Name: 16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, dışkı örneklerinden 16S rRNA amplicon dizileme ile mikrobiyom karakterizasyonu yapmayı. Bu yüksek verimli protokol, aerobik ve anaerobik bakterileri tespit ederek sağlık ve hastalık araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen (No 41/11 verir)-CORE programı, İsrail Bilim Vakfı (grant No 908/15), Avrupa Crohn ve kolit organizasyon (ECCO) tarafından desteklenmiştir.

Etik onay çalışma için Sheba yerel araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı bir hastanın rızası özel durum alınan yerel etik inceleme kurulu, kullanılan fekal madde beri zaten Mikrobiyoloji çekirdek klinik testleri ve yaş dışında hasta bilgilerinizi olmayan bir parçası olarak sunuldu toplumsal cinsiyet ve mikrobiyal sonuçları. Yazılı, aydınlatılmış onam sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve kurumsal inceleme kurulu çalışma onayladı. Bu örnekleri bazıları zaten bir önceki analiz1' dahil ettik.
1. örnek işleme
<ol><li>Toplamak bir yaklaşık 5 mm2 smear (kabaca bir Silgi boyutunu) testinde steril bir bez ile taze bir dışkı örnekten tüp ( Tablo malzemelerigörmek). 24 saat içinde-80 ° C'de dışkı örnekleri içeren tüm temizleme bezi saklayın. Dışkı temizleme bezi daha fazla işleme kadar orada kalabilir.</li>
</ol>2. DNA ekstraksiyon
<ol><li>Oda sıcaklığında çıkarma ve seyreltme çözümleri çözülme ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Transferi dışkı çubukla bir boş 2 mL koleksiyonu içine tüp ( Tablo malzemelerigörmek). Pamuklu çubuk sopa boyutu kesim tarafından tüp kapatma minimum Çapraz bulaşma ile etkinleştirmek için temiz bir makas kullanarak ayarlayın. Ayıklama çözüm 250 μL dışkı çubukla ve girdap karışımı içeren her koleksiyon tüp ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri 10 min kaynar su banyosu için ısı (95-100° C). Seyreltme çözüm 250 μL her örnek ve girdap karışımı ekleyin.</li>
	<li>Ayıklanan DNA ve 4 ° C'de çubukla içeren 2 mL tüpler depolamak</li>
</ol>3. PCR ve Kütüphane hazırlık
3.1 ve 3.2 adımlar için şablon ve amplicon ücretsiz ortam temiz, sağlayan bir PCR iş istasyonu içinde çalışır.
<ol><li>Astar (Tablo 1) göre onların barkod etiket. Çift Kişilik distile su (DDW) bir 50 mikron konsantrasyon ve mağaza-20 ° C'de her astar sulandırmak</li>
	<li>96-şey plaka PCR reaksiyonları için kullanın. Her plaka 32 farklı dizin astar tarafından etiketlenir 32 farklı örnekler içerebilir. İleri astar ve 32 ters astar oda sıcaklığında erimek ve onları için 5 mikron sulandırmak.</li>
	<li>PCR reaksiyon karışımları (her iyi son hacim 20 μl olacaktır) 100 reaksiyonlar için 5 mikron ileri astar, 1 mL 2 X PCR Master mix ve 400 μL DDW 100 μL karıştırarak hazırlayın. Bu PCR karışımı 15 μL her kuyuda (96 kuyu toplam) koymak. Her 5 mikron ters dizin oluşturulmuş astar 1 μL (32 farklı Astar boyaları triplicates verir toplam 96 Wells) 3 farklı wells için ekleyin.</li>
	<li>Pre-PCR adanmış bölgesinde reaksiyon karışımları için her ayıklanan DNA örneğinin 4 μL eklemek şablonu ve amplicon ücretsiz, temiz bir Bank anlamı (ayıklanan her DNA örneği nüsha güçlendirilmiş — 32 örnek / 96-şey plaka).</li>
	<li>PCR aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: ilk denatürasyon 94 ° c 3 dakika; denatürasyon 94 ° C'de 35 döngüleri için 1 dk 1 dk ve uzantısı için 1 dk 72 ° C'de için 55 ° C'de tavlama, ardından; ve 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı.</li>
	<li>Bir post-PCR özel bölge olarak tanımlanacağını belirtiyor, farklı bir bankta bir tek birim tüp (örnek başına 60 μL) içine onaylatılacak her PCR reaksiyon birleştirin.</li>
