Name: Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Keşfedin, CRISPR/Cas9 ve HMEJ stratejisi kullanarak canlı organizmalarda yüksek verimli hedeflenen gen entegrasyonu yöntemini. Bu teknik, gen terapisi ve genetik mutasyon düzeltme çalışmalarında umut vadeden bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser CAS stratejik öncelik araştırma programı (XDB02050007, XDA01010409), ulusal Hightech R & D programı (863 Program; 2015AA020307), Çin Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (verir NSFC 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Çin Gençlik bin yetenekleri programı (için HY), ara Çin bilim, Shanghai şehir Komitesi, bilim ve teknoloji Projesi (16JC1420202 HY için), Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (çoğu; 2016YFA0100500).

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Shanghai Enstitüleri tarafından biyolojik bilim (CA) için onaylanmıştır.
1. donör plazmid tasarımını
<ol><li>
SgRNA seçimi
	<ol>
<li>Online CRISPR tasarım araçları hedef bölge11,12,13,14,15sgRNAs tahmin etmek için kullanın. Cdx2 odağı için altı farklı sgRNAs tasarım (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) stop kodonu ile daha yüksek rütbe ve daha düşük potansiyel kapalı-(şekil 1A)16hedefler.</li>
		<li>Cas9-CMV-EGFP ifade vektörel çizimler ve sgRNA 2 µg BbsI sindirim (20 µL hacmi 1 U/µL son bir konsantrasyon, 37 ° C'de 2 h için BbsI, 1 µL) tarafından linearize. Sonra ürün jel arıtma kiti ile % 1'özel jel 1 × TAE arabelleği tarafından arındırmak.</li>
		<li>Mix 1 × T4 DNA ligaz arabelleği 50 µM. son bir konsantrasyon için 10 µL sgRNA oligonucleotides bir çift kuluçkaya bir sıcaklık değişim oranı, 5 ° C/5 dk (95 ° C 5 min için ile 95 ° c ile 25 ° C arasında bir sıcaklık gradyanı kullanarak oligo çözüm o zaman 90 ° C 5 dk, 5 dk, vbiçin 85 ° C.), hangi oligos TAV.</li>
		<li>Mix 4 µL olan ürün, doğrusallaştırılmış vektör 2 µL 1 × T4 DNA ligaz arabelleği, 10 µL T4 DNA ligaz 1 µL ile komplementer ve 22 ° c için 1-2 h (şekil 1B) ligate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Arazi nükleaz tahlil sgRNA Not: Çakma deneme için kullanılan sgRNA hedefleme verimliliğini surveyor nükleaz tahlil tarafından değerlendirilir (diğer bir de ben (T7EI) T7 endonükleaz tahlil)17. Yüksek DNA bölünme verimlilik ve sgRNA kesme sitesi ve kodonu arasında düşük bir mesafe ile sgRNA seçin.<ol>
<li>Cas9-sgRNA-EGFP ifade vektörel çizimler N2a hücre satır içine transfect %1 PSG ve % 1 gerekli olmayan amino asit transfection tarafından DMEM % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş olarak kültürlü, kit ( Tablo malzemelerigörmek). Transfected hücreleri % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>5.000 transfected hücreleri (GFP+) floresan aktif hücre (FACS) sıralama, kuluçka 48 saat sonra toplamak olmayan transfected hücreler bir denetim olarak kullanma.</li>
		<li>2-5 µL oflysis tampon (%0.1 Triton X-100, % 0,1 ara 20 ve 100 µg/mL İndinavir K) 30 dk 56 ° C'de kendine hakim hücre sindirmek ve ısı İndinavir K 95 ° c 10 dk sonra devre dışı.</li>
		<li>Üreticinin iletişim kuralını kullanarak iç içe geçmiş PCR (Tablo 1) tarafından örnek yükseltmek. PCR ürünlerinin boyutu 300-500 bp için ayarlanır.<ol>
