Name: Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin, hematopoetik kök hücrelerde 500 hücreyle Western blot yapmayı. Bu yöntem, nadir hücre popülasyonlarında protein analizi ve sinyal yolaklarını incelemek için hayvan kullanımını azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 CA149976 (N.A.S) Bu eser desteklenen verin.

Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanım ve bakım kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Yordamı fare hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSCs ve HPs) analizi için geliştirilmiş, ancak diğer hücre popülasyonlarının analiz için adapte edilebilir.
1. akış sitometresi yalıtım HPs ve fare HSCs
<ol><li>Fare kemik iliği hücreleri edebiyat6' açıklandığı gibi hasat. Not: Resim 1 ve Şekil 2sunulan verilerde, kemik iliği C57BL/6J fareler hasat.</li>
	<li>Soy tükenmesi kemik iliği hücrelerinin üreticinin yönergelerini izleyerek bir fare soy tükenmesi kit kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücre yüzey işaretleyicileri ilgi karşı antikor içeren hücreler açıklanan7kuluçkaya. Resim 1 resim 2görüldüğü deneylerde antikorlar Sca-1, Kit, Flt3 ve lineage (LIN) işaretleri Mac1, Gr1, CD3e, B220 ve Ter119 için kullanılır.</li>
	<li>2.000-20.000 Lin- Sca1 sıralama+Seti+ Flt3- hücreleri (HSCs) veya Lin-Sca1-Seti+ hücrelere 1,5 mL Eppendorf tüpleri 0.1 mL fosfat içeren (HPs) arabelleğe alınmış serum %2 fetal sığır (PBS) Serum (FBS). Not: Resim 1 ve Şekil 2gösterilen veri için akış sitometresi ile 70 µM başlığı kullanarak hücreleri sıralanmış. 1.4 mL en fazla toplama birimdir.</li>
</ol>2. numune hazırlama
Not: Bu adım önemlidir. Örnek çok dikkatli bir şekilde işlemek. Süpernatant kaldırırken, hücre Pelet değil rahatsız etmek için dikkatli olun.
<ol><li>Santrifüj 1.5 mL tüpler, sallanan bir kova rotor 4 ° C'de sıralanmış hücreleri içeren hücreden süpernatant ile yaklaşık 100 µL hariç hepsi 5 dk. Kaldır 500 x g cips çok nazikçe bir pipet ve 20 µL damlalıklı bahşiş kullanarak. Pelet rahatsız etmeyin.<ol>
<li>Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve sıralanmış örnek hacmi az 0.2 mL ise, hücreleri ilk düşük bağlama 0.2 mL PCR tüpleri Santrifüjü önce aktarın.</li>
		<li>Örnek 5. 000'den az hücreleri içeren ve birim 0.2 mL den fazla ise, spin 5 min için bir santrifüj-4 ° c, 500 x g, ile aşağı hücreleri ve tüm 200 µL süpernatant, kaldırın. Kalan 200 µL süpernatant, in pelleted hücreleri yeniden askıya sonra hücreleri 0.2 mL PCR tüpleri için aktarmak ve spin aşağı tekrar. Tüm ama 20-30 µL Pelet sonra ikinci spin kaldırmak ve hücreleri yeniden askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüp süpernatant sol hücrelerde resuspend. Gerekiyorsa, ek PBS % 2 eklemek FBS/PBS (de %2 sığır serum albumin (BSA) kullanabilirsiniz / PBS veya PBS yalnız) bir konsantrasyon 5 elde etmek için x104 5 x 105 hücre/ml. Not: hücre sayar kullanım hücreler askıya alma için kullanılan birim tahmin etmek için sitometresi tarafından toplanan.</li>
	<li>2-5 µL yeniden askıya alınan hücrelerin (üreticinin yönergeleri izleyerek) bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre9kullanarak bir doğru hücre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.</li>
	<li>Bir birimi yeniden askıya alınan hücrelerin hücrelere yeni 1,5 mL tüpler için istediğiniz sayıyı içeren aktarın. Şekil 1' deki deneme için 2.000, 1000 veya 500 HSCs veya HPs transfer edildi. Hücreler için istediğiniz sayıyı Western blot tarafından elde edilen sinyal gücüne bağlıdır ve ampirik olarak belirlenir. 20 µL veya 100 µL Eppendorf pipet ucu kullanarak aktarımı gerçekleştirmek.</li>
