16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

Bu yüksek verimli 16S rRNA-Amplikon Dizilemesinin genel amacı, dışkı örneklerinden başlayarak küresel mikrobiyom bileşimini karakterize etmektir. Bu yöntem, metabolizma, sindirim ve bağırsak ve sistemik inflamasyon gibi birçok ilgi alanıyla ilişkili küresel mikrobiyal bileşim hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kültürlenmesi zor olan bakteriler de dahil olmak üzere dışkı örneğinde bulunan aerobik ve anaerobik mikrobiyal toplulukların bir sayımını sağlamasıdır.

Bu yöntem, hızlı kolonsuz işleme pompa hattı sayesinde aynı anda çok sayıda dışkı örneğini işleyebilir ve sağlam ve tekrarlanabilir 16S rRNA-Amplikon Dizilimi ile sonuçlanmıştır. Bu protokol için, kabaca bir kalem silgisi büyüklüğünde donmuş dışkı örneklerine sahip olun. Numuneler, toplama çubuğunun kesilmiş ucu ile iki mililitrelik tüplerde saklanmalıdır.

Dışkı içermeyen swablardan ve dahili kopya kontrollerinden oluşan negatif kontrolleri dahil edin ve dahili kontrol olarak hizmet etmek için numune orijinal dışkısından numune kopyalarına sahip olun. Ekstraksiyon ve seyreltme çözeltilerinin dışkı numuneleri ve kontrol numuneleri ile birlikte oda sıcaklığında çözülmesiyle başlayın. Çözüldükten sonra, her bir numune tüpüne 250 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve dışkıyı bir girdap kullanarak çözelti halinde karıştırın.

Bu noktada yalnızca arabellek negatif kontrollere giriş yapın. Daha sonra, numuneleri kaynar su banyosunda 10 dakika ısıtın. Kaynar suda inkübasyondan sonra, her numuneye 250 mikrolitre seyreltme çözeltisi ekleyin ve numuneleri karıştırmak için girdaplayın.

Ardından, PCR gerçekleştirilene kadar numune tüplerini dört santigrat derecede saklayın. PCR'leri, şablonlar ve Amplikonlar gibi potansiyel DNA kirleticilerinden arındırılmış bir ön PCR iş istasyonunda kurun. Primerleri barkodlarına göre etiketleyin ve çift damıtılmış suda 50 mikromolar konsantrasyona kadar seyreltin.

Seyreltilmiş astar stoklarını eksi 20 santigrat derecede saklayın ve kullanmadan önce tamamen çözün. Her numune için, üç nüsha halinde 32 reaksiyon için 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. Oda sıcaklığına ısındıktan sonra, PCR için ön astarın ve 32 ters astarın alikotlarını beş mikromolar ile seyreltin.

Daha sonra 100 reaksiyon için yeterli baz PCR karışımı hazırlayın. 100 mikrolitre beş mikromolar ileri astarı bir mililitre 2X PCR ana karışımı ve 400 mikrolitre çift damıtılmış su ile birleştirin. Bu karışımı vorteksleyin ve daha sonra bu karışımdan 15 mikrolitreyi 96 kuyucuğun her birine yükleyin.

Daha sonra, her biri bir mikrolitre beş mikromolar ters astar ile üç kuyucuklu setleri yükleyin. Böylece 32 farklı ters indeksin tamamını plakaya yükleyin. Daha sonra her bir plakaya, ekstrakte edilmiş DNA örneğinden dört mikrolitre ekleyin.

Bu temiz bir tezgahta yapılır. Şimdi PCR'yi üç dakikalık bir ilk denatürasyon ile çalıştırın, ardından bir dakikalık denatürasyon ve 55 santigrat derecede diz çökme ve bir dakikalık uzatma ile 35 döngü izleyin. 10 dakikalık bir son uzatma ile bitirin.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR sonrası özel bir tezgahta çalışın. Orada, her bir üçlü PCR ürünü setini numune başına 60 mikrolitre için tek bir tüpte birleştirin. Daha sonra her numuneden dört mikrolitre ekidyum bromür lekeli %1 agaroz jel üzerinde çalıştırın.

