Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Bu protokolün genel amacı, izole edilmiş çift sarmallı DNA miktarını ve ardından herbaryum örneklerinden elde edilen yüksek verimli dizileme kütüphanelerini artırmak ve filogenomik çalışmalarda faydalarını en üst düzeye çıkarmaktır. Bu yöntem, kapsamlı örnek bozulması nedeniyle projeleri genomik diziler olarak sıralamak için yararlı olmayacak olan herbaryum örneklerinin potansiyelini ortaya çıkarır. Bu tekniğin temel avantajı, nadir ve tarihsel olarak önemli herbaryum örneklerinin kapsamlı tahribatlı örneklemeye ihtiyaç duymadan kullanılabilecek kadar sağlam olmasıdır.

Bu teknik, sistematik aralıklı projelerde takson örneklemesinin derinliğini genişletir. Tür edinimi sınırlayıcı bir adımdır, ancak bu protokol ile tarihi koleksiyonlar bu çalışmalarda kolayca kullanılabilir. Önceden seçilmiş herbaryum dokusunun bir santimetre karesini önceden soğutulmuş havan ve havaneli içinde ince toz haline getirmek için sıvı nitrojen ve 30 ila 50 miligram sterilize kum ekleyin.

Başarılı bir DNA izolasyonu için yeterli öğütme şarttır. Ve numunenin tamamen toz haline getirilmiş olmasına dikkat edilmelidir. Daha sonra, donmuş tozu, tüp hacminin yarısından fazlasını doldurmayacak şekilde iki mililitrelik iki tüpe ekleyin.

Daha sonra her tüpe 600 mikrolitre ılık CTAB çözeltisi ekleyin. Tozu ters çevirerek ve girdaplayarak iyice karıştırın. Daha sonra numuneleri bir ila 1,5 saat boyunca 65 santigrat derecede tutulan bir su banyosunda inkübe edin.

Bu arada, her 15 dakikada bir girdap yapın. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, yaklaşık 500 mikrolitre süpernatanı yeni, taze bir etiketli tüp setine aktarın.

Süpernatanın, her ayara mililitre RNase A başına dört mikrolitre 10 miligram ekleyin. Daha sonra tüpün içeriğini ters çevirerek veya pipetleyerek karıştırın. Numuneleri 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede tutulan bir ısı bloğunda veya su banyosunda inkübe edin.

Tüpler oda sıcaklığına ulaştıktan sonra numunelere yaklaşık 500 mikrolitre 25:24:1 fenol, kloroform, izoamil alkol karışımı ekleyin. Daha sonra tüplerin içeriğini ters çevirerek veya tekrarlanan pipetleme ile karıştırın. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin.

Yaklaşık 400 mikrolitre olan üst sulu tabakayı yeni bir etiketli tüp setine aktarın. Her tüpteki sulu tabakaya yaklaşık 400 mikrolitre 24:1 kloroform, izoamil alkol karışımı ekleyin. Tekrarlanan pipetleme veya ters çevirme ile numuneyi iyice karıştırın.

Daha sonra tüpleri beş dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin ve yaklaşık 300 mikrolitre üst sulu tabakayı önceden soğutulmuş, etiketlenmiş tüplere aktarın. Ardından, 300 mikrolitre önceden soğutulmuş izopropanol ve 12 mikrolitre 2.5 molar sodyum asetat ekleyin. Daha sonra tüpleri eksi 20 santigrat derecede 30 ila 60 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri dondurucudan çıkarın. Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra peleti yaklaşık 300 ila 500 mikrolitre %70 etanol ile yıkayın.

Yine, tüpleri 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin. Daha sonra peleti rahatsız etmeden, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, peletleri havayla kurutun ve DNA'yı 50 mikrolitre 1X Tris-EDTA tamponunda çözün.

0.2 mililitrelik bir polimeraz zincir reaksiyonu tüpüne bir ila 16 mikrolitre izole DNA ve iki mikrolitre parçalanma reaksiyonu tamponu ekleyin. Son hacmi nükleaz içermeyen su ile 18 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra, iki mikrolitre çift sarmallı DNA parçalanma enzimi ekleyin ve karışımı ağaç saniyeleri boyunca kısa bir süre girdaplayın.

Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede termocycler'da 8,5 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüplere beş mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Kesilen DNA'nın toplam hacmini 50 mikrolitreye ayarlamak için 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin.

Daha sonra oda sıcaklığında tutulan 45 mikrolitre SPRI boncuklarını 50 mikrolitre kesilmiş DNA'ya ekleyin ve ikisini yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Tüpleri içeren numuneyi beş dakika bekletin. Ardından tüpleri manyetik bir plaka üzerine aktarın ve beş dakika daha bekleyin.

Süpernatanı dikkatlice dışarı atın. Daha sonra, manyetik stand üzerindeki tüplere 200 mikrolitre taze% 80 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye daha bekleyin. 30 saniye sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Boncukları manyetik stand üzerinde beş dakika boyunca havayla kurutmak için tüpün kapağını açık bırakın. Daha sonra tüpleri mıknatıs standından çıkarın ve DNA'yı boncuklardan 55 mikrolitre 0.1X Tris-EDTA tamponunda elüte edin. Tekrarlanan pipetleme ile DNA'yı iyice karıştırın.

Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Yine, tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve çözeltinin yaklaşık iki dakika içinde temizlenmesini bekleyin. Süpernatanın 52 mikrolitresini çıkarın ve ardından metin protokolünde belirtildiği gibi DNA miktar tayini analizi yapın.

50 mikrolitre temizlenmiş ve kesilmiş DNA'ya üç mikrolitre endonükleaz, fosfat kalıntı enzimleri ve yedi mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin. DNA'yı ve diğer bileşenleri yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından kabarcıkları çıkarmak için tüpleri döndürün.

Döndürdükten sonra, numuneleri bir termocycler'a aktarın ve programı ayarlayın. 0,6 ila 0,3 mikromolar çalışma konsantrasyonu elde etmek için adaptörü 25 ila 50 kat seyreltin. Yüksek verimli kısa okuma dizilimi için, tüplere 30 mikrolitre ligasyon ana karışımı, bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ve 2,5 mikrolitre adaptör ekleyin.

Tüplerin içindekileri yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Yine, kabarcıkları gidermek için tüpleri döndürün. Daha sonra tüpü 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Tüplere üç mikrolitre ticari urasil-DNA glikozilaz ve DNA glikozilaz liyaz endonükleaz VIII karışımı ekleyin. Toplam hacmi 96,5 mikrolitre olarak ayarlayın. Bileşenleri iyice karıştırın ve 37 santigrat derecede termocycler'da 15 dakika inkübe edin.

Tüpte, tüm reaktifleri temizlenmiş, adaptör bağlı DNA'ya ekleyerek polimeraz zincir reaksiyonu karışımını hazırlayın. Daha sonra girdap yaparak reaksiyonu iyice karıştırın. Girdap bittiğinde, numuneleri termocycler'a koyun ve termocycler amplifikasyon ayarını başlatın.

Numuneye oda sıcaklığında tutulan yaklaşık 25 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile karıştırın. Numuneyi beş dakika inkübe edin. Ardından tüpleri manyetik bir stand üzerine aktarın ve beş dakika daha bekleyin.

Beş dakika sonra, süpernatanı yeni bir etiketli tüp setine çıkarın. Daha sonra, süpernatanı, oda sıcaklığında tutulan altı mikrolitre SPRI boncuk ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneleri beş dakika inkübe ettikten sonra, tüpleri manyetik plaka üzerine aktarın ve beş dakika daha bekleyin.

Süpernatanı çıkarın ve atın. Daha sonra manyetik stand üzerindeki tüplere 200 mikrolitre taze% 80 etanol ekleyin. Daha sonra, tüpleri oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.

30 saniye sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hala manyetik stand üzerindeyken tüpün kapağı açıkken boncukları beş dakika boyunca havayla kurutun. Şimdi tüpleri mıknatıstan çıkarın. Hedef DNA'yı boncuklardan 33 mikrolitre 0.1X Tris-EDTA tamponuna dökün ve iyice karıştırmaya tabi tutun.

Uygun şekilde karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından tüpleri manyetik standa aktarın ve çözelti berraklaşana kadar yaklaşık iki dakika bekleyin. Depolama için 30 mikrolitre süpernatan ila iki mililitrelik tüplere pipetleyin.

Herbaryum DNA'sının izolasyonunu göstermek için, farklı herbaryum örneklerinden izole edilen çift sarmallı DNA ile bir agaroz jeli çalıştırıldı. 10 miligram yaprak dokusu kullanılarak, yaklaşık 3.56 ila 2, 610 nanogram çift sarmallı DNA izole edildi agaroz jeli üzerine yüklendi. Jel, tüm şeritlerde leke şeklinde bozulmuş herbaryum DNA'sını gösterir.

Daha sonra, 10 herbaryum örneğinden izole edilen DNA'dan yüksek kaliteli dizileme kütüphanesinin geri kazanımını göstermek için bir agaroz jeli çalıştırıldı. Agaroz jeli üzerine yüklenmeden önce, izole edilmiş herbaryum DNA'sının yaklaşık 1.26 ila 464 nanogramı enzimatik kesmeye tabi tutuldu ve %90 boncuk hacmi ile temizlendi. Agaroz jeli, 10 herbaryum örneğinin DNA'sından yüksek kaliteli dizileme kütüphanesinin geri kazanımını gösterir.

Son sıralama kitaplıkları, 300 ila 500 baz çifti arasında bir birincil bant gösterir. Daha sonra, herbaryumdan türetilmiş DNA'nın av tüfeği dizisini göstermek için, TK 686 kloroplast genomunun dairesel bir grafiği elde edildi. Dizi, DNA'nın toplam uzunluğunu, ters çevrilmiş tekrar bölgesini ve büyük ve küçük tek kopya bölgelerinin varlığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 13 saatten daha kısa bir sürede 24 numune üzerinde yalnızca yaklaşık sekiz saatlik aktif uygulamalı süre ile gerçekleştirilebilir. Bu prosedürden sonra, filogenetik çalışmalar için nükleer veri üretmek üzere elde edilen kütüphaneler üzerinde dizi yakalama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.