Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Bu videoda metabolik haritalamanın nasıl yapılacağı gösterilmektedir. Dehidrojenazlar adı verilen spesifik enzimlerin aktivitesini ölçmek için bir prosedür. Hücreler bir mikroskopi lamına veya donmuş bir dokuya yapışır.

Onlarca yıl önce, mikroskop altında doku ve hücrelerdeki aktiviteyi tespit etmek için enzimistokimya adı verilen bir dizi metabolik haritalama tekniği geliştirdik. Bununla birlikte, geçen yüzyılın sonundaki genetik devrim sırasında metabolizma modası geçmiş hale geldi. Ama şimdi, metabolizma tekrar sıcak.

Örneğin, kanser hücrelerine bakın. Metabolizma artık terapötik bir hedef olarak kabul edilmektedir ve bu nedenle hücre ve dokulardaki aktivite tayinleri tekrar sıcaktır. Reaksiyon tamponunun önemli bir bileşeni polivinil alkol veya PVA'dır.

Bu, %18'lik bir konsantrasyonda fosfat tamponunda çözülür PVA, solunduğunda tozlu ve toksiktir, bu nedenle PVA'yı bir davlumbaz altında tarttığınızdan emin olun. Fosfat tamponundaki yüksek PVA konsantrasyonu nedeniyle, karıştırırken reaksiyon tamponu şişesini benmari usulü ısıtın. Kapağı şişeye gevşek bir şekilde vidaladığınızdan emin olun, aksi takdirde şişe patlayabilir.

PVA'nın fosfat tamponunda tamamen çözülmesi 15 dakika kadar sürebilir. Eğer öyleyse, çözelti, karıştırmanın neden olduğu küçük hava kabarcıkları ile şeffaf olmalıdır. Viskoz PVA çözeltisi, geniş bir pipet kullanılarak bir reaksiyon tampon tüplerine pipetlenebilir.

PVA'nın katılaşmasını önlemek için tüpleri en az 40 santigrat derece veya daha yüksek tutun. Bir mililitre PVA çözeltisi, yaklaşık dört sitospin veya iki doku preparatı için iyidir. Reaksiyon tamponunun diğer bileşenleri için, nitroBT olarak da adlandırılan sarı nitroblue tetrazolyum klorür, Bunsen brülöründe bir cam şişede ısıtılırken bir etanol ve dimetilformamid karışımı içinde çözülür.

Çözelti kaynamamalıdır, aksi takdirde hacim çok fazla azalacaktır. Bu yüzden şişeyi alevde çok uzun süre bırakmayın ve düzenli olarak çalkalayın. Çözündükten sonra buz üzerinde tutun ve çözünmüş nitroBT hızla yok olduğu için bir sonraki adıma hızlıca geçin.

NitroBT, çözünmüş halde tutulmadığında etanol ve DMF içeren cam şişenin dibinde kalacak sarı bir tozdur. NitroBT'nin çözülüp çözülmediğini birkaç kez kontrol edebilirsiniz. Çözelti daha sonra sarı şeffaf olacaktır.

NitroBT çözündüğünde, PVA çözeltisini içeren şişelere pipetlenebilir. NitroBT ve tamponu karıştırmak için ince bir kaşık veya ince bir spatula kullanarak hafifçe karıştırın. Bunu, tam metnin birinci tablosunda listelenen reaksiyon tamponunun tüm bileşenleri için adım adım yapın.

Reaksiyon bileşenlerini PVA çözeltisine karıştırırken çok fazla hava kabarcığı yapmamaya çalışın. İşin püf noktası, kaşığı veya spatulayı solüsyondan çıkarmadan sürekli karıştırmaktır. Elektron taşıyıcısı, metoksi fenazinyum metil sülfat, ışıktan korunmalı ve en son reaksiyon tamponunda çözülmelidir.

MPMS'nin kırmızı rengi, tüm bileşenlerin doğru şekilde çözülüp çözülmediğini iki kez kontrol etmek için uygundur. Reaksiyon tamponunu hazırlarken ve bileşenleri içine karıştırırken, slaytları ılık su içeren bir inkübatörde 50 dakika önceden ısıtın. Kuluçka odasının içinde düşük bir su seviyesi tutun.

