Name: Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Keşfedin, CiDER enzimi kullanarak memeli hücrelerde kimyasal indüklenebilir DNA hidroksimetilasyonu ve epigenetik yeniden şekillenme yöntemlerini. Bu teknik, epigenetik düzenlemeleri zamansal olarak kontrol etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mali teşekkür çekmek--dan ulusal sağlık Enstitüleri (YZ R01GM112003), hibe Welch Vakfı (YZ için BE-1913), Amerikan Kanser Derneği (RSG-16-215-01 TBE YZ için), kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (RR140053 YH için RP170660 YZ için), Amerikan Kalp Derneği (YH 16IRG27250155) ve John S. Dunn Vakfı ortak araştırma ödülü programı.

1. hücre kültürü, plazmid Transfection ve kimyasal indüksiyon
<ol>
	<li>Kültür ile % 10 ısı inaktive fetal sığır serum, 100 U/mL penisilin ve streptomisin %5 CO237 ° C'de takıma bir yapisan hücre kültürünü (örneğin, insan embriyonik böbrek HEK293T hücre) (DMEM), Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda.</li>
	<li>Elma şarabı plazmid hücrelerle transfect.
	<ol>
		<li>En az 18 h transfection önce tohum 0,3 x 106 hücre uygun DMEM 2.5 ml 6-şey tabak içinde iyi ve hücreleri 37 ° C'de % 60-80 confluency ulaşmak için gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Kullanmadan önce oda sıcaklığına transfection reaktif önceden ısıtmak.</li>
		<li>Yer 250 µL serum-Alerjik orta steril bir tüp. Not: Bu miktar % 80'i confluency ile 6-şey plaka için hazırlanmıştır. Gerekirse, orantılı olarak orta miktarda plakaları veya hücre sayıları boyutları göre belirleyin.</li>
		<li>Elma şarabı18 veya TET2 katalitik domain kodlama plazmid 2,5 µg Ekle (TET2CD pozitif kontrol olarak)12,13 serum-Alerjik orta içine ve yavaşça karıştırın pipetting tarafından.</li>
		<li>Transfection reaktif 7.5 µL seyreltilmiş DNA karışıma ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.</li>
		<li>20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış medya değiştirmek ve karışımı drop-wise wells için ekleyin ve hafifçe DNA karışımı ve transfection reaktifi olarak dağıtabilmenizi hücre kültür plaka sallamak.</li>
		<li>Hücreleri ve karışımı bir gecede kuluçkaya ve ortamı ile taze tam DMEM 2 ml içeren transfection reaktif değiştirir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kimyasal indüksiyon
	<ol>
		<li>Seyreltik 2 mM (DMSO içinde çözünmüş) rapamycin stok uygun tam orta 20 µM bir konsantrasyon için.</li>
		<li>Transfected hücreleri 200 son bir konsantrasyon ulaşmak için 2 mL ortamda muhafaza seyreltilmiş rapamycin 20 µL eklemek nM. Not: 48 h için kuluçka sonra hücreleri 5hmC nesil miktar veya başka herhangi bir aşağı akım uygulama için hazırsınız demektir. Gerekirse, indüksiyon verimliliği hücreleri daha fazla 5hmC miktar aşağıda açıklandığı gibi her 3 h yaptırmayı tarafından izlenen ve şekil 1' de gösterilen.</li>
		<li>İçin daha iyi miktar 5hmC indüksiyon verimlilik tohum hücreleri 3 saatte izlemek için kuyu ayırın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. miktar Rapamycin kaynaklı 5hmC üretim Immunostaining tarafından
<ol>
	<li>5hmC ayirt boyama Not: PBS plaka tüm hücrelerde kapsayacak şekilde 3 N HCl ile % 4 paraformaldehyde, %0.2 yüzey aktif (örneğin Triton X-100) oluşan fiksasyon çözüm yeterli miktarda ekleyin. Örneğin, 500 µL çözüm için iyi bir 6-şey plaka yeterli. Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin.<ol>
		<li>Hücreleri gidermek için 15 dakika ortam sıcaklığı, rapamycin tedavi hücrelere PBS içinde %4 paraformaldehyde ekleyin. Kontrol grubu için hücreleri mCherry-elma rapamycin tedavisi olmadan ifade kullanın. Kışkırtmak değil. Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. Uygun koruma giymek.</li>
		<li>Sabitleştirici çözüm atın. Sabit % 0,2 yüzey aktif hücre zarının permeabilize için PBS için 30 dk içinde hücrelerle kuluçkaya.</li>
		<li>Permeabilization çözüm atın. 3 N HCl permeabilized hücrelere ekleme ve 15dk için DNA'yı denatüre kuluçkaya.</li>
		<li>HCl. ekle 100 mM Tris-HCl arabelleğe (pH 8.0) pH nötralize için 10 min için hücreleri atın.</li>
		<li>Tüm çözüm atın. Hücreler için PBS ile iyice yıkayın 3 - 5 kez. PBS iyice kaldır. Not: PBS her yıkama adım için yeterli miktarda ekleyebilirsiniz. Örneğin, PBS 1 mL 6-şey plaka için yeterli.</li>
		<li>Hücreleri % 1 BSA ve yüzey aktif (örneğin ara 20) PBS içinde nazik sallayarak ile 1 h için % 0.05 oluşan engelleme arabelleği ekleyerek engellemek.</li>
		<li>Engelleme çözüm atın. Seyreltilmiş 5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>PBS hücrelerle 15dk için üç kez yıkayın.</li>