<li>Mix 1 µL DNA polimeraz ve dış astar sgRNA hedef site (0,1 µM, son konsantrasyonu) çevresinde sıra tanıma bir çift ile lizis ürünün (Tablo 1) ve birincil PCR 20 µL hacmindeki gerçekleştirin.</li>
			<li>DNA polimeraz 95 ° c 5 min için etkinleştirmek ve 30 95 ° C'de 30 döngüleri için birincil PCR gerçekleştirmek s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 24 s (1 dk./1 kb), 5 min için 72 ° C'de son uzantılı.</li>
			<li>Birincil PCR ürününün 1 µL ve iç içe geçmiş iç astar bir çift kullanarak ikincil PCR gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Denatüre ve 300-600 ng 1 × T7EI reaksiyon arabelleği (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT pH 7,9) 20 µL arıtılmış PCR ürününün yeniden tavlama sıcaklığı 95 ° c ila 25 ° C bir degrade, 5 ° C/5 dk bir oranla kullanarak.</li>
		<li>Tavlanmış PCR ürünleri ve sindirmek için 2 h 37 ° C'de T7EI enzim 1 µL ekleyin. Sonra parçaları ( Tablo malzemelerigörmek) ayrılır kadar sindirim ürün % 2 özel jel 1 × TAE arabelleği 120 V 40 min için çalıştırın.</li>
		<li>ImageJ grup yoğunluklarda kesim ve saf DNA belirlemek için kullanın. Daha önce yöntemlerle Indel frekans9 (şekil 1C) bildirilen hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Donör vektör inşaatı Not: Cdx2 gen HMEJ donör vektörel çizimler oluşturmak için bir donör DNA oluşturmak (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) 23 ile çevrili nt Cdx2-sgRNAs hedef sıra iki ucunda (şekil 1D ve şekil 1E). Hedef sıra PAM homolog kol ucuna bitişik. Gibson derleme klonlama HMEJ donör için önerilir.<ol>
<li>800 bp sol homoloji kol (HAL) ile ileri astar-1F yükseltmek (15-20 nt örtüşme vektör, 23 serisinden içeren nt Cdx2-sgRNA hedefleme sırası ve yaklaşık 20 nt serisinden HAL) ve ters astar-1R (15-20 bp örtüşme serisinden içeren p2A-mCherry ve yaklaşık 20 nt serisinden HAL) 0,1 µM son konsantrasyonu 200 ng/µL (şekil 1D, Tablo 1) fare genomik DNA'yı kullanarak.</li>
		<li>P2A-mCherry ekleme parçası ile ileri astar-2F (15-20 nt örtüşme serisinden HAL ve yaklaşık 20 nt serisinden ekleme parçası içeren) yükseltmek ve astar-2R (15-20 nt örtüşme serisinden HAR ve yaklaşık 20 nt serisinden içeren ters ekleme parçası) 0,1 µM son konsantrasyonu genomik DNA veya plazmid muhabir serileri 100 ng/µL veya 30 ng/µL (şekil 1D, Tablo 1) ile kullanarak.</li>
		<li>800 bp doğru homoloji kol (HAR) ile ileri astar 3F yükseltmek (15-20 nt örtüşme vektör, 23 serisinden içeren nt Cdx2-sgRNA hedefleme sırası ve HAR yaklaşık 20 nt serisinden) ve ters astar-3R (15-20 nt örtüşme serisinden içeren p2A-mCherry ve HAR yaklaşık 20 nt serisinden) 0,1 µM son konsantrasyonu 200 ng/µL (şekil 1D, Tablo 1) fare genomik DNA'yı kullanarak.</li>
		<li>PCR ürünlerinin % 1'özel jel 1 × TAE arabelleği çalıştırın ve beklenen boyutu PCR ürünlerinin jel ekstraksiyon kiti tarafından üreticinin yönergelerine göre (Tablo 1) arındırmak.</li>
		<li>50-100 ng KpnI ve XbaI ile bir yapı vektörünün sindirmek. Mix 2 µL 30-40 ng/µL üç PCR ile de doğrusallaştırılmış Yöneyin Gibson mix x 2 parçaları (1 µL için her, 100-200 ng/µL) güçlendirilmiş. Son 10 µL.Incubate 50 ° c 60 dk için mix için ayarlamak için H2O ekleyin.</li>
		<li>Yetkili E. coli dönüşümü hücreleri monte ürün ve özü plazmid DNA ekstraksiyon kiti üreticinin yönergelerine uygun olarak oluşturur. HMEJ donör tarafından DNA sıralama doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. genom HMEJ tabanlı yöntemi kullanma fare embriyo düzenleme