	<li>Bir sallanan kova rotor 4 ° c, 500 x g, 5 min için hücrelerde santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>100 x hisse senedi çözümler üretmek için üreticinin yönergelerine göre proteasome ve fosfataz inhibitörleri olarak DMSO geçiyoruz.</li>
	<li>2 x Laemmli örnek arabellek distile su eşit miktarda ile yapılabileceği 4 x Laemmli örnek arabellek sulandrarak hazırlayın. 2 x inhibitörleri 2 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri 100 x stokunun uygun bir miktarda ekleyin. Not: 2 x Laemmli örnek arabellek önceden yapılabilir, ama proteasome ve fosfataz inhibitörleri hemen ve 2 x Laemmli örnek arabellek (plus inhibitörleri) hücre Pelet hücreleri, koşullar için açıklandığı gibi eklemeden önce aşağıdaki adımda eklenmelidir.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hücre Pelet ve hücre Pelet ile tüp içinde kalan süpernatant için süpernatant bir bölümünü kaldırmak, 2 x Laemmli örnek arabellek artı 500 son bir konsantrasyon elde etmek için proteasome ve fosfataz inhibitörleri eşit bir birim ekleme hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği. Not: 20 µL toplam hacmi 2.000 hücrelerde Pelet süpernatant ile 18 µL kaldırmalısınız hücreleri (adım 2.6) centrifuging sonra adım 2.5, bir tüp ve kalan süpernatant ile 2 µL aktarırsanız Örneğin, (2 µL) eşit hacmi ekleyin 2 x 500 hücre/µL 1 x Laemmli örnek arabelleği son bir konsantrasyon elde etmek için Laemmli örnek arabellek.</li>
	<li>Lysate en kısa zamanda üretmek için Pelet resuspend. Bu noktada, örnekleri hemen SDS-sayfa jelleri electrophoresed veya olabilir ek sıvı N2 içinde donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.</li>
</ol>3. Elektroforez
<ol><li>Lysates 95 ° c ısı bloğundaki veya kaynar suda 5 dk için ısı.</li>
	<li>1-40 µL (500 kadar 20.000 hücre eşdeğerleri içeren) lysates, kullanarak standart protokolleri10SDS-sayfa jelleri 100V adlı electrophorese. Not: Lysate jel yüklenen hacmi arzu edilen sinyal oluşturmak için gereken hücre sayısı tarafından belirlenir ve ilgi ve antikor kalitesini protein bereket on bağlı olacaktır. Şekil 1 ' deki verileri 2.000, 1000 ve 500 hücre karşılıkları lysate ile elde edilmiştir. Kuyu genişliğini 3 mm için 1,5 mm. 1.5 mm diş olabilir aralığında piyasada bulunan bir tarak makas kullanarak daha geniş dişleri ile kesilmelidir.</li>
</ol>4. transfer ve blok
Not: standart protokolleri11takip bir Western blot gerçekleştirin. Belgili tanımlık merdiven burada kısaca özetlenmiştir:
<ol><li>Distile su ile 10 s sonra yıkama membran kısa bir süre için bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran metanol ile pretreat.</li>
	<li>Protein SDS-sayfa jel aktarım cihazları üreticisi tarafından sağlanan el kitabındaki yönergeleri takip membran aktarın.</li>
	<li>Devri, blok membran ile %5 Sığır serum albumin (BSA) PBST içinde 2 mL (PBS % 0.1 ile ara) standart protokolleri11takip 4 ° C'de gecede.</li>
</ol>5. antikor etiketleme
<ol><li>Membran ile antikor gecede 4 ° C'de satıcı tarafından önerilen antikor dilutions kullanarak bir shaker üzerinde kuluçkaya. Not: Biz HSCs ve HPs ve karşılık gelen antikor dilutions için doğrulanmış, antikorlar malzemeler tablo gösterilir. Standart prosedürler8kullanarak antikor etiketleme gerçekleştirin.</li>
</ol>6. algılama
<ol><li>Membran 3 kez, PBST her makinaya oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Membran ile Oda sıcaklığında 1 min için geliştirilmiş Kemiluminesan tampon 2 mL kuluçkaya. Üreticinin yönergeleri, veya autoradiography film ve film işlemci aşağıdaki bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri algılayabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için hiçbir çatışması var.

Western blot spesifik proteinlerin ve sinyal yolları aktivasyonu dokular veya hücreleri tespit için ortak bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yordam ufak değişiklikler getirerek, biz düzenli olarak 15 farklı proteinler (Malzemeler tablo) 15.000 HSCs ve bazı durumlarda olabildiğince az 500 HSCs olarak tespit edebildik. The Most bu protokolündeki kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde hücreleri sayma, 2) tüpler arası sayısını en aza indirme ve 3) doğrudan Laemmli örnek arabellek içeren hücr...

Hematopoetik kök hücre (HSCs) tüm kan soy çıkmasına neden olabilir kendini yenileyerek hücrelerdir. Onlar nispeten nadir biyokimyasal analizler zor işleme kemik iliği hücrelerinde vardır. Akış Sitometresi gibi nadir hücrelerin analiz etmek için uygun yaklaşımlar göreli miktarda hücre yüzey işaretleyicileri ve intraselüler protein miktarının için son derece yararlı olmuştur. Ancak, çözümleme hücre içi proteinlerin hücre permeabilization yordamlar antikor erişimi etkinleştirmek için kullanımı gerektirir ve tüm hücre yüzey epitopları bu yordamları1,2hayatta. Buna ek olarak, farklı protein izoformlarının veya bölünme ürünleri arasında ayırımcılık antikorlar genellikle akış sitometresi için kullanılabilir değildir ve bu nedenle müfettişler, hala analiz türleri kesin Batı lekesi güvenmek.
Hücre lysates Western blot Analizi çoğu laboratuarlarında rutin bir işlemdir. Hücre epitopları hücre yüzey moleküllerin korumak yerel koşullar altında saf ve hücre lysates daha sonra hazırlanan ve analiz. Ancak, nüfus tarafından Western blot nadir İlköğretim hücredeki protein analizi hayvanlar yeterince hücre elde etmek için çok sayıda ötenazi gerektirebilirsiniz. Birkaç adım için küçük ayarlamalar yaparak, geleneksel Batı blotting Protokolü proteinler HSCs (500-15.000 bağlı olarak faiz protein) nispeten az sayıda tespit edebilir başardı. Doğru bir şekilde dikkatle hücre kaybı, en aza indirmek için borular arasında hücre aktarımlarını azaltma hücre Pelet işleme hücreleri, sayım ayarlamaları dahil ve hücrelerin konsantre bir yükleme ile tanımlanmış bir dizi lysing arabellek içeren proteasome ve fosfataz inhibitörleri. Yayımlanmış raporların çoğu Batı lekesi 20.000 veya daha fazla HSCs3,4,5,6,7ile elde içerir; Bu basit bir prosedür hücreleri ve deneysel hayvan 4 ve 40 kat arasında tarafından eşdeğer veri üretmek için gereken sayısını azaltır. Protokol sonuçları hücre başına bazında değil, bir iç kontrol normalleştirmek için tasarlanmıştır. Bu veri bir iç kontrol için normalleştirilmiş Eğer göz ardı edilebilir protein düzeyleri olarak genel indirim olarak algılanmasını sağlar. Bir hücre başına bazında normalize önemini gen ifadesi verileri8analiz için tanımlanmıştır ve Western blot tarafından protein miktarının aynı ilke geçerlidir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı herkes için az sayıda hücre analiz etmek gerek yararlı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>%30 Akrilamid Bis çözeltisi</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protean 3 tarak</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Hücre</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Transfer Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>transfer</td></tr><tr><td>PowerPac HC Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>elektroforez</td></tr><tr><td>Görüntüleme Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>sinyal algılama</td></tr><tr><td>4x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS Elektroforez Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>elektroforez</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Transfer Kiti, 40 için lekeler</td><td>Bio-Rad</td><td>1704272</td><td>transferi</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteylleri</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>GB-450-1</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>2469</td><td>WB antikoru, 1000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referansı (şekil): Şekil 2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Hücre sinyalleme</td><td>4858</td><td>WB antikoru, 1000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): Şekil2</td></tr><tr><td>aktin (HRP konjuge)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB antikoru, 500 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:5000 