Kapak kapalıyken, bu reaksiyon ortamını nemli tutacaktır. Kapak açıkken su, slaytları ılık bir sıcaklıkta tutacaktır. Reaksiyon tamponunu bir cam pipet kullanarak hücre veya doku preparatlarına uygulayın.

Küçük hava kabarcıkları için endişelenmeyin, çünkü bunlar yüzeye akacak ve hücrelerdeki veya dokulardaki reaksiyona müdahale etmeyecektir. Kuluçka süresi boyunca kuluçka odasının kapağını kapalı tutun. Bu, PVA tamponunun kurumasını önlemek için reaksiyonun nemli bir ortamda gerçekleşmesini sağlayacaktır.

Metabolik haritalama deneylerindeki çoğu dehidrojenaz reaksiyonu 37 santigrat derecede meydana gelir. Slaytları reaksiyon tamponunda önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edin, bu tam metin makalesinin birinci tablosunda bulunabilir. Dehidrojenazların aktivitesi nedeniyle hücreler veya doku koyu mavi veya mora dönerken reaksiyonun işe yarayıp yaramadığı kolayca görülebilir.

Bu da sonuçta, dehidrojenaz aktivitesi bölgesinde çökelen koyu mavi formazole renksiz çözünmeyen nitroBT'ye dönüşür. Enzimatik reaksiyon üç adımda durdurulur. İlk olarak, fazla inkübasyon ortamı bir doku üzerine çekilmelidir.

İkinci olarak, inkübasyon ortamı, 60 santigrat derecede 5.3 PH'lık bir fosfat tamponunda mekanik yıkama kullanılarak mikroskopi slaytlarından yıkanmalıdır. Üçüncüsü, mikroskopi slaytları 20 dakika boyunca 60 santigrat derecede PH 5.3'lük taze fosfat tamponunda bırakılmalıdır. Dördüncüsü, fosfat tamponu musluk ve ardından damıtılmış su kullanılarak durulanabilir.

Reaksiyon tamponunun çıktığı kolayca görülebilir. Durdurucu tamponun düşük PH'ı, hücrelerin içindeki dehidrojenaz reaksiyonunun durdurulmasına yardımcı olur. Bir seferde ne kadar slayt işlediğinize bağlı olarak slaytları bir veya iki kez yeni durdurma tamponuna yerleştirin.

Ayrıca slaytları musluk suyuyla durulayın ve damıtılmış suyla bitirin. Şimdi, slaytlar bir sürgü ısıtıcısında kurutulabilir ve kapatılabilir. Sürgünün arka tarafını silerek dikkatlice kurulayın ve önceden 50 ila 60 santigrat dereceye ısıtılmış bir sürgü ısıtıcısına yerleştirin.

Slaytlar kuruduğunda, slaytları kapatmak ve korumak için bir gliserin gliserol çözeltisi ve kapak fişleri kullanılabilir. Görüntü alma işlemine devam edene kadar slaytları buzdolabında saklayın. Bu, bu videoda gösterilen deneyde işlenen bir cam slayt üzerindeki temsili bir doku bölümünün renkli bir fotoğraf mikrografıdır.

Bu bir glioblastoma bölümüdür ve lepto dehidrojenaz araştırılan enzimdir. Her dehidrojenaz, varlık PH'ı üretir ve her varlık PH molekülü, bir nitroBT molekülünü, sarı tetrazolyum tuzunu, bu görüntüde gösterilen mor çökelti olan bir formazol molekülüne dönüştürür. Koyu mor ile gösterilen tümör hücrelerinde hücre içinde yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi görülebilir.

Kan damarları daha düşük aktiviteye sahiptir ve beyazdır. Bu, slaytın aynı bölgesinin tek renkli bir görüntüsüdür. Protokolde tarif edildiği gibi enzim aktivitesini ölçmek için kullanılabilir.

Ne kadar çok formazan üretilirse, piksel o kadar koyu ve emilim o kadar yüksek olur. Absorbans daha sonra üretilen varlık ph'ın pikomollerine dönüştürülebilir. Bu nedenle metabolik haritalama yapmak kolaydır.

Çok hızlı ve ucuz. Bu yüzden araştırmanızda kullanın.