		<li>Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik hücreler için ikincil antikor (1: 200) ve 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>PBS hücrelerle üç kez kalan antikorlar kaldırmak için kapsamlı bir şekilde yıkayın.</li>
		<li>250 ng/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (çekirdek leke DAPI) 5 dk. Kaldır boyama çözüm ekleyin.</li>
		<li>Slayt veya cam-alt kültür çanak confocal görüntüleme için immunostained hücreler bağlayın. Temsil edici bir sonuç şekil 1Badımında gösterildi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akış Sitometresi Not: 96-şey yuvarlak alt plaka boyama yordamını kullanın. Genellikle, 150 µL reaktifler, her şey için yeterli olur.<ol>
		<li>FACS arabellek (PBS % 1 BSA, 2 mM EDTA ile) transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerinde resuspend. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma şarabı ifade kullanın.</li>
		<li>Fix ve hücreleri adım 2.1 içinde açıklandığı gibi permeabilize.</li>
		<li>2 N HCl 10 min için DNA denatüre hücrelere ekleyin.</li>
		<li>HCl. Nötrleştir atın ve adım 2.1 içinde açıklandığı gibi hücreleri engellemek.</li>
		<li>Seyreltilmiş anti-5hmC antikor (1: 200) hücrelere ekleme ve oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın. FACS arabellek iyice kaldır.</li>
		<li>Seyreltilmiş fluorophore (FITC) Ekle-Birleşik Floresans aktif hücre (FACS) analiz sıralama için ikincil antikor (1: 400) ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>FACS arabellek içeren hücreleri üç kez yıkayın.</li>
		<li>Örnekleri FACS analiz için hazırsınız demektir. Temsil edici bir sonuç şekil 1 c-Dgösterildi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. nokta-leke tahlil 5hmC ve 5-metilsitozin (5mC) ölçmek için tutarlar
<ol>
	<li>Bir ticari DNA ekstraksiyon kiti kullanarak transfected ve rapamycin kaynaklı hücrelerden genomik DNA izole et. Kontrol grubu için rapamycin tedavisi olmayan hücreler elma suyu transfected kullanın.</li>
	<li>Isı 80 ° C ve öncesi emmek nitroselüloz membran çift distile H2O ve o zaman 6 x 10 min için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek vakum fırın.</li>
	<li>60 µL bir 96-şey PCR plakasına eşit miktarda DNA (Toplam 2 µg TE arabelleği) yükleyin. Geri kalan wells TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 30 µL ekleyin.</li>
	<li>İki kat seri dilutions çözüm 30 µL satır 1 2 satırda aynı sütun konumu aktararak 96-şey plaka üzerinde dikey olarak yapmak. Tekrar karıştırın ve sınır ulaşan kadar sonraki satırda wells çözüm 30 µL aktarmak.</li></ol>Son 30 µL kaldırın.
	<li>Her şey için 1 M NaOH ve 10 mM EDTA 20 µL eklemek, plaka mühür ve tamamen DNA çift yönlü denatüre 95 ° C de 10 dakika için karışım ısı.</li>
	<li>Buz üzerinde örnekleri sakin ve buz gibi 2 M amonyum asetat (pH 7,0) 50 µL eklenir ve 10 min için buz üzerinde kuluçkaya. Not: Adım 3.7-3.10 vakum kullanımı içerir.</li>
	<li>Nokta leke aparatı öncesi membran ile montaj ve kalan arabellek tam vakum kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Membran nokta leke aparatı her şey için 200 µL TE arabelleği ekleyerek yıkayın. TE arabellek kaldırmak için vakum açmak.</li>
	<li>(Önceki adımlarda 3.1-3.6 hazır) denatüre DNA her şey nokta leke cihazları için yükleyin. Çözümü kaldırmak için vakum açmak.</li>
	<li>Membran 2 tamamen vakum kullanma SSC ve Kaldır artık çözümler x 200 µL ekleyerek yıkayın.</li>
	<li>Nokta leke aparatı sökmeye, membran almak ve tüm membran ile 20 mL 2 durulama x SSC.</li>
	<li>Membran 20 dakika kuruması.</li>
	<li>Membran vakum için 2 h altında 80 ° C'de pişirin.</li>
	<li>Membran için engelleme çözüm (yağsız süt TBST % 5) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Engelleme çözüm atın. Bir sulandırılmış 5hmC (1:5, 000) veya 5mC (1:1, 000) eklemek için membran antikorları ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Membran ile kalan antikorlar kaldırmak için TBST 10 dk için üç kez yıkayın. TBST iyice kaldır.</li>
	<li>HRP-Birleşik bir ikincil antikor ekleyin (1:10, 000 Anti-tavşan HRP(5hmC) için veya 1:3,000 Anti-fare HRP(5mC)) membran ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>TBST ile membran 10 min için üç kez yıkayın.</li>
	<li>ECL substrat Kemiluminesan dedektörü kullanarak 5hmC sinyalleri görselleştirme için membran için kurutma Batı ekleyin. Temsil edici bir sonuç şekil 1Eiçinde gösterildi.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Burada DNA hydroxymethylation zamansal kontrolünü elde etmek için bir mühendislik Böl-TET2 enzim kullanımı resimli. 5-methycytosine dioxygenase ailesinin TET keşfi, TET proteinler ve onların büyük katalitik ürün 5hmC1,2,3biyolojik fonksiyonları deşifre etmek için birçok çalışma gerçekleştirilmiş, 4,5,6,<sup class=...

DNA metilasyonu, çoğunlukla, DNA metil-Transferazlar tarafından (DNMTs) katalize sitozin karbon 5 konumunu 5-metilsitozin (5mC) oluşturmak için bir metil grubu eklenmesi anlamına gelir. 5mC büyük bir epigenetik işareti kez transkripsiyon baskı, x kromozomu inactivation ve transposon1susturmak için sinyalleri memeli genom, görür. DNA metilasyonu iptali on-Elf translocation (TET) protein ailesi tarafından aracılık ettiği. TET enzimler ait demir (II) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxycytosine (5caC) 5mC art arda gelen oksidasyon katalizler 2-oxoglutarate bağımlı dioxygenases. TET-aracılı 5mC oksidasyon ek bir memeli genom üzerinde epigenetik kontrol katmanı uygular. TET keşfi TET proteinlerin biyolojik fonksiyonları ve onların büyük katalitik ürün 5hmC açıklayacak epigenetik alanındaki yoğun ilgi yol açtı. 5hmC sadece bir ara TET-aracılı aktif DNA demethylation2sırasında,3,4, değil ama aynı zamanda kararlı bir epigenetik görevi görür5,6,7,8 işareti . DNA hydroxymethylation son derece gen ekspresyonu ile ilişkili ve anormal olmasına rağmen DNA hydroxymethylation bazı insan bozuklukları9,10,11ile nedensel ilişkileri ilişkili değişikliklerdir DNA üzerindeki epigenetik değişiklikler ve fenotipleri arasında sık sık kurulacak zorlu kalır, hangi kısmen doğru eklemek veya DNA genom içinde kaldırmak için güvenilir aracı olmadığı için atfedilen zamansal ve mekansal tanımlı Çözünürlük.
Burada aracı (çalışmaların nedensel ilişkileri karşı karşıya engel aşmak için elma şarabı) arasında DNA hydroxymethylation ve gen transkripsiyonu remodeling bir kimyasal indüklenebilir epigenome kullanımı raporu Tasarım varsayımına dayanır bu TET2 katalitik etki alanını (TET2CD) memeli hücrelerinde ifade iki etkin olmayan parçaları içine bölünmüş ve enzimatik işlevi bir kimyasal indüklenebilir dimerization yaklaşım ( alarak geri yüklenebilir Şekil 1A). Böl-TET2CD sistemi kurmak için TET2CD, Cys-zengin bölge ve düşük karmaşıklık bölge12yoksun TET2-DNA kompleks bildirilen kristal yapısı temelinde bir çift iplikli β-helix (DSBH) kat oluşan altı sitelerinin seçilmesini. Sentetik bir gen Rapamycin indüklenebilir dimerization modülü FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) kodlama ve rapamycin14,15, kendi kendine sıyırmada peptid T2A birlikte memeli hedefinin FKBP rapamycin bağlayıcı etki (FRB) polipeptid sıra16,17, tek tek TET2CD içinde seçilen split siteleri içine eklenir. TET2 seçimi mühendislik hedefimiz olarak aşağıdaki önemli noktalar üzerinde temel alır. TET2 ilk, somatik mutasyonlar DNA hydroxymethylation eşlik eden azalma ile sık sık Miyeloid bozuklukları ve kanser10için kaçınılması gereken duyarlı sitelerin yararlı bilgiler sağlar, dahil olmak üzere insan hastalıklarda gözlenir ekleme. İkinci olarak, TET2 katalitik domain, özellikle düşük karmaşıklık bölgesinde, büyük bir kısmı böylece bize bir simge durumuna küçültülmüş Böl-TET2 indüklenebilir epigenetik değişiklikler için tekne etkinleştirme enzimatik işlevi12, gereksiz. 15 yapıları eleme sonra onun enzim aktivitesinin en yüksek rapamycin indüklenebilir restorasyon memeli sistemdeki sergilenen bir yapı seçilmiş ve elma şarabı18belirlenmiş. Biz burada indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik rapamycin ile yeniden elde etmek için mCherry öğesini elma suyu nasıl kullanılacağını açıklar ve elma şarabı aracılı 5hmC üretim modeli hücresel sisteminde HEK293T doğrulamak için üç yöntem mevcut.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit,% 16 Çözelti</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albümin, Sığır</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hidroksimetilsitozin (5-hmC) antikoru (pAb)</td><td>Aktif Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Ekonomik Vakumlu Fırın, 0,6 Cu.Ft. (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Aparatı</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-metilsitozin (5mC) Antikor, klon 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG, HRP'ye Bağlı Antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Çözümü</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

kimyasal-indüklenebilir dna hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için bir mühendislik split-tet2 enzim

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA metilasyonu memeli genom bir istikrarlı ve kalıtsal epigenetik değişiklik ve hücresel işlevleri kontrol etmek için gen ifadesinin düzenlenmesine ilgilenmektedir. DNA metilasyonu veya DNA demethylation, ters dioxygenases on-on translocation (TET) protein ailesinde aracılık ettiği. Her ne kadar bu anormal DNA metilasyonu ve demethylation gelişimsel kusurlar ve kanser ile ilişkili olan yaygın olarak bildirilmiştir, nasıl epigenetik değişikliklerin doğrudan sonraki değişiklik gen ifade veya hastalık ilerleme katkıda büyük ölçüde doğru eklemek veya DNA genom tanımlanmış zamansal ve mekansal çözünürlükte içinde kaldırmak için güvenilir araçları eksikliği nedeniyle belirsizdir. Bu engeli aşmak için bir split-TET2 enzim 5-metilsitozin (5mC) oksidasyon zamansal kontrolünü ve sonraki memeli hücrelerinde epigenetik Birleşik sadece kimyasallar ekleyerek remodeling etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Burada, bir kimyasal indüklenebilir epigenome tadilat araç (elma şarabı), memeli hücreleri ve ile 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) kimyasal indüklenebilir üretim miktarının bir mühendislik Böl-TET2 enzim üzerinde dayalı tanıtmak için yöntemleri tarif immunostaining, Akış Sitometresi veya bir nokta-leke tahlil. Bu kimyasal-indüklenebilir epigenome tadilat araç geniş kullanım hücresel sistemleri genetik kodu değiştirmeden sorguya yanı sıra çeşitli biyolojik sistemlerde epigenotype−phenotype ilişkiler sondalama bulacaksınız.