referans(şekil): Şekil 1, Şekil2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>15000 hücrede doğrulanmış WB antikoru antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans(şekil): ref5 (Şekil 5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Hücre Sinyali</td><td>: 15000 hücre antikor konsantrasyonunda doğrulanmış 2317 WB antikoru: 1:1000 referans(şekil): ref5 (Şekil 4)</td><td></td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9644</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans(şekil): ref5 (Şekil 4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2855</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (Şekil 4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Hücre Sinyali</td><td>15000 hücrede doğrulanmış 4308 WB antikoru antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (Şekil 4)</td><td></td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Hücre Sinyali</td><td></td><td>15000 hücrede doğrulanmış 4877 WB antikoru antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (Şekil 5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9188</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2983</td><td>15000 hücrede doğrulanmış WB antikoru antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Hücre Sinyali</td><td>5536</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4953</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans(şekil): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>hücre sinyalizasyonu</td><td>2535</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:1000 referans (şekil): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>aktin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB antikoru, 15000 hücrede doğrulanmıştır antikor konsantrasyonu: 1:3000 referans (şekil): ref5 (Şekil 4)</td></tr><tr><td>soy tükenme kiti (fare)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin saflaştırılması</td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin saflaştırılması</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>fosforilasyon stimülasyonu</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit antikoru</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>hücre sıralama</td></tr><tr><td>1.0 mm Entegreli Ara Plakalar Spacers</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A30075</td><td>membran bloke edici</td></tr><tr><td>serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>orta takviye</td></tr><tr><td>hücre sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>hücre sayma</td></tr><tr><td>hemositometresi</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td>hücre sayma</td></tr><tr><td>flim</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>sinyal algılama</td></tr><tr><td>tıbbi film işlemcisi</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>sinyal algılama</td></tr><tr><td>Süper Sinyal Batı Femto Maksimum Hassasiyet Substrat Teorisi</td><td>Scientific</td><td>34096</td><td>sinyal algılama</td></tr><tr><td>Allegra X-15R Santrifüj (Rotor SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>örneği hazırlık</td></tr><tr><td>BLUEstain protein merdiveni</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>P007-500</td><td>elektroforez</td></tr><tr><td>hücre sıralayıcı</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>elektroforezi</td></tr></tbody></table>

bir western protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoetik kök hücre (HSCs) nadir hücreleri, fare kemik iliği sadece 25.000 ~ fenotipik içeren uzun süreli kullanıma HSCs. Batı blotting iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve HSCs (500-15000 hücreleri) az sayıda analizi için uygun. Fenotipik HSCs saf, doğru sayılır ve Laemmli örnek arabellekte doğrudan lysed. Hücreler eşit sayıda içeren Lysates Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz edildi ve leke hazırlanmıştır ve standart Western blot protokolleri takip işlenir. Bu iletişim kuralı, 2000-5000 kullanarak HSCs düzenli olarak analiz edilebilir ve bazı durumlarda veri olabildiğince az 500 hücreler, çoğu yayınlarda bildirdi 20,000-40,000 hücrelere kıyasla olarak elde edilebilir. Bu iletişim kuralı diğer hematopoetik hücrelerin genel olarak uygulanabilir olmalıdır ve az sayıda hücre standart Laboratuvar yordamları kullanarak rutin çözümleme sağlar.

500-2000 arıtılmış HSCs ve HPs temsilcisi sonuçlarını resim 1 ve Şekil 2gösterilir. Şekil 1 ' deki β-aktin sinyal az 500 HSCs üzerinden tespit edilebilir ve bir fare kemik iliği HPs saf. Lysates 1.5 mm kuyu yükleme yükleme 3.0 mm kuyu içine daha çok daha güçlü bir sinyal gönderici 500 HPs üretilen unutmayın. Şekil 2 olduğunu EIF4G bir Western blot ve Rps6 fosforilasyon (...

Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Bu batı lekeleme protokolünün aşırı amacı, az sayıda hücre üzerinde batı lekeleri gerçekleştirmektir. Bu yöntem, hematopoetik kök hücre alanındaki spesifik proteinlerin varlığı veya bolluğu veya sinyal yollarının aktivasyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 20.000'den az hücre gerektirmesidir, bu nedenle nadir birincil hücre popülasyonlarını analiz etmek için daha az hayvana ihtiyaç duyulur.Bu yöntem için ilk olarak, hematopoetik kök hücre analizleri için kullanmamız gereken fare sayısını azaltmanın yollarını bulmaya çalışırken aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Xiongwei Cai olacak. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 500 katı derecede sıralanmış hematopoietik kök ve progenitör hücreleri içeren 1,5 mililitrelik tüpleri santrifüjlemek için sallanan bir kova rotoru kullanın.Santrifüjleme bittiğinde, hücre peletini bozmadan 100 mikrolitre süpernatan hariç hepsini atın. 5.000'den az hücre varsa ve sıralanan numunenin hacmi 0.2 mililitreden azsa, santrifüjlemeden önce hücreleri düşük bağlayıcı 0.2 mililitre PCR tüplerine aktarın. Bununla birlikte, 5.000'den az hücre varsa, a

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, insan bağışıklık sistemi (HIS) fareleri oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak insan kordon kanı buffy coat hücrelerinden izole edilir. CD34+ HSC'ler, sitokinlerle zenginleştirilmiş ve kriyoprezervasyonlu bir büyüme ortamında genişletilir. Son olarak, çözülmüş HSC'ler, HIS fare modelini oluşturmak için immün yetmezliği olan bir fare yavrusuna enjekte edilir.

İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi

Burada, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi için düşük hücre sayılı numunelerin hazırlanmasına yönelik bir protokol sunuyoruz.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

Bu protokol, bol miktarda yağ asidi, kolesterol, daha düşük sitokin konsantrasyonları ve hipoksi kullanarak kemik iliği mikroçevrimini taklit ederek sessiz insan hematopoetik kök hücrelerinin in vitro olarak korunmasını sağlar.

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Burada, hasarlı bir hematopoietik ve bağışıklık sisteminin yeniden inşası için terapötik hematopoietik kök/progenitör hücreleri hasat etmek için kemik morfogenetik protein-2 yüklü jelatin iskeleler tarafından tetiklenen in vivo osteo-organoidler kurduk. Genel olarak, bu yaklaşım hücre tedavileri için umut verici bir hücre kaynağı sağlayabilir.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Öğrenin, hematopoetik kök hücrelerde 500 hücreyle Western blot yapmayı. Bu yöntem, nadir hücre popülasyonlarında protein analizi ve sinyal yolaklarını incelemek için hayvan kullanımını azaltır.

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Daha fazla video keşfet