Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Bu batı lekeleme protokolünün aşırı amacı, az sayıda hücre üzerinde batı lekeleri gerçekleştirmektir. Bu yöntem, hematopoetik kök hücre alanındaki spesifik proteinlerin varlığı veya bolluğu veya sinyal yollarının aktivasyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 20.000'den az hücre gerektirmesidir, bu nedenle nadir birincil hücre popülasyonlarını analiz etmek için daha az hayvana ihtiyaç duyulur.

Bu yöntem için ilk olarak, hematopoetik kök hücre analizleri için kullanmamız gereken fare sayısını azaltmanın yollarını bulmaya çalışırken aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Xiongwei Cai olacak. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 500 katı derecede sıralanmış hematopoietik kök ve progenitör hücreleri içeren 1,5 mililitrelik tüpleri santrifüjlemek için sallanan bir kova rotoru kullanın.

Santrifüjleme bittiğinde, hücre peletini bozmadan 100 mikrolitre süpernatan hariç hepsini atın. 5.000'den az hücre varsa ve sıralanan numunenin hacmi 0.2 mililitreden azsa, santrifüjlemeden önce hücreleri düşük bağlayıcı 0.2 mililitre PCR tüplerine aktarın. Bununla birlikte, 5.000'den az hücre varsa, ancak sıralanan numunenin hacmi 0.2 mililitreden fazlaysa, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 500 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, 200 mikrolitre süpernatan hariç hepsini atın. Ardından peleti ve kalan 200 mikrolitre süpernatanı tekrar askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 0.2 mililitrelik PCR tüplerine ve tekrar santrifüje aktarın.

Daha sonra peleti 20 ila 30 mikrolitre süpernatan içinde yeniden süspanse edin ve geri kalanını atın. Gerekirse, yeniden süspanse edilmiş hücrelere% 2 fetal sığır serumu veya% 2 sığır serum albümini içinde fosfat tamponlu salin ekleyin. Ardından, iki ila beş mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre kullanarak hücresel konsantrasyonu belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Daha sonra, 500, 1.000 ve 2.000 hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin hacmini yeni 1.5 mililitrelik tüplere aktarmak için 20 veya 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Hücreleri beş dakika boyunca yerçekiminin 500 katı ile dört santigrat derecede santrifüjlemek için sallanan bir kova rotoru kullanın. Ardından, 100 katlı bir stok çözeltisi hazırlamak için fosfataz ve proteazom inhibitörünü ve DMSO'yu çözmek için üreticinin talimatlarını izleyin.

Daha sonra, iki katlı bir Laemmli numune tamponu yapmak için dört katlı Laemmli numune tamponunu eşdeğer hacimlerde damıtılmış su ile seyreltin. Daha sonra, nihai konsantrasyonu iki kat inhibitöre ve iki kat Laemmli numune tamponuna ayarlamak için uygun miktarlarda 100 kat fosfataz ve proteazom inhibitörü stok çözeltisi ekleyin. Tüpteki artık süpernatantın hacmini, fosfataz ve proteazom inhibitörü ile birlikte eşit hacimlerde iki katlı Laemmli tamponu eklenerek, mikrolitre başına 500 hücrelik bir nihai konsantrasyon ve bir kat Laemmli tamponu elde edilecek şekilde ayarlayın.

Ve sonra lizatı oluşturmak için yeniden askıya alın. Jeli yüklemeden önce, numune lizatlarını bir ısı bloğunda 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Standart protokoller kullanılarak, 100 voltta SDS sayfası boyunca 500 ila 20.000 hücreye eşdeğer bir ila 40 mikrolitre lizat elektroforezi

Poli viniliden membranı metanol ile saniyeler boyunca işlemden geçirdikten sonra, membranı kısa bir süre damıtılmış su ile yıkayın. Daha sonra proteini, transfer aparatının üreticisi tarafından sağlanan talimatlara göre jelden zara aktarın. Transferden sonra, zarı iki mililitre% 2 sığır serum albümini ve standart protokollere göre gece boyunca dört santigrat derecede % 0.1 Tween ile fosfat tamponlu salin ile bloke edin.

Membranı bloke ettikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede seyreltilmiş antikorlarla inkübe edin. Daha sonra zarı, oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca% 0.1 Tween 20 ile fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın. Daha sonra, zarı oda sıcaklığında bir dakika boyunca iki mililitre gelişmiş kemilüminesans tamponu ile inkübe edin.

Bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri tespit edin. Beta aktin sinyallerini karşılaştırmak için lizatlar idrar, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerden hazırlandı ve western plot analizine tabi tutuldu. 2.000 ila 500 hematopoietik progenitörden hazırlanan lizatlardan ve 1.5 milimetrelik kuyucuklara yüklenen kök hücrelerden %12'lik bir SDS sayfa jeli üzerinde beta aktin sinyalinde bir azalma olduğu amino lekesinden anlaşılmaktadır.

Ayrıca, jel üzerine dökülen farklı kuyu boyutlarından elde edilen beta aktin sinyallerini karşılaştırmak. Lizatlar jel üzerine 1.5 ve üç milimetrelik kuyucuklara yüklendi ve daha sonra western blot analizine tabi tutuldu. Leke, 1.5 milimetrelik bir kuyuya yüklenen 500 hematopoietik progenitörden hazırlanan lizattan elde edilen beta aktin sinyalinin, üç milimetrelik bir kuyuya yüklendiğinden çok daha güçlü olduğunu göstermektedir.

Daha sonra, sitokin kök hücre faktörü stimülasyonuna yanıt olarak ökaryotik başlatma faktörü 4G, aktin ve ribozomal protein S6'nın fosforilasyonu sinyallerini karşılaştırmak için elde edilen lizatlar amino blot ile analiz edildi. Leke, sitokin kök hücre faktörü stimülasyonu ile hematopoietik regenitörlerde her üç protein için daha güçlü sinyal yoğunluklarının varlığını gösterir. İn vitro kontrol ile karşılaştırıldığında, farklı hematopoietik kök hücre hacimlerinden her üç protein için de artan sinyal yoğunluğu olduğu ve arttığı da açıktır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik olarak 48 saat içinde yapılabilir. Düzgün bir şekilde yaklaşılırsa. Bu prosedürü denerken, hücreleri doğru bir şekilde saymayı ve lizat hücrelerini bir yükleme tamponu ile yönlendirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu gelişmeden sonra, kök hücre araştırmaları alanındaki araştırmacıların az sayıda hücredeki sinyal yolaklarını keşfetmeleri için teknik olarak peletlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, az sayıda adres parçasıyla batı çiziminin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. SDS sayfası için kullandığınız bölgelere dikkat edin.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.