Kimyasal indüklenebilir 5mC 5hmC dönüşüm immunostaining tek hücre düzeyinde, transfected (mCherry-pozitif) hücre popülasyonlarının Akış Sitometresi Analizi veya şekil 1' de gösterildiği gibi daha nicel bir nokta-leke tahlil tarafından doğrulanabilir. TET2 veya TET2CD, katalitik etki alanı çalışma pozitif bir denetim kullanılmıştır. Başvurular 18-20 rapamycin kaynaklı değişiklikler genom geniş eşleme ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: 5hmC ve Kromatin erişi...

Memeli hücreleri kimyasal indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için içine bir mühendislik Böl-TET2 enzim (elma şarabı) tanıtmak için detaylı protokolleri mevcuttur.

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Bu deney serisinin genel amacı, hidroksimetilasyon ve epigenetik yeniden şekillenme gibi indüklenebilir DNA modifikasyonu için memeli hücrelerine CiDER adı verilen tasarlanmış bir bölünmüş TET2 enzimi sokmaktır. Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Bu tekniğin ana avantajı, tasarlanmış bölünmüş TET2 enziminin, 5-metilsitozin oksidasyonunun zamansal kontrolüne ve ardından memeli hücrelerinde epigenetik durumların kimyasal katkı maddeleri ile yeniden şekillenmesine izin vermesidir. Bu prosedüre başlamak için,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ve ayrıca mililitre başına 100 birim penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de yapışık bir hücre hattı kültürü.Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile inkübe edin. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri CiDER plazmidi ile transfekte edin. Daha sonra hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı yeni tam DMEM ile değiştirin. Hücreleri kimyasal olarak indüklemek için, 200 nanomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için iki mililitre ortamda tutulan transfekte edilmiş hücrelere 20 mikrolitre seyreltilmiş Rapamisin ekleyin. Akış sitometrisi yapmak için, transfekte edilmiş ve Rapamisin ile indüklenen hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin.Kontrol grubu için, Rapamisin tedavisi olmadan CiDER eksprese eden hücreleri kullanın. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi düzeltin ve geçirgen hale getirin. Daha sonra DNA'yı 10 dakika boyunca denatüre etmek için hücrelere iki normal hidroklorik asit ekleyin.Metin protokolünde tarif edildiği gibi hücreleri nötralize ettikten ve bloke ettikten sonra, seyreltilmiş anti-5hmC antikorunu hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri FACS tamponu ile üç kez yıkayın.FACS arabelleğini iyice çıkarın. FACS analizi için seyreltilmiş bir florofor konjuge ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri FACS tamponu ile üç kez yıkayın.Yıkamanın ardından numuneler FACS analizi için hazır hale gelir. Ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak transfekte edilmiş ve Rapamisin ile indüklenmiş hücrelerden genomik DNA'yı izole edin. Kontrol grubu için, Rapamisin tedavisi olmadan CiDER transfekte edilmiş hücreleri kullanın.Vakumlu fırını 80 santigrat dereceye ısıtın. Nitroselüloz membranı çift damıtılmış suda önceden ıslatın ve ardından 6X SSC tamponunda 10 dakika bekletin. Daha sonra, 96 oyuklu bir PCR plakasına 60 mikrolitre eşit miktarda DNA yükleyin.Kalan kuyucuklara 30 mikrolitre TE tamponu ekleyin. Birinci satırdaki 96 mikrolitre çözeltiyi ikinci satırdaki aynı sütun konumuna aktararak 30 oyuklu plaka üzerinde dikey olarak iki katlı seri seyreltmeler yapın. Tekrar karıştırın ve sınıra ulaşılana kadar 30 mikrolitre çözeltiyi sonraki sıradaki kuyucuklara aktarın.Ardından son 30 mikrolitreyi kuyudan çıkarın. Daha sonra, her kuyucuğa 20 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ve 10 milimolar EDTA ekleyin. Plakayı kapatın ve DNA dupleksini tamamen denatüre etmek için karışımı 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.Numuneleri hemen buz üzerinde soğutun. Her oyuğa 50 mikrolitre buz gibi iki molar amonyum asetat ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Bu arada, nokta leke aparatını önceden ıslatılmış zar ile birleştirin.Tam bir vakum kullanarak kalan tamponu çıkarın. Nokta leke aparatının her bir oyuğuna 200 mikrolitre TE tamponu ekleyerek zarı yıkayın. TE tamponunu çıkarmak için vakumu açın.Daha sonra, denatüre DNA'yı nokta lekesi aparatının her bir oyuğuna yükleyin. Çözeltiyi çıkarmak için vakumu açın. 200 mikrolitre 2X SSC ekleyerek membranı yıkayın ve kalan solüsyonları bir vakum kullanarak tamamen çıkarın.Nokta leke aparatını sökün. Ardından zarı çıkarın ve tüm zarı 20 mililitre 2X SSC ile durulayın. Membranı 20 dakika havayla kurutun.Membranı daha da kurutmak için, iki saat boyunca vakum altında 80 derecede pişirin. Bloke edici çözeltiyi zara ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bloke edici çözeltiyi attıktan sonra, seyreltilmiş 5-hmC veya 5-mC antikorları zara ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Artık antikorları çıkarmak için membranı TBST ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. TBST'yi iyice çıkardıktan sonra, zara bir HRP konjuge ikincil antikor ekleyin. Membranı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.Membranı TBST ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Son olarak, bir kemilüminesans detektörü kullanarak 5 hmC sinyallerinin görselleştirilmesi için membrana ECL western blotlama substratı ekleyin. Akış sitometrisi ile CiDER aracılı 5-hmC üretiminin temsili bir miktar belirleme sonucu burada gösterilmektedir.Sadece Rapamisin ile tedavi edilen koşullar altında CiDER eksprese eden hücreler 5-hmC seviyelerinde önemli bir artış gösterir. Dot-blot testi ile tüm hücre popülasyonundaki 5-hmC seviyesinin küresel değişiminin temsili bir sonucu burada gösterilmiştir. Yükleme kontrolü, toplam giriş DNA'sı miktarlarının etilen mavisi boyanması ile görselleştirilir.Sonuçlar, Rapamisin tedavisinin, ihmal edilebilir arka plan aktivitesine sahip CiDER eksprese eden HEK293T hücrelerinde sağlam 5-hmC üretimini indüklediğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, epigenetik alanındaki araştırmacıların, genetik kodu değiştirmeden hücresel işlevi keşfetmelerinin ve çeşitli biyolojik sistemlerdeki epigenotip ve fenotip ilişkilerini araştırmalarının yolunu açmıştır.