Pozitif Amplikonlar 375 ile 425 baz çifti arasında görünecektir. Negatif kontroller gösterilir ve çalışma pozitif Amplikonları ile birlikte işlenir. Pozitif reaksiyon ürünlerinin DNA konsantrasyonlarını üretici talimatlarına göre ölçün.

Daha sonra ürünlerin her birinden 500 nanogram DNA'yı tek bir tüpte birleştirin. Bu karışımı girdaplayın ve daha önce olduğu gibi% 1'lik bir jel üzerinde 200 mikrolitre boşaltın. Şimdi 375 ila 425 baz çifti arasındaki bantları jelden çıkarın.

Ardından, kitaplığı sıralama için hazırlayın. Üretici talimatlarına göre son derece hassas bir çift sarmallı DNA tespit kiti kullanarak konsantrasyonu ölçün ve ardından son derece hassas bir ayırma ve analiz kiti kullanın. Daha sonra kütüphaneyi yedi picomolar'a seyreltin ve bir kontrol kütüphanesi ile dörde bir birleştirin.

Artık numune dizileme için hazır olduğuna göre, onu dizileme makinesine aktarın. Dışkı örneklerinden bir kütüphane hazırlığı için tarif edilen yöntem, enfeksiyöz ishal şüphesi olan hastanede yatan hastaların mikrobiyomunu analiz etmek için kullanıldı. Buna paralel olarak, dışkı örnekleri de bir mikrobiyoloji laboratuvarında geleneksel kültüre tabi tutuldu.

Sağlıklı yetişkinlerden alınan dışkı örnekleri karşılaştırma için sıralandı. Birkaç negatif kontrol numunesi dahil edildi, şablonsuz PCR, ekstraksiyon ve seyreltme solüsyonunda temiz ve steril sürüntülerde PCR ve karışık ekstraksiyon ve seyreltme solüsyonlarında PCR. Bunların her biri, esas olarak Mikoplazma taksonları olan toplam 118'den az okumaya sahipti.

Standart numunelerin ortalaması 10.000'den fazla olup, kalite kontrolünden sonra Mycoplasma tanımlaması yapılmamıştır. Örneklerin tutarlılığı ve değişkenliği, iki farklı barkodlu primer ile hazırlanan 16 dışkı örneği kullanılarak ölçüldü ve böylece her örnekten iki farklı kütüphane oluşturuldu. Örneklerin yarısı geleneksel kültür tekniğinde Campylobacter salmonella veya Shigella için pozitifti.

16S sıralama sonuçlarını kullanarak, filo düzeyindeki bir alan çizimi, geleneksel kültür sonuçlarından bağımsız olarak aynı örneklerden yapılan kütüphaneler arasındaki tutarlılığı gösterir. 16 eşleştirilmiş numuneden oluşan bu havuzdan, temel koordinat analizi, numune çiftlerinin yakından hizalandığını ve pozitif kültür numunelerinin negatif kültür numunelerinden önemli ölçüde farklı bir PC1 değerine sahip olduğunu ortaya koydu. Örneklerin daha fazla analizi, yüksek seviyelerde Proteobakteri'nin yalnızca hastanede yatan hastalarda bulunduğunu ortaya koydu.

Bu videoyu izledikten sonra, mikrobiyal değişken V4 bölgesinin barkodlu dizileme kitaplıklarını oluşturmak için kolonsuz DNA ekstraksiyonu ve PCR kullanarak çok sayıda dışkı örneğinin aynı anda nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, özellikle kütüphaneleri hazırlarken düzenli ve temiz bir ortamda çalışmayı unutmamak önemlidir. İnsan dışkı örnekleriyle çalışmanın tehlikeli olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın.