Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması

Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, doğrudan uygulamalar için bakteri hücrelerinden lipoproteinleri çıkarmak ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile yapısal analiz için N-terminal lipopeptitleri daha fazla hazırlamaktır. Bu yöntem, immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü lipoproteinlerin N-terminal yapısı, Toll benzeri reseptör tanıma ve sinyalleşmeyi etkileyerek konakçının bağışıklık tepkisini etkiler. Bu tekniğin benzersiz avantajı, lipoproteinin asilasyon durumunun yapısal olarak atanmasına yardımcı olan, tanısal dehidroalanil iyonuna doğru parçalanmayı teşvik eden isteğe bağlı ancak kasıtlı sodyum eklentilerinin oluşturulmasıdır.

15 mililitre triptik soya suyu veya benzeri zengin ortamlarda geç üstel faza kadar bakteri büyütün. Tris tamponlu salin EDTA veya TBSE ile bir kez yıkamadan önce hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. hücreleri bir milimolar PMSF ve mililitre lizozim başına 0.5 miligram ile 800 mikrolitre TBSE'de yeniden süspanse edin.

Çözeltiyi, 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe etmeden önce vidalı kapaklı ve O-ringli 2.0 mililitrelik dişli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe yaklaşık 800 mikrolitre 0.1 milimetre zirkonya silika boncuk ekleyin, ardından her biri 30 saniyelik beş döngü boyunca bir homojenizatör üzerinde maksimum hızda çalkalayarak hücreleri parçalayın ve her döngü arasında buz üzerinde iki dakikalık bir dinlenme yapın. Numuneyi, pelet boncuklarına ve kırılmamış hücrelere dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir 2.0 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından buz üzerinde tutun. Kalan pelete 200 mikrolitre TBSE ekleyin ve ek bir döngü için homojenizatöre geri dönün. Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve süpernatanı önceki süpernatan ile birleştirin.

Buz gibi TBSE'de eşit hacimde %4 yüzey aktif madde ekleyerek süpernatanı TX-114 yüzey aktif madde ile %2'lik bir nihai konsantrasyona destekleyin. Takviye edilmiş süpernatanı bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin, her 15 dakikada bir ters çevirerek karıştırın. Tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosuna aktarın ve faz ayrımını indüklemek için 10 dakika inkübe edin.

Bifazik ayırmayı korumak için numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Üst sulu fazı nazikçe pipetleyin ve atın. Tüpü orijinal hacmine kadar doldurmak için alt yüzey aktif madde fazına buz gibi soğuk TBSE ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin.

10 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpü 37 santigrat derece su banyosuna aktarın ve faz ayrımını indüklemek için 10 dakika inkübe edin, daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Bu adımları toplam üç ayırma işlemi için bir kez daha tekrarladıktan sonra, üst sulu fazı çıkarın ve atın.

Yüzey aktif madde fazına bir hacim buz gibi soğuk TBSE ekleyerek ekstraksiyonlar sırasında oluşan çökelmiş proteinlerin peletini çıkarın. Çözünmeyen proteini peletlemek için dört santigrat derecede ve iki dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı hemen 1.0 mikrolitre% 100 aseton içeren taze bir 250 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Numuneyi ters çevirerek karıştırın ve proteini çökeltmek için gece boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, lipoproteinleri tüpün yönüne dikkat ederek peletlemek için numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Asetonu boşaltmadan ve numunenin kurumasına izin vermeden önce peleti %100 asetonla iki kez yıkayın.

Ardından, 20 ila 40 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCL, pH 8.0 ekleyin ve çökeltilmiş lipoproteinlerle duvara yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti iyice yeniden süspanse edin. Standart yöntemler kullanarak lipoproteinleri SDS-PAGE ile ayırın. Lipoproteinleri standart bir elektro lekeleme prosedürü kullanarak bir nitroselüloz transfer membranına aktarın.

Nitroselüloz membranı bir kaba aktarın ve Ponceau S solüsyonu ile kaplayın. Beş dakika boyunca veya kırmızı-pembe bantlar görünene kadar hafifçe sallayın. Ponceau S solüsyonunu dökün ve fazla lekeyi çıkarmak için nitroselüloz membranı damıtılmış suyla dikkatlice durulayın.

