Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

Bu testin genel amacı, gelişmekte olan zebra balığı embriyosundaki hematopoietik progenitör hücrelerin farklılaşmasını numaralandırmak ve incelemektir. Bu yöntem, gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosunda gerçekte kaç tane kök ve progenitör hücre olduğu gibi hematopoetik alandaki bazı gerçekten önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı olması, nispeten ucuz olması ve gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.

Bu yöntem, gelişmekte olan zebra balığında bulunan progenitörlerin sayısı hakkında fikir verebilse de, araştırmacıların bir ilacın veya genetik mutasyonun kan progenitör oluşumu üzerindeki fonksiyonel etkisini ölçmelerine de olanak tanır. Bu yöntem için fikrimiz, kan gelişimi için çok önemli olduğunu varsaydığımız genleri yıktığımızda aklımıza geldi. Bu tahlil ile normal gelişen embriyolar ile morfant olan embriyolar arasındaki farkı ölçebileceğimizi öngördük.

Zebra balığı embriyolarını ağartmak için, biri bir litre E3 başına bir mililitre yüzde beş çamaşır suyu içeren ve ikisi steril E3 içeren üç yıkama istasyonu oluşturmak için plastik kaplar kullanın. Bir transfer pipeti ile embriyoları bir çay süzgecine yerleştirin ve beş dakika boyunca bir numaralı yıkama istasyonuna daldırın. Daha sonra embriyolarla birlikte çay süzgecini beş dakika boyunca iki numaralı yıkama istasyonuna aktarın. Son beş dakika boyunca üç numaralı yıkama istasyonu için tekrarlayın.

Son yıkamadan sonra, embriyoları 10 santimetrelik temiz bir petri kabı üzerinde ters çevirerek çay süzgecinden çıkarın ve embriyoları süzgeçten nazikçe durulamak için bir transfer pipeti ve steril E3 kullanın. Embriyoları dekoryonlaştırmak için, petri kabından mümkün olduğunca fazla E3'ü çıkarmak ve atmak için bir transfer pipeti kullanın. Daha sonra embriyolara 500 mikrolitre dekoryonasyon prodeası ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ardından, choryonları tamamen çıkarmak için petri kabının yan tarafına hafifçe vurun. Daha sonra, serolojik bir pipetle, prodeaları seyreltmek için 20 mililitre steril E3 ekleyin. Embriyoların yerleşmesine izin verin ve E3'ü çıkarmak için bir pipet kullanın. Dekorionasyon prodealarının tüm izlerini gidermek için bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.

Embriyo örneklerini hazırlamak için, 10 embriyoyu tek bir steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmek için bir pipet kullanın. Ardından, E3'ü dikkatlice pipetleyin ve atın. Numuneleri laminer bir akış başlığına aktarın ve embriyoları bir mililitre steril E3 ekleyerek yıkayın, böylece embriyoların tüpün dibine yerleşmesine izin verin.

Ardından, süpernatanı çıkarmak için bir P1000 pipeti kullanın. Toplam üç yıkama için tekrarlayın. Son yıkamanın ardından E3'ü çıkarın ve atın.

Daha sonra, mukus kaplamasını ve embriyoları çevreleyen içinde sıkışmış olabilecek sporları, mayaları veya bakterileri çıkarmak için E3'e bir mililitre 10 milimolar DTT ekleyin. Şimdi, mikrosantrifüj tüpünü yatay olarak yerleştirin ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. Embriyoları ayırmak için, numuneyi üç kez yıkamak için bir mililitre steril DPBS kullanın.

Son yıkamadan sonra, kalsiyum ve magnezyum içeren 500 mikrolitre DPBS ve mililitre ayrışma prodeaları başına beş mikrolitre beş miligram ekleyin. Numuneleri 37 santigrat derecede 180 rpm'de yatay bir orbital çalkalayıcı üzerinde 60 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri ve laminer akış başlığını yerleştirin ve numuneler tamamen ayrışana kadar embriyoları ezmek için bir P1000 kullanın.

Dikkatli olun ve ne zaman ayrıştıklarını belirlemek için embriyoları periyodik olarak kontrol edin. Bir miktar dokunun mevcut olmasını istiyorsun. Progenitör hücreleri yok edecek embriyoları aşırı sindirmek mümkündür.