an-engineered-split-tet2-enzyme-for-chemical-inducible-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Burada, NgTET enzimini kullanarak bakteriyofajlardaki DNA modifikasyonlarını azaltmak, verimli ve izsiz CRISPR-Cas mutajenezi sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, biyoteknoloji ve faj terapisindeki uygulamalar için fajların genetik mühendisliğini kolaylaştırır.

NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Bu protokol, lokusa özgü DNA metilasyonunu hassas ve azaltılmış hedef dışı etkilerle indüklemek için dCas9-DNMT3A ve dCas9-HDAC1 efektörlerini spesifik sgRNA'larla birleştiren, K562 hücrelerinde hedeflenen epigenetik düzenleme için bütünleştirici olmayan, epizomal CRISPR/dCas9 tabanlı bir sistemi tanımlar.

K562 Hücrelerinin Epigenetik Mühendisliği: dCas9-DNMT3A ve -HDAC1 Füzyon Proteinleri Kullanılarak Stabil Hedefli DNA Metilasyonu için Çift Vektörlü Epizomal Strateji

Keşfedin, CiDER enzimi kullanarak memeli hücrelerde kimyasal indüklenebilir DNA hidroksimetilasyonu ve epigenetik yeniden şekillenme yöntemlerini. Bu teknik, epigenetik düzenlemeleri zamansal olarak kontrol etme olanağı sunar.

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

Daha fazla video keşfet