Temiz bir tıraş bıçağı ile istenen bandı kesin ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bandı tamamen lekelemek için membranı bir mililitre damıtılmış su ile üç kez yıkayın. Bölümü temiz bir yüzeye aktardıktan sonra, nitroselüloz şeridi yaklaşık bir milimetreye bir milimetrelik küçük parçalar halinde doğramak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.

Parçaları 0.5 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Son olarak, parçaları 500 mikrolitre taze hazırlanmış 50 milimolar amonyum bikarbonat, pH 7.8 ile HPLC dereceli bir suda iki kez yıkayın. Nitroselüloz parçalarını, 50 milimolar amonyum bikarbonat içinde mililitre başına 20 mikrogramlık bir Tripsin çözeltisinin 20 mikrolitresinde yeniden süspanse edin.

Karıştırmak için yeniden süspanse edilmiş nitroselüloz parçalarını girdaplayın. Ardından, tüm parçaların Tripsin çözeltisi ile tamamen kaplandığından emin olmak için tüpü kısa bir süre döndürün. Buharlaşmayı önlemek için tüp kapağını parafin film kullanarak kapatın ve sindirimi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Numuneyi 30 saniye boyunca 16.000 kez g'de döndürün ve sıvıyı pipetleyerek çıkarın. Ardından, HPLC dereceli suya 50 mikrolitre %0,5 trifloroasetik asit ekleyin. Karıştırmak için girdaplamadan sonra, tüm parçaların çözelti tarafından kaplandığından emin olmak için numuneyi kısa bir süre döndürün ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Sıvının pipetleme ile çıkarılmasının ardından, bu adımı 50 mikrolitre %10 asetonitril ile tekrarlayın ve ardından 50 mikrolitre %20 asetonitril ile tekrarlayın. Sıkıca bağlanmış lipopeptitleri çıkarmak için, kloroform-metanol içinde çözülmüş mililitre CHCA matrisi başına 15 mikrolitre taze yapılmış 10 miligram ekleyin. Aralıklı girdap ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Sodyum eklenti oluşumunu teşvik etmek için, kloroform-metanol içindeki CHCA çözeltisini sulu sodyum bikarbonat ile bir milimolar nihai konsantrasyona kadar takviye edin. Numuneyi kısa bir süre döndürdükten sonra, sıvıyı yeni bir düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın. Bu çözelti, N-terminal lipopeptitlerin büyük bir kısmını içerecektir.

CHCA ile ayrıştırılmış lipopeptitlerin bir mikrolitresini cilalı çelik bir MALDI hedefine bırakın. Hemen kütle spektrometresine geçin. Enterococcus faecalis lipoprotein PnrA'nın kademeli nitroselüloz yıkama çözeltilerinin örnek kütle spektrumları burada gösterilmiştir.

Sonraki her yıkamada, sinyal yoğunluğunda değişiklikler ve bireysel piklerde bir azalma gözlenir, bu da son elüsyon fraksiyonunda yüksek oranda zenginleştirilmiş N-terminal lipopeptid iyonu ile sonuçlanır. Ana lipopeptit iyonunun MS / MS spektrumu, bir alfa-amino bağlı asil zinciri ve bir monoasilgliserol yapısına sahip N-terminal PnrA triptik peptidine karşılık gelen fragman iyonları ile lisoform olduğunu ortaya koymaktadır. Escherichia coli lipoprotein Lpp'nin ayrıştırılmış lipopeptit fraksiyonuna sodyum bikarbonat eklenmesi, hesaplanan N-terminal kütlesinden 22 Dalton'luk bir artışa neden olur.

Ana iyonun sodyum eklentisine karşı MS / MS analizi, diako tiyogliseril parçasının nötr eliminasyonu yoluyla sodyasyonlu ebeveynin dehidroalanil iyonuna doğru tercihli parçalanmayı gösterir. Bu, N-terminal asilasyon durumunun yapısal olarak belirlenmesine yardımcı olur. Bu prosedürü gerçekleştirirken, her kademeli nitroselüloz yıkama fraksiyonunun kütle spektrometresi ile analiz edilebileceğini ve tek bir deneyde hem protein tanımlamasına hem de lipopeptidin N-terminal karakterizasyonuna izin verdiğini hatırlamakta fayda var.

Bakterilerden lipoprotein ekstraksiyonunu takiben, lipoprotein asilasyon durumunun konakçının bağışıklık tepkisini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için Toll benzeri reseptör sinyalini ölçen hücre bazlı testler gibi diğer deneyler yapılabilir.