10 ayrışmış embriyoyu, 35 mikrometre hücre süzgeci kapaklı beş mililitrelik poli stiren yuvarlak tabanlı bir tüpün üst rezervuarına pipetleyin. Bir pipet ve steril PBS ile embriyo tüpünü durulayın ve çözeltiyi filtrelenmiş hücreler içeren beş mililitrelik poli stiren tüpe aktarın. Tüpte dört mililitre sıvı kalana kadar durulamayı tekrarlayın.

Homojenize hücre örneğini paletlemek için tüpleri yerçekiminin 300 katı ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bir pipetle, altta peletlenen hücreleri bozmamaya dikkat ederek süpernatanı yuvarlak alt tüpten çıkarın ve atın. Daha sonra hücreleri yeniden askıya almak için 100 mikrolitre PBS kullanın.

Bir X tam metilselüloz stok çözeltisi hazırlayın ve 2,5 mililitre steril yuvarlak tabanlı 14 mililitrelik tüpler eklemek için üç mililitre şırınga ve 16 gage iğnesi kullanın. Test edilen her koşul için bir tüp kullanın. Miyeloid farklılaşması için, metil selüloz ortamına yüzde bir sazan serumu ve mililitre başına 0.3 miligram rekombinant zebra balığı granülosit koloni uyarıcı faktör veya GCSF ekleyin.

Eritroid farklılaşması için, metil selüloz ortamına yüzde bir sazan serumu ve mililitre başına 0.1 miligram rekombinant zebra balığı eritropoietin veya EPO ekleyin. Çok soylu ataları incelemek için EPO ve GCSF'yi ekleyin. Bir pipet kullanarak, sazan serumundaki rekombinant sitokinlerle hazırlanan metil selülozun yüzeyine 10 ayrışmış embriyonun 100 mikrolitresini ekleyin.

Kapağı kapatın ve numuneyi tamamen homojen hale getirmek için hafifçe girdaplayın. Her tüp şimdi 10 embriyonun ayrışmış dokusunu içermelidir. Üç mililitrelik şırınga ve 16 mastar iğnesi kullanarak, bir mililitre numuneyi iki ayrı 35 milimetrelik petri kabına ayırın.

Numunenin petri kabı boyunca tamamen dağıldığından emin olun. Her örnek için tekrarlayın. Hücreler ve metil selüloz içeren 35 milimetrelik petri kaplarını 15 santimetrelik bir petri kabına yerleştirin.

Her büyük plakaya, numuneleri nemlendirmek için beş mililitre steril su içeren 35 milimetrelik bir tabak ekleyin. Bulaşıkları yedi ila 10 gün boyunca 32 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Son olarak, koloni oluşturan birimleri metin protokolüne göre görselleştirin.

Hematopoietik destekleyici faktörlerle kültürde yedi gün sonra, 48 HPF embriyonik zebra balığından elde edilen progenitörler sayıldı ve görüntülendi. Daha da önemlisi, kullanılan KF miktarı, kaplanan embriyo sayısı ile doğrudan ilişkilidir. Deneyin başında 10 veya 20 embriyo ile başlamakla ilişkili olan mililitre başına dört veya sekiz embriyonun kaplanması, sırasıyla yaklaşık 1200 veya 2400 CFU verir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, embriyoları aşırı sindirmemeyi hatırlamak önemlidir, çünkü bu progenitör hücreleri yok edecektir. Bu prosedürle, farklı zaman noktalarında bulunan öncüllerin sayısını karşılaştırabilirsiniz.

Mutant hayvanları vahşi tip hayvanlarla karşılaştırabilir, ayrıca ilaçların kan gelişimi üzerindeki etkisini test edebilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı hematopoetik progenitörlerini numaralandırmak için bir metil selüloz testinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü, belirli sitokinleri test etmek gibi özel deneysel ihtiyaçlarınıza uyacak şekilde değiştirebilirsiniz.

Omurgalı kanı ve iğneleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu testi yaparken her zaman dikkatli olunması gerektiğini unutmayın.