Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Bu prosedürün genel amacı, Kantitatif Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon PCR kullanarak Plazma MikroRNA'larının mutlak seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, ekspresyon seviyeleri düşük olsa bile plazma mikroRNA'larının miktarının değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ölçülen verilerin farklı çalışmalardan veya laboratuvarlardan elde edilen diğer verilerle karşılaştırılabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, diğer türlerden alınan örneklere kadar uzanır, çünkü sentetik RNA veya nükleotid kullanılarak standart bir eğri oluşturulabilir. Bu yöntem, umut verici güvenlik biyobelirteçlerini araştırmak için translasyonel araştırmalara ışık tutabilir. İlk olarak, Sinomolgus Maymunlarının femoral damarından elde edilen donmuş plazma örneklerini buz üzerinde çözdürün.

RNA ekstraksiyonundan önce soğutmak için Kloroformdaki Lizis reaktifini buz üzerine aktarın. Daha sonra, numunenin 200 mikrolitresine 1.000 mikrolitre Lysis reaktifi ekleyin. Ve uygun karışımı sağlamak için bir dakika boyunca girdap.

Daha sonra numuneye beş mikrolitre beş nanomolar sentetik Caenorhabditis elegans mikroRNA ve 200 mikrolitre kloroform ekleyin. Düzgün bir şekilde karıştırmak için numuneyi bir dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, numuneyi iki ila üç dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, numuneyi 12.000 G'de, dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, sulu fazın 650 mikrolitresini dikkatlice yeni bir mikrotüpe aktarın. Ardından, sulu faza 975 mikrolitre Etanol ekleyin ve tam karışımı sağlamak için birkaç kez pipetleyin.

Numuneyi ilgili kolona ve adaptöre aktarın ve ardından vakum manifoldları kullanarak üç dakika vakumla kurutun. Daha sonra kolona 200 mikrolitre etanol ekleyin ve bir dakika vakumla kurutun. Vakumlu kurutmadan sonra, kolona 800 mikrolitre RWT Tamponu ekleyin ve tekrar iki dakika vakumla kurutun.

Daha sonra kolona 800 mikrolitre RPE Tamponu ekleyin ve iki dakika vakumla kurutun. RPE Tamponunu iki kez ekleyin, ardından vakumlu kurutmayı yapın. Ardından, sütuna 300 mikrolitre Etanol ekleyin.

Etanol ekledikten sonra bir dakika vakumla kurutun. Daha sonra, kolonu yeni bir mikrotüpe aktarın ve aynı şekilde oda sıcaklığında 12.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sütunu yeni bir mikrotüpe aktarın ve üzerine 50 mikrolitre Nukel içermeyen su ekleyin.

Kolonu oda sıcaklığında üç dakika bekletin ve ardından oda sıcaklığında 8.000 G'de bir dakika santrifüjleyin. Son olarak, elüatı kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hedef mikroRNA'ya karşılık gelen sentetik bir RNA Oligonükleotid Konsantrasyonu hazırlamak için, standart eğrileri çizmek için en yüksek konsantrasyona sahip bir çalışma çözeltisi elde etmek için stok çözeltisini 10 kat seyreltin.

Daha sonra, ters transkripsiyon primerlerinden oluşan bir multipleks havuzu oluşturmak için, hedef mikroRNA'lar için eşit hacimlerde 20 mukavemetli primerleri karıştırın. Ardından, ters transkripsiyon reaksiyon karışımını hazırlayın. Daha sonra beş mikrolitre RNA örneğine 10 mikrolitre ters transkripsiyon reaksiyonu karışımı ekleyin.

İkisini birkaç kez pipetleyerek karıştırın. Ardından, karışımı buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Numuneyi Thermocycler'a yerleştirdikten sonra döngüyü başlatın.

Program bittiğinde, ters kopyalanmış numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın. Multipleks tahlil primer havuzunu oluşturmak için, 1.000 mikrolitrelik son hacimde Tris-EDTA tamponu içeren tüpe hedef mikroRNA'lara karşılık gelen eşit hacimlerde beş mikrolitre tahlil primeri ekleyin. Ardından, ön amplifikasyon reaksiyon karışımını oluşturun.

Reaksiyon karışımı tamamlandıktan sonra, 22.5 mikrolitre ön amplifikasyon reaksiyon karışımını iki nokta beş mikrolitre ters kopyalanmış numuneye aktarın. Ardından, numuneyi ve ön amplifikasyon ana karışımını iyice karıştırmak için pipetleyin ve beş dakika buz üzerinde inkübe edin ve ardından PCR tüplerini Termodöngüleyicide bırakın ve çalışmaya başlayın. Program bittiğinde, tüm numuneleri eksi 80 santigrat derecede aktarın.

Önceden büyütülmüş veya önceden büyütülmemiş numuneler çözüldükten sonra, steril su ile beş kat seyreltin. Standart eğriyi oluşturmak için, sentetik RNA oligonükleotidlerinden türetilen numunelerin 10 kat seri seyreltmesini yapın. Daha sonra, buz üzerinde tutulan bir tüpte kantitatif PCR reaksiyon karışımını oluşturun.

Daha sonra kantitatif PCR reaksiyon karışımından 18 mikrolitre Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakalarına ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş numunelerden iki mikrolitre kuyucuklara ekleyin. Plakayı yapışkan film ile kapattıktan sonra, numuneyi 500 G'de 15 saniye boyunca kısa bir süre santrifüjleyin.

Ardından gerçek zamanlı Thermocycler programını başlatın. Her numunenin ham kopya numarasını hesaplamak için ilgili gerçek zamanlı termal döngüleyici ile çalışan bir SDS yazılımı Sürüm 2.4 kullanın. Ardından, Excel yazılımını kullanarak ham kopya numarasından mutlak kopya numarasını hesaplayın.

miR-122, miR-192 ve miR-133a'nın amplifikasyon verimliliği, önceden amplifiye edilmemiş numuneler için log konsantrasyonu ile miktar belirleme döngüsü arasındaki ilişkiyi açıklayan standart eğriler çizilerek analiz edildi. miR-122, miR-192 ve miR-133a için standart eğriler, miktar tayini döngüleri ile numunelerin log konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki gösterir. Daha sonra, miR-1, miR-499a ve miR-206'nın amplifikasyon verimliliği, önceden amplifiye edilmiş numuneler için standart eğriler çizilerek analiz edildi.

Amplifikasyon verimliliğini analiz etmek için eğim, doğrusal regresyon kullanılarak hesaplandı. Standart eğri A'daki eğim, miR-499a ve miR-206 için mikrolitre konsantrasyonu başına 1.000 kopyada spesifik amplikonların yokluğunu gösterir. Bununla birlikte, spesifik olmayan amplikonlar, miR-1 için mikrolitre başına 1.000 kopya olarak elde edildi.

Burada, amplifikasyon grafiklerini türetmek için önceden amplifiye edilmemiş ve önceden amplifiye edilmiş miR-206 numuneleri çift olarak kullanılmıştır. Önceden büyütülmemiş ve önceden büyütülmüş miR-206 için niceleme döngüsü değerlerinin sırasıyla 39.9, artı veya eksi bir nokta dokuz ve 27.0, artı veya eksi iki nokta iki olduğu tahmin edildi ve çizimlerde gösterildiği gibi kopyalar arasında neredeyse benzer değerleri temsil etti. Daha sonra, Sinomolgus maymunlarından elde edilen plazma mikroRNA'ları, mutlak değerlerini hesaplamak için profillemeye tabi tutuldu.

Ekspresyon seviyelerini temsil eden mikroRNA profillemesinden elde edilen nokta grafikleri, miR-122, miR-133a ve miR-192'nin ön amplifikasyon olmadan tespit edilebilir olduğunu göstermektedir. Oysa miR-1, miR-206 ve miR-499a, düşük ekspresyon seviyeleri nedeniyle ön amplifikasyon gerektirecektir. Bu videoyu izledikten sonra, RT-qPCR kullanarak plazma mikroRNA'nın mutlak seviyelerini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Ve ön amplifikasyon; küçük miktarlarda mikroRNA ile algılamayı iyileştirmek için yararlıdır.