	<li>PCR amplicons kalitesini değerlendirmek için üzerinde bir etidyum bromür lekeli % 1'özel jel her kombine-PCR reaksiyon 4 μL çalıştırın. Altında UV dalga boyu 260 nm, pozitif amplicons 375-425 bp beklenen grup boyutunda görüntülenir. Sadece bu amplicons sonraki adımda eklenecektir. Not: Her bir örneği her örnek içinde 3 farklı PCR reaksiyonları güçlendirilmiş onaylatılacak, anlamda güçlendirilmiş. Büyütmek değil.</li>
</ol>4. Kütüphane miktar ve Temizleme
<ol><li>Bir ekimolar toplama havuzu tüm PCR örnekleri almak için her amplicon bir çift iplikçikli DNA tarafından ölçmek (dsDNA ölçmek reaktif) floresan nükleik asit leke (bkz. Tablo reçetesi) geniş eşzamanlı miktar için uygun örnekleri miktarı. Not: amplicon boyutu aralığını belirsiz olduğu için nanogram gerçek tutarı ekimolar bir konsantrasyon yüklemek için kullanılır.</li>
	<li>Bir tek, steril tüp içine her örneğinin birleştirmek 500 ng. Girdap karıştırmak için.</li>
	<li>Havuza alınan Kütüphanesi 200 μL etidyum bromür lekeli % 1'özel jel üzerinde çalıştırın. Bir jel ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak jel 375-425 bp bantları ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve havuza alınan kütüphanede 80 μL DDW elute. Not: Havuza alınan Kütüphane boyutu belirsiz amplifikasyon ürünleri ana bilgisayardan DNA azaltmak için seçili olmalıdır.</li>
	<li>Son derece hassas bir dsDNA kiti üreticinin talimatlarına göre algılama kullanarak son Kütüphane konsantrasyon ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek). Üreticinin yönergelerine göre DNA kitaplıkları için son derece hassas bir ayrılık ve analiz kiti kullanarak doğru kitaplık boyutunu ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
</ol>5. sıralama
<ol><li>7 de % 20 Denetim Kitaplığı eklenmesi ile havuza alınan kitaplığına seyreltik (bkz. Tablo reçetesi) sıralama makine protokolüne göre.</li>
	<li>Sıralama için tasarlanmış kullanımı özel (bkz. Tablo 1) V4 amplifikasyon astar ücretsizdir astar okuyun.</li>
	<li>Ek bir barkoda okur kullanım üçüncü özel tasarlanmış sıralama astar (bkz. Tablo 1) döngüsü ve üreticinin belirtimlerine göre her yöne doğru uzunlukta eşleştirilmiş uç okuma 175 üslerinin oluşturur.</li>
	<li>Sıralama makine çalıştırabilir ve FASTQ dosyaları üreticinin protokolüne göre elde edilir.</li>
</ol>6. veri işleme
<ol><li>Birleştirmek ve QIIME 2 sürüm 2017.7.017uygulanan veri küratörlüğü potansiyel örtüşen eşleştirilmiş uç FASTQ dosyalarında işlem. Örnek belirli barkodlar göre okuma demultiplex.</li>
	<li>DADA218 kalite kontrol ve sıra varyant (SVs) algılaması için kullanabilir. Okuma 3' sonundan itibaren 13 üsleri ve 15 üsleri 5' uç, üzerinden atma ile 2'den fazla beklenen hataları okur kesecek. Belirlemek ve uzlaşma yöntemiyle chimeras kaldırmak — chimeras örnekleri ayrı ayrı algılanır ve örnekleri yeterli bir kısmını chimeric bulundu dizileri kaldırılır.</li>
	<li>SVs taksonomik sınıflandırma bir Naive Bayes donatılmış Sınıflandırıcısı kullanarak gerçekleştirmek, Ağustos 2013 eğitim % 99 kimliği Greengenes veritabanı6, 175 için uzun ayarla ileri/geri astar ve okur.</li>
	<li>2.146 dizileri derinliği için tüm örneklerini rarefy.</li>
	<li>Unweighted UniFrac β-çeşitlilik seyreltilmiş örnekleri (örnek çeşitlilik19,20) arası ölçüm için bir örnek boyutu etkisi önlemek için kullanın.</li>
	<li>Bir asıl koordinatları (PCoA) çözümlemesi için elde edilen mesafe matris kullanın. Not: Veri işleme komut dosyası ve eşleme dosyaları ek malzeme (ek malzeme 1 ve 2) sağlanır.</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

16s rRNA-amplicon ve metagenomics av tüfeği sıralamanın Klinik Mikrobiyoloji uygulamaları21,22,23popülerlik kazanmıştır. Bu teknikler artan yeteneklerini patojen inoculum ve yeteneklerini daha doğrusu bir polymicrobial bulaşıcı belirlemek için göreli bolluk hakkında veri sağlayan culturable ve culturable takson yakalamak için avantajlı olan 24parmak izi. Microbiome araştırma alanında gelişmeler çeşitli yaklaşımlar tutarlılık eksikliği nede...

Yoğun çabaları microbiome çeşitlilik ve bolluk, fark ve sağlıklı ve patolojik koşullarda bireyler arasındaki benzerlikler yakalamak bir diğer yönü olarak daha iyi anlamak için yapılmıştır. Yaş2,3, coğrafi konum4, yaşam tarzı5,6ve hastalık5 gut microbiome kompozisyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, ancak birçok koşul ve nüfus henüz tam olarak henüz karakterize. Son zamanlarda microbiome için tedavi uygulamaları7,8,9değiştirilebilir bildirilmiştir. Bu nedenle, çeşitli fizyolojik şartlarda ve mikrobiyal kompozisyon ilişkisi içine ek fikir potansiyel gelecek değişiklikler duruma getirilmesi doğru ilk adımdır.
Geleneksel mikrobiyal kültür yöntemleri düşük verimleri10,11tarafından sınırlı olduğunu ve ikili bir devlet ya da nerede bir bakteri kavramsallaştırma gut ya da mevcut. Yüksek işlem hacmi DNA tabanlı sıralama mikrobiyal ekoloji, mikrobiyal toplumun tüm üyelerinin yakalama etkinleştirme devrim yarattı. Ancak, sıra uzunluğu ve kalite önemli engelleri doğru taksonomi atama12kalır okuyun. Ayrıca, yüksek üretilen iş tabanlı deneyler nerede ölçümleri biyolojik olmayan veya bilimsel olmayan değişkenler13tarafından etkilenen toplu etkileri muzdarip olabilir. Son yıllarda, çeşitli programlar insan microbiome Amerikan Gut proje, Amerika Birleşik Devletleri (ABD) insan Microbiome projesi ve Birleşik Krallık (UK) MetaHIT projesi de dahil olmak üzere, eğitim için kurulmuştur. Bu girişimler tutarlılık onların yaklaşımlar eksikliği nedeniyle kolayca karşılaştırılabilir değildir verileri oluşturmuş. Bazı bu sorunları14 yönelik olarak uluslararası insan Microbiome Konsorsiyumu, uluslararası insan Microbiome Standartları Projesi ve National Institute of Standards ve Technology (NIST) gibi uluslararası projeler çeşitli çalıştı ve geliştirilen güvenilir üreme sonuçlar ulaşılmasına izin vermesi gerekir microbiome ölçümleri için standartları. Burada açıklanan 16S rRNA yüksek üretilen iş (16S-seq) sıralama veri analizleri aracılığıyla dışkı örneği koleksiyonundan başlatmak için birkaç genel olarak kullanılan yöntemlerin15,16 entegre bir protokoldür. Bitki DNA16doğrudan çıkarma için tasarlanan bir sütun ücretsiz PCR yaklaşım, protokolünü açıklar, dışkı çok sayıda eşzamanlı işlemeyi etkinleştirmek IÇIN örnekleri nispeten kısa sürede yüksek kalitede DNA hedef için güçlendirilmiş mikrobiyal değişken V4 bölgenin ortak bir sıralama platformu üzerinde sıralanıyor. Bu iletişim kuralı bilim adamları sağlam, üreme, kullanımı kolay, detaylı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor baktılar önemli denetimlerini kullanma kılavuzu amaçlamaktadır. Bir rehber eşliğinde ve detaylı adım-tarafından adım protokolü olan toplu etkisini en aza indirmek ve böylece daha karşılaştırılabilir sıralama sonuçları labs arasında izin verir.

<table><tbody><tr><td>Primerler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstraksiyon çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Seyreltme çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kiti</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Master karışımı</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reaktif kiti</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA reaktifi ölçmek</td></tr><tr><td>MinElute Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Su Dnase ve Rnase İçermeyen</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS test kiti</td><td>Moleküler problar</td><td>Q32854</td><td>dsDNA tespit kiti</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>Ekran Bandı 5067-5582</td><td>ayırma ve analiz</td></tr><tr><td>Ekran Bandı Testi</td><td>DNA kitaplıkları için</td><td>Agilent Technologies</td><td>Reaktifleri 5067-5583</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>kontrol kitaplığı</td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2 (500 döngü)</td> <td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL toplama tüpler</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Güvenli Mühür toplama tüpleri</td></tr><tr><td>PP test tüpünde plastik çubuk çubuk</td><td>STERİL İÇ</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Makinesi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>2720 Termal Döngüleyici</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Makinesi</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR iş istasyonu</td><td>Biosan</td><td>UV temizleyici</td><td></td></tr><tr><td>makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>girdap</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrna amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

İnsan bağırsak microbiome hücreleri yaralanmalara karşı korumak, enerji ve besin işleme ve dokunulmazlık teşvik merkezi bir rol oynar. Sağlıklı microbiota kompozisyon (dysbiosis) olarak kabul edilir ne gelen sapmalar hayati fonksiyonları için patolojik koşulları önde gelen bozabilen. Son ve devam eden araştırma çabalarının mikrobiyal kompozisyon ve insan sağlığı ve hastalık arasındaki ilişkilendirmeleri karakterizasyonu doğru yönetmen var.
Yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri gelişmeler bağırsak mikrobiyal kompozisyon karakterizasyonu etkinleştirin. Bu yöntemler 16S rRNA amplicon sıralama ve av tüfeği sıralamanın içerir. 16s rRNA amplicon sıralama av tüfeği sıralama gen Öngörüler ve fonksiyonel ek açıklama hakkında ek bilgi sağlarken taxonomical kompozisyon, profil için kullanılır. 16S rRNA gen değişken bölge hedefli sıralama yöntemini kullanarak bir av tüfeği sıralama için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük maliyet avantajdır. 16S rRNA gen farklılıkları sıra mikrobiyal parmak izi kadar tanımlamak ve farklı özellikleri tek tek bir örnek içinde ölçmek için kullanılır.
Büyük uluslararası çabalara 16S rRNA amplicon sıralama için standartlar kayıtlı. Ancak, çeşitli çalışmalarda ortak bir kaynaktan toplu etkisiyle neden varyasyon bildirin. Bu etki, üniformalı protokolleri için örnek koleksiyonu, en aza indirmek için işleme ve sıralamanın uygulanması gerekir. Bu iletişim kuralı veri analizleri için dışkı örneği koleksiyonundan başlayan genel olarak kullanılan protokolleri entegrasyonu öneriyor. Bu iletişim kuralını eşzamanlı kullanım ve DNA ekstraksiyon dışkı örnekleri, PCR güçlendirme V4 bölgesinin yanı sıra çok sayıda sağlar sütun-Alerjik, doğrudan-PCR yaklaşım içerir. Ayrıca, protokol analiz boru hattı açıklar ve QIIME (QIIME 2 yorum 2017.7.0 ve DADA2) en son sürümünü kullanarak bir komut dosyası sağlar. Adım adım bu protokolü ilgilenenler sağlam, üreme, kullanımı kolay ve ayrıntılı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor rehberlik etmek hedefleniyor.

Şematik Protokolü'nün şekil 1' de gösterilen.
Biz prospektif şüpheli bulaşıcı ishal ile yatan hastalardan dışkı örneği toplanmıştır. Yukarıda açıklanan1olduğu gibi bu örnekleri Sheba Tıp Merkezi Şubat ve Mayıs 2015 yılları arasında Klinik Mikrobiyoloji Lab sunuldu. Dışkı örneği Klinik Mikrobiyoloji laboratuarında gerçekleştirilen geleneksel Mikrobiyolojik kültür ve geniş yüks...

Bu el yazması yüksek üretilen iş 16S rRNA amplicon sıralama, detaylı bir standart protokolünü açıklar. Protokol dışkı örneği koleksiyonu veri analizleri ile başlayarak bir entegre, üniformalı, uygun ve ucuz protokol tanıttı. Bu protokol analiz örnekleri titiz standartları ile çok sayıda ve çeşitli denetimler sağlar.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Bu yüksek verimli 16S rRNA-Amplikon Dizilemesinin genel amacı, dışkı örneklerinden başlayarak küresel mikrobiyom bileşimini karakterize etmektir. Bu yöntem, metabolizma, sindirim ve bağırsak ve sistemik inflamasyon gibi birçok ilgi alanıyla ilişkili küresel mikrobiyal bileşim hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kültürlenmesi zor olan bakteriler de dahil olmak üzere dışkı örneğinde bulunan aerobik ve anaerobik mikrobiyal toplulukların bir sayımını sağlamasıdır.Bu yöntem, hızlı kolonsuz işleme pompa hattı sayesinde aynı anda çok sayıda dışkı örneğini işleyebilir ve sağlam ve tekrarlanabilir 16S rRNA-Amplikon Dizilimi ile sonuçlanmıştır. Bu protokol için, kabaca bir kalem silgisi büyüklüğünde donmuş dışkı örneklerine sahip olun. Numuneler, toplama çubuğunun kesilmiş ucu ile iki mililitrelik tüplerde saklanmalıdır.Dışkı içermeyen swablardan ve dahili kopya kontrollerinden oluşan negatif kontrolleri dahil edin ve dahili kontrol olarak hizmet etmek için numune orijinal dışkısından numune kopyalarına sahip olun. Ekstraksiyon ve seyreltme çözeltilerinin dışkı numuneleri ve kontrol numuneleri ile birlikte oda sıcaklığında çözülmesiyle baş

guided-protocol-for-fecal-microbial-characterization-16s-rrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, kolon tümörü taşıyan farelerin dışkı örneklerinden alınan DNA izolasyon protokolü açıklanmaktadır. Ekstrakte edilen DNA, PCR kullanılarak amplifiye edilir ve ürün, manyetik boncuk bazlı bir yaklaşım kullanılarak daha da temizlenir. Bu yöntem, çevresel zenginleştirmenin kolon mikrobiyotası ve hayvan ölümleri üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Dışkı Mikrobiyal DNA İzolasyonu: Murin Tümör Modelinde Çevresel Zenginleştirmenin Mikrobiyom Çeşitliliği Üzerine Etkisinin İncelenmesi

Mikrobiyal topluluğu karakterize etmek, çevresel mikrobiyolojide uzun süredir devam eden bir hedef olmuştur. Yeni nesil dizileme yöntemleri artık mikrobiyal toplulukların minimum maliyet ve iş gücü ile benzeri görülmemiş bir derinlikte karakterizasyonuna izin veriyor. Burada, bir tezgah üstü dizileyici kullanarak bakteriyel 16S ribozomal RNA genlerini dizileme yaklaşımımızı detaylandırıyoruz.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

Biz 16S rRNA gen sıralama amplikon kullanarak bakteri topluluklarının karakterizasyonu için sürüntü nükleik asidin çıkarmak için etkili, sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem birden fazla örnek türleri için ortak bir işleme yaklaşımı sağlar ve alt analitik süreçlerin bir dizi barındırmaktadır.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

Burada, fizyolojik şartlarda mide bağırsak, taklit Biyoreaktörler bir dizi kullanarak gut microbiota kolon tüp bebek, kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

Bu protokol, insan dışkı Mikrobiyota bir in vitro toplu kültür fermantasyon sistemi açıklar, inulin kullanarak (iyi bilinen bir prebiyotik ve en yaygın olarak okudu Mikrobiyota Modulators) belirli etkileri tahmin bu sistemin kullanımını göstermek için dışkı mikrobiota kompozisyon ve metabolik faaliyetler üzerinde müdahaleler.

Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Hidrokarbon bozunan bakterileri sucul habitatlardan izole etme, çoğaltma ve karakterize etme sürecini sunuyoruz. Protokol, bakteri izolasyonunu, 16S rRNA yöntemiyle tanımlamayı ve hidrokarbon bozunma potansiyellerinin test edilmesini ana hatlarıyla belirtir. Bu makale, araştırmacıların çevresel örneklerde mikrobiyal biyoçeşitliliği karakterize etmelerine ve özellikle biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları taramalarına yardımcı olacaktır.

Sucul Habitatlardan Hidrokarbon Metabolize Edici Özelliğe Sahip Bakteri Türlerinin İzolasyonu, Çoğaltılması ve Tanımlanması

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Öğrenin, dışkı örneklerinden 16S rRNA amplicon dizileme ile mikrobiyom karakterizasyonu yapmayı. Bu yüksek verimli protokol, aerobik ve anaerobik bakterileri tespit ederek sağlık ve hastalık araştırmalarına katkı sağlar.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet