Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

Bu deney serisinin genel amacı, hidroksimetilasyon ve epigenetik yeniden şekillenme gibi indüklenebilir DNA modifikasyonu için memeli hücrelerine CiDER adı verilen tasarlanmış bir bölünmüş TET2 enzimi sokmaktır. Bu yöntem, epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Bu tekniğin ana avantajı, tasarlanmış bölünmüş TET2 enziminin, 5-metilsitozin oksidasyonunun zamansal kontrolüne ve ardından memeli hücrelerinde epigenetik durumların kimyasal katkı maddeleri ile yeniden şekillenmesine izin vermesidir. Bu prosedüre başlamak için,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ve ayrıca mililitre başına 100 birim penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de yapışık bir hücre hattı kültürü.

Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 ile inkübe edin. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri CiDER plazmidi ile transfekte edin. Daha sonra hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı yeni tam DMEM ile değiştirin. Hücreleri kimyasal olarak indüklemek için, 200 nanomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için iki mililitre ortamda tutulan transfekte edilmiş hücrelere 20 mikrolitre seyreltilmiş Rapamisin ekleyin. Akış sitometrisi yapmak için, transfekte edilmiş ve Rapamisin ile indüklenen hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Kontrol grubu için, Rapamisin tedavisi olmadan CiDER eksprese eden hücreleri kullanın. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi düzeltin ve geçirgen hale getirin. Daha sonra DNA'yı 10 dakika boyunca denatüre etmek için hücrelere iki normal hidroklorik asit ekleyin.

Metin protokolünde tarif edildiği gibi hücreleri nötralize ettikten ve bloke ettikten sonra, seyreltilmiş anti-5hmC antikorunu hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri FACS tamponu ile üç kez yıkayın.

FACS arabelleğini iyice çıkarın. FACS analizi için seyreltilmiş bir florofor konjuge ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri FACS tamponu ile üç kez yıkayın.

Yıkamanın ardından numuneler FACS analizi için hazır hale gelir. Ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak transfekte edilmiş ve Rapamisin ile indüklenmiş hücrelerden genomik DNA'yı izole edin. Kontrol grubu için, Rapamisin tedavisi olmadan CiDER transfekte edilmiş hücreleri kullanın.

Vakumlu fırını 80 santigrat dereceye ısıtın. Nitroselüloz membranı çift damıtılmış suda önceden ıslatın ve ardından 6X SSC tamponunda 10 dakika bekletin. Daha sonra, 96 oyuklu bir PCR plakasına 60 mikrolitre eşit miktarda DNA yükleyin.

Kalan kuyucuklara 30 mikrolitre TE tamponu ekleyin. Birinci satırdaki 96 mikrolitre çözeltiyi ikinci satırdaki aynı sütun konumuna aktararak 30 oyuklu plaka üzerinde dikey olarak iki katlı seri seyreltmeler yapın. Tekrar karıştırın ve sınıra ulaşılana kadar 30 mikrolitre çözeltiyi sonraki sıradaki kuyucuklara aktarın.

Ardından son 30 mikrolitreyi kuyudan çıkarın. Daha sonra, her kuyucuğa 20 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ve 10 milimolar EDTA ekleyin. Plakayı kapatın ve DNA dupleksini tamamen denatüre etmek için karışımı 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Numuneleri hemen buz üzerinde soğutun. Her oyuğa 50 mikrolitre buz gibi iki molar amonyum asetat ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Bu arada, nokta leke aparatını önceden ıslatılmış zar ile birleştirin.

Tam bir vakum kullanarak kalan tamponu çıkarın. Nokta leke aparatının her bir oyuğuna 200 mikrolitre TE tamponu ekleyerek zarı yıkayın. TE tamponunu çıkarmak için vakumu açın.

Daha sonra, denatüre DNA'yı nokta lekesi aparatının her bir oyuğuna yükleyin. Çözeltiyi çıkarmak için vakumu açın. 200 mikrolitre 2X SSC ekleyerek membranı yıkayın ve kalan solüsyonları bir vakum kullanarak tamamen çıkarın.

Nokta leke aparatını sökün. Ardından zarı çıkarın ve tüm zarı 20 mililitre 2X SSC ile durulayın. Membranı 20 dakika havayla kurutun.

Membranı daha da kurutmak için, iki saat boyunca vakum altında 80 derecede pişirin. Bloke edici çözeltiyi zara ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bloke edici çözeltiyi attıktan sonra, seyreltilmiş 5-hmC veya 5-mC antikorları zara ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Artık antikorları çıkarmak için membranı TBST ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. TBST'yi iyice çıkardıktan sonra, zara bir HRP konjuge ikincil antikor ekleyin. Membranı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Membranı TBST ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Son olarak, bir kemilüminesans detektörü kullanarak 5 hmC sinyallerinin görselleştirilmesi için membrana ECL western blotlama substratı ekleyin. Akış sitometrisi ile CiDER aracılı 5-hmC üretiminin temsili bir miktar belirleme sonucu burada gösterilmektedir.

Sadece Rapamisin ile tedavi edilen koşullar altında CiDER eksprese eden hücreler 5-hmC seviyelerinde önemli bir artış gösterir. Dot-blot testi ile tüm hücre popülasyonundaki 5-hmC seviyesinin küresel değişiminin temsili bir sonucu burada gösterilmiştir. Yükleme kontrolü, toplam giriş DNA'sı miktarlarının etilen mavisi boyanması ile görselleştirilir.

Sonuçlar, Rapamisin tedavisinin, ihmal edilebilir arka plan aktivitesine sahip CiDER eksprese eden HEK293T hücrelerinde sağlam 5-hmC üretimini indüklediğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, epigenetik alanındaki araştırmacıların, genetik kodu değiştirmeden hücresel işlevi keşfetmelerinin ve çeşitli biyolojik sistemlerdeki epigenotip ve fenotip ilişkilerini araştırmalarının yolunu açmıştır.