<ol><li>
Üretim Cas9 mRNA
	<ol>
<li>Cas9 mRNA hazırlık için Tablo 1' de listelenen uygun astar çiftini kullanarak PCR güçlendirme tarafından bölge desteği T7 organizatörü sıra Cas9 için ekleyin. Astar Cas9 F/R 0,1 µM son bir konsantrasyon ve 20 eklemek Cas9, ng vektör 1 × yüksek sadakat DNA polimeraz karışımı için ifade. H2o 50 µL için son ses seviyesini</li>
		<li>DNA polimeraz 95 ° c 5 min için etkinleştirmek ve PCR 36 devredir 30 95 ° c gerçekleştirmek s, 30 60 ° C s ve 68 ° C 4 dakika (1 dk./1 kb), 10 dk 68 ° C'de son uzantılı.</li>
		<li>T7-Cas9 PCR ürünü vitro transkripsiyon (IVT) için arındırmak ve 0.5-1 uyarlamak µg DNA mRNA transkripsiyon kiti için üreticinin yönergelerine göre 20 µL toplam hacmi 8 h 37 ° C'de tarafından (bkz. Tablo malzeme).</li>
		<li>Dnaz 1 µL 15 dakika Ekle Poli-A kuyruk 37 ° C'de 45 dakika süreyle 37 ° C'de DNA şablonunu kaldırmak ve Cas9 mRNA RNA arıtma paketi tarafından üreticinin yönergelerine göre kurtarmak için karışıma ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SgRNA imalatı
	<ol>
<li>T7 organizatörü yüksek sadakat DNA polimeraz ile tahrik sgRNA şablonu oluşturun. Vektör şablon olarak içeren bir sgRNA iskele seçin. Kullanılan astar Tablo 1' de listelenmiştir.</li>
		<li>T7-sgRNA PCR ürünü arındırmak ve 0.5-1 kullanmak µg DNA için üreticinin yönergelerine göre 20 µL toplam hacmi 6 h 37 ° C'de bir kısa RNA transkripsiyonu kit kullanarak sgRNA, vitro transkripsiyonu için şablon olarak ( malzemeler tablo bkz < / c11 >).</li>
		<li>Dnaz 1 µL karışıma ekleyin ve kuluçka DNA şablonunu kaldırmak 15 dakika 37 ° C'de devam edin. SgRNAs RNA arıtma paketi tarafından arındırmak (bakınız Tablo reçetesi) Yukarıdaki gibi.</li>
		<li>SgRNA 500 ng/µL RNase free su için sulandırmak ve örnekleri −80 ° C de 3 aya kadar saklayın. Not: Alternatif bir ikame daha iyi kesme verimliliği18,19,20CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo koleksiyonu, mikroenjeksiyon ve vitro kültürü
	<ol>
<li>48 saat sonra insan Korionik gonadotropin (hCG) tarafından takip kadın B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) fareler (7-8 haftalık) tarafından hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG), superovulate. Sonra hCG enjeksiyonu, B6D2F1 erkek ev kadınları gecede.</li>
		<li>Dişiler tarafından CO2 anestezi, 24 h hCG enjeksiyonu sonra kurban. Döllenmiş embriyo (30-50 embriyolar her kadın için ile) onların oviducts M2 orta toplamak.</li>
		<li>Yer KSOM orta içine döllenmiş embriyo (yaklaşık 300 yumurta için bir günlük enjeksiyon) (5,55 g/M NaCl, 0,19 g/L KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/M glikoz, 1.12 g/L sodyum laktat, 2.1 g/L NaHCO3 , 0,02 g/L sodyum pyruvate, 0, 25 g/L CaCl2•2H2O, 0,004 g/M EDTA, 0,146 g/L L-glutamin ve 1 g/L sığır serum albümin) bir kuluçka %5 CO237 ° C'de.</li>
		<li>Mix Cas9 mRNA (100 ng/µL), sgRNA (50 ng/µL) ve HMEJ donör vektör (100 ng/µL) ve için 10 µL. son ses seviyesini ayarlamak için H2O koymak karışımı buz ekleyin.</li>
		<li>Çek kapiller iğneler (dış çap 1.0 mm, iç çapı ile filaman 0,78 mm) bir Micropipette çektirmenin kullanarak (Parametreler: ısı, 74 çekme, 60; hız, 80; / gecikme, 200; basınç, 300. Malzemelerin tabloyabakın). Ticari iğneler mikroenjeksiyon için alternatif bir ikame olurdu.</li>
		<li>Karışımı olası bir birim zigotları sitoplazma HEPES-CZB orta 5 µg/mL cytochalasin bir microinjector sabiti ile kullanarak B içeren bir damlacık içinde iyi tanımlanmış pronuclei ile enjekte akış ayarları (Şekil 2A) (bkz: Tablo malzemelerin)21. Not: Her grup zigotları enjekte edilebilir 20-30 dk. içinde Cytochalasin B enjeksiyon sonra fare zigot canlılık artırabilir. Alternatif olarak, mikroenjeksiyon22daha önce açıklandığı gibi piezo sistemi ile çalıştırılabilir.</li>
		<li>KSOM orta altında %5 CO2 blastosist kadar sahne Floresans gözlem (2B rakamlar ve 2C) için 3,5 gün sonra 37 ° C'de enjekte zigotları kültür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo transferi ve fareler nesil
	<ol>
<li>Estrous ICR dişi fareler vasectomized ICR erkek fareler ile enjeksiyon olarak aynı gün dostum.</li>
		<li>37 ° C altında %5 CO2ve transfer 25-30 2 hücreli embriyo içine oviducts pseudopregnant ICR kadın 0.5 gün sonrası coitum (dpc), 2-hücre aşamada içine enjekte zigotları kültür. Alıcı anneler yavrularını 19.5 dpc teslim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare Genotipleme
	<ol>
<li>Fare genomik DNA bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ayak veya kuyruk örnekleri üreticinin yönergelerine göre ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>PCR ampliﬁcation gerçekleştirmek için bir şablon olarak UV/vis spektrometresi tarafından ölçülen genomik DNA'ın 200-400 ng kullanarak çakma olayların 5' ve 3' kavşak tanımlayın.<ol>
<li>DNA polimeraz 95 ° c 5 min için etkinleştirmek ve PCR 38 devredir 30 95 ° c gerçekleştirmek s, 30 60 ° C s ve 72 ° C için 1 dk (1 dk./1 kb), 10 dk 72 ° C'de son uzantılı. 5' birleşme, için ileri astar, HAL, çakma parçası (p2A-mCherry) üzerinde geriye doğru bir akış yukarı kullanın. 3' olarak Kavşağı, çakma parçası (p2A-mCherry), ileri astar ters bir HAR (Tablo 1) ile aşağı kullanmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>6 µL PCR ürününün % 1'özel jel 1 × TAE arabellek ve onay beklenen parça boyutu için çalıştırın. Daha sonra onları (Şekil 2D) sıralama DNA tarafından doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HMEJ-Based In Vivo genom tetkikine içinde düzenleme
<ol><li>Bir yasaklama cihazda yer alıcı C57BL/6J fare (8 hafta) ve kuyruk slit koymak.</li>
	<li>HMEJ donör vektörel çizimler (30 µg) ve spCas9 ifade vektörler (30 µg) 2 mL tuzlu su çözeltisi içinde karıştırın. Denetim deney için HMEJ donör vektörel çizimler (30 µg) 2 mL serum fizyolojik çözüm (şekil 3A) askıya alma.</li>
	<li>Fare kuyruğu % 70 etanol ile temizleyin. Kuyruk içine iğne damar ve 5-7 s. plazmid DNA çözümünüzde enjekte Ekle iğneyi çıkarın ve yasaklama aygıttan fare düğmesini serbest bırakın.</li>
	<li>Fareler CO2 anestezi tarafından enjeksiyon sonra 5-9 gün sonra kurban. Fareler transcardially % 0,9 serum fizyolojik ile sıvı, Peristaltik pompa kullanarak % 4 paraformaldehyde tarafından takip ve karaciğer gecede 4 ° C'de düzeltmek</li>
	<li>Tüp altına batmadan kadar % 30 Sükroz gecede, kullanarak doku kurutmak.</li>
	<li>Donmuş doku karaciğer örnekleri için 10 µm kalınlığında, bölüm.</li>
	<li>Sonraki bölümlerde fosfat tamponlu 0.1 M (PB) üç kez durulama ve onları ile birincil antikor kuluçkaya: tavşan anti-mCherry (% 5'seyreltilmiş NGS) gecede 4 ° C'de</li>
	<li>Bölümlerde üç kez PB yıkama ve sonra onları ile ikincil antikor kuluçkaya: Cy3-AffiniPure keçi Anti-tavşan IgG orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 h için.</li>
	<li>20 dk için DAPI bölümlerle ve montajı ile gliserin cam slaytlara daha da floresan gözlem (şekil 3B) için counterstain.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR%2FCas-Mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560(2014).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841(2015).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li>
<li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+ligation-gated+recombination+%28ObLiGaRe%29%3A+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li>
<li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li>
<li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li>
<li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology%3A+Transgenic+primate+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92(2017).</li>
<li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR%2FCas+Ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li>
<li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li>
<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

HMEJ donör plazmid yapımında en önemli adım vardır: (1) yüksek DNA bölünme verimlilik ve düşük arasındaki mesafeyi sgRNA kesme makinası ve kodonu, HMEJ donör (2) uygun inşası ile sgRNA yelpazesi. CRISPR/Cas9-aracılı bölünme (sgRNA hedef siteleri ve ~ 800 bp homoloji silah içeren) her iki transgene donör vektör Tarih ve hedeflenen genom verimli ve hassas hedeflenen entegrasyon için gerekli içinde vivo. Çakma HMEJ tabanlı yöntemi kullanma fare nesil en kritik adımlar şunlardır: (1) yüksek kalitesi (hiçbir dejenera...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Kesin, hedeflenen genom düzenleme kez klinik tedavi ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri üretmek için gereklidir. Düzenleme, çinko parmak nükleaz (ZFN), gibi transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs), verimli hedeflenen genom için çeşitli stratejiler geliştirmek için çok çaba yapılmış ve CRISPR/Cas9 sistemleri. Bu stratejiler hedeflenen DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) genom oluşturmak ve homolog rekombinasyon (HR)1,2, microhomology-aracılı sonunda (MMEJ)3 katılma gibi içsel DNA onarım sistemleri yararlanmak , 4 , 5ve homolog bitiş transgenes1,9hedeflenen Tümleştirme ikna etmek için (NHEJ)6,7,8 katılmadan. İK tabanlı strateji şu anda en sık kullanılan düzenleme yaklaşımı, hücre hatlarında çok etkili, ama geç S/G2 aşamasında kısıtlı onun oluşumu nedeniyle olmayan bölme hücrelere kolayca erişilebilir değil genom olduğunu. Böylece, insan kaynakları tabanlı strateji genom vivo içinde düzenleme için geçerli değildir. Son zamanlarda, NHEJ tabanlı strateji verimli gen knock bileşeninde fare doku8için geliştirilmiştir. Yine de, NHEJ tabanlı yöntem genellikle hassas genom düzenleme, özellikle çerçeve füzyon genlerin8oluşturmak çalışırken oluşturmak üzere kavşaklar, indels sunar. Hedeflenen bütünleşmesidir kesin genom düzenleyebilen MMEJ tabanlı. Ancak, sadece mütevazi önceki raporlar5hedeflenen entegrasyon verimliliği artırır. Bu nedenle, kesin hedeflenen entegrasyon içinde vivo verimliliğini artırmak acilen geniş tedavi edici uygulamaları3için gereklidir.
Kısa bir süre önce bir eser bulunmaktadır (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı sonunda gösterdi-strateji, tüm bildirilen stratejileri vitro ve in vivo10içinde en yüksek hedefli entegrasyon verimliliği gösterdi dayalı. Burada, biz HMEJ sisteminin kurulması için bir iletişim kuralı tanımlamak ve aynı zamanda faiz ve donör gen hedefleme tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) vektörel çizimler inşaat vektörler barındıran sgRNA hedef siteleri ve ~ 800 bp homoloji silah (şekil 1) . Bu protokol için biz de ayrıntılı adımlar için hedeflenen doku içinde vivoWuppertal'de DNA çakma fareler ve kısa adımlar oluşturmada açıklar. Ayrıca, HMEJ tabanlı strateji bir kanıtı-of-concept çalışma Fah mutasyon düzeltmek ve daha fazla terapötik potansiyelini ortaya Fah- / - Karaciğer yetmezliği fare, kurtarmak için onun yetenek gösterdi.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>pAAV vektör</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td> EFs promotörü AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 <td>tarafından yönlendirilen insan kodonu için optimize edilmiş bir SpCas9'u kodlamak için AAV vektörü</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bir p2A-mCherry muhabirini fare Actb'ye kaynaştırmak için HMEJ bağışçısı. EF1a promotörü tarafından yönlendirilen EGFP ve Actb'yi hedefleyen U6 güdümlü sgRNA'lar. AAV omurgası.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 HMEJ donörü</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>HMEJ donörü, bir p2A-mCherry raportörünü fare Cdx2 ile kaynaştırmak için.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Tamponu 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonükleaz I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid EndoFree-Midi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KİTİ 20 RXNS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KITI 25 RXNS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Cihazı</td><td>P-97</td><td>&nbsp; Mikropipet Çektirme (parametreler: ısı, 74; çekme, 60; hız, 80; zaman/gecikme, 200; basınç, 300)</td></tr><tr><td>borosilikat cam</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td><td>kılcal damar tipi (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.78 mm filamentli)&nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet mikroenjektör</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donma mikrotomu</td><td>Leica</td><td>CM1950-Kriyostat</td><td>kalınlığı&nbsp; nın&nin&nbsp; 40&nbsp; &mu; m&nbsp; için&nbsp; beyin,&nbsp; 10 & mu; m&nbsp; için&nbsp; </td></tr><tr><td>karaciğer Tavşan anti-mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Keçi Anti-Tavşan IgG Jackson</td><td>İmmünoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco 11140050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalem, Strep, Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Tıp</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Tıbbı</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Sitokalasin B</td><td>Sigma</td><td>CAT # C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM + AA, D-Glikoz ve Fenol Kırmızı</td><td>Millipor</td><td>ile CAT # MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı Milliporlu M2 Orta</td><td></td><td>CAT # MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen integration crispr/cas9-aracılı vivo içinde

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir umut verici genom düzenleme platformu olarak, CRISPR/Cas9 sistem transgenes hedeflenen entegrasyonu için özellikle verimli genetik manipülasyon için büyük potansiyele sahiptir. Ancak, homolog rekombinasyon (HR) düşük verimliliğini ve çeşitli Indel mutasyonlar (NHEJ) katılmadan homolog olmayan sonu nedeniyle-sigara bölen hücreleri, in vivo genom kalır düzenleme stratejileri büyük bir meydan okuma dayalı. Burada, biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-esaslı CRISPR/Cas9 sistem verimli vivo içinde kesin hedeflenen tümleştirme için. Bu sistemde, vektör hedeflenen genom ve donör içeren homoloji silah (~ 800 bp) dizileri CRISPR/Cas9 tarafından i ciddi tek Kılavuzu RNA (sgRNA) hedef tarafından çevrili. Bu HMEJ tabanlı strateji verimli transgene Tümleştirme fare zigotları yanı sıra tetkikine vivo içindeelde eder. Ayrıca, bir HMEJ tabanlı strateji fumarylacetoacetate hidrolaz (Fah) mutasyon tetkikine düzeltilmesi için verimli bir yaklaşım sunuyor ve Fahkurtarır-eksikliği bağlı Karaciğer yetmezliği fareler. Birlikte ele alındığında, odaklanan entegrasyonu hedefleyen, bu HMEJ tabanlı strateji uygulamaları, üretimi hedeflenen gen terapileri ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri de dahil olmak üzere çeşitli için umut verici bir araç sağlar.

Fare embriyo genom HMEJ tabanlı düzenleme: HMEJ tabanlı yöntemi çakma verimliliğini fare zigotları tanımlamak için biz Cas9 mRNA, p2A-mCherry muhabir gene Cdx2 son kodonu ile sigorta için tasarlanmı Cdx2 gen ve HMEJ donör fare zigotları hedefleme sgRNA teslim gen (Şekil 2A). Blastokistlerin kültür içine enjekte zigotları geliştirdi. Çakma etkinliğini değerlendirmek için mCherry floresan floresan mikroskop il...

