28A%29+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300(2011).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li>
<li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li>
<li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li>
<li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30(2012).</li>
</ol>

Yazarlar bu yazının hiçbir mali bağları ya da rakip çakışmaları çıkarları var.

Sıra dışı durumlar karşılamak için değiştirilebilir Protokolü bazı yönleri vardır. Fiksasyon ve permeabilization arabellekleri seçiminde de değiştirilebilir. Fiksasyon arabellekleri için paraformaldehyde da etkilidir ve etanol permeabilization için kullanılabilir.
Şoklama formaldehit ile glisin PBS formaldehit sığır serum albumin (BSA) yokluğunda antikorlar devre dışı bırakmasını engeller, ancak coverslips iyice yeterli yıkanır,-ebilmek var olmak Kaptan glisin PBS adım olarak önerilir. İletişi...

Çekirdek kronolojik zamanmekansal organizasyonu hassas bir şekilde ayarlanmış gen ekspresyonu ökaryotlarda oransal olarak önemli bir rol oynar giderek netlik kazanmıştır. Çoğu doku belirli genler üzerinde birçok kromozomlar dağıtılır ve koordine bir şekilde1belirli uyaranlara yanıt için zaman uyumlu olarak düzenlenmiş olması gerekir. Hücreleri aktif Kromatin hub'lar (ACH) genleri ve CIS düzenleyici bileşenleri belirli nükleer alanı1buluşturan bir yolu olarak oluşturun.
Bu da tarafından çeşitli çalışmalar çekirdeği çok yoğun ve yapışkan görünse de, biyolojik olarak aktif molekülleri çekirdeği oldukça hızlı bir şekilde Difüzyon2erişebilen olduğunu kanıtlanmıştır. Sonucu olarak kısa ömürlü bu özellik, çoğu DNA bağlayıcı proteinler 'için son derece uyumlu ve çok yönlü çekirdek2sağlayan nükleer alanda etrafında kendi yollarını duygu site Bağlayıcısı için site bağlayıcısı üzerinden atlama'.
Biomolecules çekirdeği içinde bu dinamik davranış rağmen nükleer membran gibi organları (ama bunlarla sınırlı olmamak üzere) çekirdekçik, Cajal organları ve promyelötik lösemi nükleer organları (PML-NB) hala mevcut. Bu yapıları birlikte3,4,5 tutun proteinler (PML-NB) çeşitli mekanizmalar tandem DNA yineler (çekirdekçik), rRNA (çekirdekçik) ve Cajal aytac (organları) veya PML gibi yapısal proteinler gibi geçer . Bu yapılar ve diğer cemaat transkripsiyon fabrikalar gibi sadece gerekli bileşenleri yerel konsantrasyonu artırmak, ancak aynı zamanda proteinler ve nükleik asitler sonuçta oluşturmak için bunları içinde kompozisyon düzenleyen iskele olarak hizmet bir verimli hücresel işlevler6için merkezi bir sitedeki.
Nerede ve ne zaman nükleer yapılar formu epigenetik eğitim araştırmacılar için bilgi hazinesi sağlar görselleştirme. Viroloji açısından bakıldığında, KSHV gibi gizlice enfekte virüsler reaktivasyonu önemli ölçüde çekirdeği Peyzaj ve dağıtım nükleer enzimlerin transkripsiyon öncelikle hücresel genlerin viral genler için sonuçta kaydırmaya değiştirir için tamamen işlevsel viral döl7,8üretmek. KSHV viral gen ifadesi kolaylaştırmak için hücresel gen ifade makine nasıl işlemek? Bu bilgileri ayrıca zamansal hücresel gen düzenleyici mekanizmaları ışık.
Diğer herpesviruses gibi KSHV litik çoğaltma ve gecikme süresi olarak adlandırılan iki ömürleri vardır. Gecikme süresi ilişkili genlerin9,10dışında KSHV öncelikle içinde hangi en-in onun viral gen ifade susturulması, gecikme süresi aşamasında yer alır. KSHV üretir gecikme süresi sırasında gecikme süresi yapısal viral genom bağlar ve insan kromozom11viral Kromatin tethers nükleer antijen (LANA), ilişkili. Viral genom ile LANA'ın samimi ilişki nedeniyle IFA ve DAPI leke ve viral episomes ile ilgili olarak ana bilgisayar Kromatin nerede olduğunu bulmak için kullanmak mümkündür.
KSHV reaktivasyonu tek episome düzeyinde ve derneğin diğer viral episomes virüslü bir hücre ile çalışmaya, aktif viral Kromatin situ transkripsiyonu bulmak için bir strateji kurulmuştur. Buna göre LANA ve RNAPII IFA intron RNA-balık ile bu KSHV K-Rta-anahtar viral protein intron bölge (tam sonda dizileri-ebilmek bulunmak Izumiya laboratuar en son yayın8') bağlamak RNA-balık probları oluşturarak kombine edilmiştir gerekli ve yeterli KSHV yeniden etkinleştirme-BT tanımlamak mümkün için transkripsiyon aslında alıyordu nerede8,11,12,13,14,15 yere . Bu intron RNA-balık tekniği araştırmacılar spliced ve sitoplazma16,17' ye ihraç hemen önce nerede mRNA sentezlenir görselleştirmenizi sağlar.
KSHV tarafından phorbol esterleri gibi 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) dahil olmak üzere çeşitli kimyasal uyaranlara yeniden etkinleştirilebilir ve Histon deacetylase inhibitörleri gibi sodyum bütrat, ayrıca KSHV overexpression tarafından yeniden etkinleştirmek için indüklenen viral transkripsiyon faktörü, K-Rta19. Araştırmacılar başarıyla yeniden etkinleştirme18inducing önce hücre döngüsü eşitleyerek KSHV reaktivasyonu verimliliği artmıştır. Böylece, bu belirli çalışmalar için hücreleri bir çift timidin blok (aşağıda açıklanan iletişim kuralı) kullanarak ve TPA ve Doksisiklin (Dox) ile kısa bir süre için inkübe senkronize. Bu deneylerde kullanılan hücre kültürünü cDNA klonlanmış ve K-Rta intron bölgenin içermez Doksisiklin indüklenebilir bir K-Rta kaset olduğundan Doxycyline kullanıldı. Yeniden etkinleştirmek mümkündür ancak KSHV kullanarak sadece K-Rta ifade indüklenen, çeşitli farklı biyokimyasal faktörler nedeniyle K-Rta ifade yalnız bir zayıf reaktivasyonu uyaranlara20olmaktadır araştırmacılar tarafından kanıtlanmıştır. Bunların hepsi birleştirerek ve uyuşturucu incubations kısa bir süre için sınırlayarak, bir güçlü ama aşırı yapay KSHV etkinleştirme görüntüleme için sağlanır.
LANA, RNAPII, etiketleme sonra K-Rta intron ve DNA olarak bu yazıda açıklanan, 3D Floresans görüntüleme widefield deconvolution mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı ile işlendikten sonra aktif viral episomes kayma dağılımını düzgün değerlendirilebilir. Bu tekniği kullanarak, etkin Kromatin hub'ları ve diğer nükleer yapıların oluşumu temel doğa ile ilgili sorular Merkezi okudu olabilir. Aynı viral episomes aynı düzenleyici elemanlarının işleyen tek bir hücreye sahip kronolojik zamanmekansal gen düzenleyici mekanizmaları anlayışı derinleştirmek için benzersiz araştırma aracı temsil edebilir.
Farklı zaman noktalarda sabit birden çok hücre örnekleri doğal olarak dinamik bir moleküler süreci karakterize görüntüleme bir floresan dağıtım ince ya da küçük ölçekli değişiklikleri tespit edilmemiş veya önemsiz kabul kısıtlamadır. Nadir örneğini her hücresinde gözlenen aynı ince değişiklik görüntüler sürece bu doğrudur. Böylece, aktif viral transkripsiyon ve diğer nükleer yapıların tam kronolojik zamanmekansal ilişki eleştirel sabit Imaging'i kullanma değerlendirilemez. Bu teknik sorunları ele almak üzere, viral episomes işaretlenmiş resim canlı hücreleri ve zaman içinde anahtar hücresel enzimler konumunu takip için en iyi yaklaşım olduğunu.

<table><tbody><tr><td>RPMI orta 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>37 °C'ye ısıtılması gerekiyor; C</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep Glutamin (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Timidin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Çözelti</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit Çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Aşındırıcı, toksik, sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>Dietil Pirokarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Akut toksisite&nbsp;</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Yanıcı, toksik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Yanıcı, toksik, sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>KSHV / HHV-8 ORF73 İleri Biyoteknolojilere karşı sıçan monoklonal antikoru</td><td></td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polimeraz II Antikor klonu CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonükleik asit, fırıncıdan transfer s mayası (S. cerevisiae)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu sodyum sitrat tamponu 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15557044</tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dekstran Sülfat,% 50 çözelti</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-diamindino-2-fenilindol, Dihidroklorür)</td> <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kapak camı 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D görüntüleme yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

3d floresans mikroskobu kullanılarak viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

İyi genler kayma ve temporal düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu yöneten ayrılmaz bir parçası olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, nerede ve ne zaman transkripsiyon nükleer alanı içinde yer alıyor anlamak ve aynı hücre çekirdeği içinde enfekte episomes arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için çok değerli olduğunu. Burada, ayirt (IFA) ve RNA-balık olmuştur combinedto belirlemek aktif Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) episomes transkripsiyonu. KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA) Boyama tarafından viral episomes çekirdeği içinde bulunduğu bulmak mümkündür. Buna ek olarak, sadece verimli enfeksiyon sırasında ifade edilir, viral bir gen intron bölgesinin hedef için RNA-balık probları tasarlayarak doğmakta olan RNA transkript bulunabilir. Bu moleküler probları birleşimini kullanarak, büyük viral transkripsiyon fabrikalar Meclisi görselleştirmek ve mekansal düzenleme viral gen ekspresyonu KSHV yeniden etkinleştirme sırasında analiz etmek mümkündür. Anti-RNA polimeraz II antikor boyama dahil olarak, bir de RNA polimeraz II (RNAPII) toplama ve KSHV transkripsiyon yeniden etkinleştirme sırasında arasındaki ilişkiyi görselleştirebilirsiniz.

Biraz kısaltılmış bir protokol nerede BCBL-1 hücreler kullanıldı ve sadece LANA ve K-Rta RNA (şekil 1) lekeli gerçekleştirildi. Bu deney nerede viral episomes aktif transkripsiyonu ve hücre bir popülasyondaki KSHV reaktivasyonu bizi canlı tutan heterojen incelemek için bize izin verir. Şekil 1' deki bir ok ile belirtilen hücre içinde farklı K-Rta Floresans viral episomes (LANA ile işaretlenmiş) dağılımı uygun bölgelerde etkin tra...

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Yeni ortaya çıkan RNA-FISH'i viral latent proteinlerin amino boyaması ile birleştirmenin genel amacı, viral transkripsiyon fabrikası oluşumuna bağlı aktif transkripsiyonu görselleştirmektir. Bu yöntem, genetik, hücre biyolojisi, viroloji ve hücre biyolojisi virolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, genomik mimari değişikliklerin arkasındaki moleküler detayları incelemek için indüklenebilir bir viral mini kromozom modeli kullanmasıdır.Hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın. Hücreleri 200 Volt yerçekiminde iki dakika santrifüjleyin. Hücreleri bir mililitre steril DEPC PBS ile üç kez yıkayın.Daha sonra, hücreleri 1.2 mililitre DEPC PBS'de yeniden askıya alın. Kapak fişlerini altı oyuklu bir plakanın dibine yerleştirin. Her bir kapak fişine 200 mikrolitre hücre DEPC PBS karışımını pipetleyin.Hücreler iki dakika boyunca yerleştikten sonra, fazla DEPC PBS'yi aspire edin ve geriye sadece ince bir hücre tabakası bırakın. Her bir kapak kızağına dikkatlice bir mililitre sabitleme solüsyonu ekleyin. Hücrelerin 10 dakika sabitlenmesine izin verin.Kapak fişlerini DEPC PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadık

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Kaynak: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, dallanmış DNA hibridizasyonu ve immünofloresans kullanarak enfekte insan lenfositlerinde HIV-1 DNA, RNA ve kapsid proteininin eş zamanlı görselleştirilmesini göstermekte ve böylece tekil hücreler içindeki viral replikasyon aşamalarının detaylı analizine olanak tanımaktadır.

Enfekte İnsan Lenfositlerinde Viral Nükleik Asitlerin ve Proteinlerin Çoklu Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Kalveram, B. ve ark. Viral Enfeksiyonun Konak Hücre RNA Sentezi Üzerindeki Etkisini Ölçmek İçin Klik Kimyasının Kullanımı. J. Vis. Exp. (2013)Bu video, memeli hücrelerde yeni sentezlenen RNA transkripsiyonunu görüntülemek için klik kimyası ve floresan mikroskobinin kullanımını göstermektedir. Enfekte ve kontrol hücreleri arasındaki floresan sinyallerini karşılaştırarak, viral enfeksiyonun konakçı transkripsiyonunu nasıl baskıladığını vurgulamaktadır.

Virüsle Enfekte Hücrelerde Transkripsiyonel Baskılanmanın Görüntülenmesi

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Bu protokol, dna çift iplik kopmalarında transkripsiyonu tek molekül hassasiyetiyle tespit etmek için yeni bir muhabir gen sistemi ve deneysel kurulum sunar.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

Öğrenin, viral transkripsiyon fabrikalarında aktif transkripsiyonu görselleştirmek için nascent RNA-FISH ve amino boyama yöntemlerini birleştirin. Bu teknik, viral reaktivasyon sırasında genomik mimari değişikliklerin moleküler detaylarını incelemek için indüklenebilir viral mini-kromozom modeli kullanır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

Daha fazla video keşfet