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Bu HMEJ stratejisinin genel amacı, genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin oluşturulması ve hedefe yönelik gen terapileri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için umut verici bir genetik araç sağlamaktır. Bu HMEJ önlemi geçti. Genetik ve nöro alanda da önemli soruları olabilir.Transgenlerin in vivo olarak kesin hedefli entegrasyonunun verimliliğinin nasıl artırılacağı gibi. Bu HMEJ tabanlı stratejinin ana avantajı, gen mutasyonlarını in vivo olarak yüksek verimlilikle düzeltme yeteneğidir. Bunu takip eden potansiyel olarak terapötiktir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Xing Wang olacak. Protokole başlamak için, daha önce Cas9 sgRNA EGFP ekspresyon vektörleri ile floresanla aktive edilmiş hücre sıralama veya FACS ile transfekte edilmiş 5000 N2a hücresini, transfekte edilmemiş hücreleri kontrol olarak kullanarak toplayın. Toplanan hücreleri 30 dakika boyunca 56 santigrat derecede 2 ila 5 mikrolitre lizis tamponunda sindirin.Daha sonra proteinaz K'yi 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve aktive edin. Üreticinin protokolünü kullanarak iç içe PCR ile numuneyi yükseltin. Lizis ürününün bir mikrolitresini DNA polimeraz ve sgRNA hedef bölgesi etrafındaki diziyi tanıyan bir çift dış primer ile karıştırın ve birincil PCR'yi toplam 20 mikrolitrelik bir hacimde gerçekleştirin.Daha sonra, DNA polimerazı 95 santigrat derecede 5 dakika aktive edin, ardından 5 dakika boyunca 72 santigrat derecede son bir uzatma ile birincil PCR'yi gerçekleştirin. İkincil PCR'yi bir mikrolitre birincil PCR ürünü ve bir çift iç içe geçmiş astar kullanarak gerçekleştirin. 300-600 nanogram saflaştırılmış PCR ürününün 20 mikrolitre 1x TC7EI reaksiyon tamponunda denatüre edilmesi ve yeniden tavlanması.Tavlanmış PCR ürünlerine bir mikrolitre T7EI enzimi ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Daha sonra sindirim ürününü% 2 agaroz jel ve 1x TAE tamponu üzerinde 120 voltta 40 dakika boyunca parçalar ayrılana kadar çalıştırın. Kesilmiş ve kesilmemiş DNA'nın bant yoğunluklarını belirlemek ve indel frekansını hesaplamak için ImageJ'yi kullanın.Cas9 mRNA hazırlığı için, PCR amplifikasyonu ile T7 promotör dizisini Cas9 kodlama bölgesine ekleyin. Daha sonra, 1x yüksek kaliteli DNA polimeraz karışımına 0.1 mikromolar ve 20 nanogram Cas9 eksprese eden vektör nihai konsantrasyonunda Cas9 FR primerini ekleyin. Son hacmi nükleaz içermeyen su ile 50 mikrolitreye ayarlayın.DNA polimerazı 95 santigrat derecede 5 dakika aktive edin ve PCR'yi gerçekleştirin. T7 Cas9 ve PCR ürününü in vitro transkripsiyon veya IVT için saflaştırın. Daha sonra, toplam 20 mikrolitre hacimde 8 saat boyunca 37 santigrat derecede bir mRNA transkripsiyon kiti kullanarak 0,5 ila 1 mikrogram DNA'yı kopyalayın.DNA şablonunu 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca çıkarmak için karışıma 1 mikrolitre DNaz ekleyin. 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca bir poli(A) kuyruğu ekledikten sonra, Cas9 mRNA'yı bir RNA saflaştırma kiti ile geri kazanın. Önceki bölümde gerçekleştirildiği gibi yüksek kaliteli DNA polimerazlı bir T7 promotörü tarafından yönlendirilen sgRNA şablonunu oluşturun ve şablon olarak vektör içeren bir sgRNA iskelesi seçin.T7 sgRNA PCR ürününü saflaştırdıktan sonra, toplam 20 mikrolitre hacimde 6 saat boyunca 37 santigrat derecede kısa bir RNA transkripsiyon kiti kullanarak sgRNA'nın in vitro transkripsiyonu için şablon olarak 0,5 ila 1 mikrogram DNA kullanın. 6 saatlik inkübasyondan sonra, karışıma 1 mikrolitre DNaz ekleyin ve DNA şablonunu çıkarmak için inkübasyona 37 santigrat derecede 15 dakika devam edin. RNA saflaştırma kitini kullanarak sgRNA'ları tekrar saflaştırın.sgRNA'yı RNaz içermeyen suda mikrolitre başına 500 nanograma seyreltin ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede üç aya kadar saklayın. Dejenerasyon olmadan yüksek kaliteli Cas9 mRNA ve sgRNA ve doğru HMEJ donör parametreleri dizisi, knock-in farelerin üretilmesindeki en kritik adımlardır. Döllenmiş embriyoları% 5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 37 santigrat derecede KSOM ortamına yerleştirin.Cas9 mRNA'nın mikrolitresi başına 100 nanogramı, mikrolitre sgRNA'sı başına 50 nanogramı ve HMEJ donör vektörünün mikrolitresi başına 100 nanogramı karıştırın ve son hacmi 10 mikrolitreye ayarlamak için su ekleyin. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin ve buzun üzerine koyun. Ardından, bir mikropipet çektirme kullanarak kılcal iğneleri çekin.Sabit akış ayarlarına sahip bir mikroenjektör kullanarak, mililitre başına 5 mikrogram Cytochalasin B içeren bir HEPES-CZB ortamı damlacığı içinde iyi tanımlanmış pronükleuslara sahip zigotların sitoplazmasına olası bir karışım hacmi enjekte edin. Son olarak, enjekte edilen zigotları, floresan gözlemi için 3 1/2 gün sonra blastosist aşamasına kadar% 5 karbondioksit altında% 37 santigrat derecede KSOM ortamında kültürleyin. 3 günlük enjeksiyonlardan sonra, HMEJ donörlerini alan blastosistlerin% 12.9'u, trofektodermde kesinlikle ifade edilen mCherry için pozitifti.PCR pozitif fareleri sıralayarak, incelenen tüm entegrasyon olayları, hem 5 asal hem de 3 asal kavşakta hassas çerçeve içi entegrasyonlardı. 7 günlük enjeksiyonlardan sonra, immünofloresan görüntüler, transfekte edilen hepatositlerin yaklaşık yarısının karaciğer bölümlerinde lekeli olarak mCherry eksprese ettiğini ortaya koydu. NTBC'nin kesilmesinden sonra, Fah HMEJ ve Cas9 yapıları alan Fah negatif farelerin Fah düzeltilmiş hepatositlerinin immünohistokimya karaciğer boyaması MMEJ tabanlı yönteme göre daha etkili proliferasyon gösterdi.HMEJ tabanlı strateji, mutasyonun bir parçası gibi mutasyona uğramış diziyi doğru olanla değiştirmek için ideal bir platform olabilir. Bu, HHEJ tabanlı bir yöntem için geçerli değildir. Bu deneyden sonra, bu terapi, araştırmacıların geniş terapi uygulamalarını keşfetmek için kesin hedef entegrasyonunun bulunduğu alana girmesinin yolunu açar.

crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, Cas9 ve sgRNA'nın hücrelere tek bir plazmit yapısı olarak sağlandığı kültürlenmiş hücrelerde hepsi bir arada CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi gösteriyoruz. CRISPR-Cas9 sistemi ve eklenmesi istenen gen, başarılı gen düzenlemesini kolaylaştırmak için elektroporasyon tekniği ile hücrelere sokuldu.

Hepsi Bir Arada CRISPR Genom Düzenleme: CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Homoloji Odaklı Onarım Tabanlı Gen Knock-In İçin Bir Yöntem

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Bu çalışma, homozigot çekirge mutantlarının CRISPR / Cas9 ribonükleaz bazlı yapımının sistematik olarak optimize edilmiş bir prosedürünün yanı sıra çekirge yumurtalarının kriyoprezervasyonu ve resüsitasyonu için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Keşfedin, CRISPR/Cas9 ve HMEJ stratejisi kullanarak canlı organizmalarda yüksek verimli hedeflenen gen entegrasyonu yöntemini. Bu teknik, gen terapisi ve genetik mutasyon düzeltme çalışmalarında umut vadeden bir araç sunar.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Daha fazla video keşfet