İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.

Bu protokolün genel amacı, insan pankreas dokusu ile kullanım için uygun, optimize edilmiş, pasif bir optik temizleme yöntemini göstermektir. Bu yöntem, adacıkların innervasyonu hakkında ayrıntılar sağlayarak diyabetle ilgili nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, temizleme yönteminin yüksek çözünürlüklü, konfokal görüntülemede kullanılmak üzere insan pankreas dokusunun şeffaflığını sağlamasıdır.

Başlamak için, bir pankreas örneğini taze hazırlanmış% 4 paraformaldehite yerleştirerek düzeltin ve örneği 48 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, bir şişeyi buzlu bir kovaya koyarak soğutun. Ardından kovayı manyetik bir karıştırma plakasının üzerine yerleştirin.

Şişenin düz oturduğundan emin olun ve manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin. Şişeye 147.8 mililitre buz gibi damıtılmış, deiyonize su dökün. Daha sonra 20 mililitre 0.1 molar PBS, 20 mililitre buz gibi soğuk %40 akrilamid solüsyonu, 12.2 mililitre %16 paraformaldehit solüsyonu ve 250 miligram VA-044 başlatıcı ekleyin.

Tüm hidrojel çözeltisini en az 10 dakika karıştırın. Daha sonra, hidrojel çözeltisini içeren şişenin yanındaki buzun içine 15 mililitrelik bir konik tüp yerleştirin. Tüpe 14 mililitre monomer çözeltisi pipetleyin.

ve sabit ve kesitli doku örneğinden bir parça ekleyin. Ardından tüpü kapatın. Numuneyi, ışıktan korunurken dört santigrat derecede 3 gün boyunca monomer çözeltisi içinde inkübe edin.

Kuluçka işleminin ardından numuneyi buzun üzerine yerleştirin. Ardından, hortumu bir musluk aracılığıyla bir nitrojen tankına bağlayın. Numuneyi buz üzerinde tutarken, bir tarafında numuneyi içeren konik bir tüpün kapağını delmek için dikkatlice 18 gauge hipodermik bir iğne kullanın.

İğneyi, sıvı monomer çözeltisinin yüzeyinin altına gelene kadar tüpün içine sokun. Ardından, kapağın karşı tarafını delmek için başka bir 18 gauge hipodermik iğne kullanın, ancak bir havalandırma deliği görevi görebilmesi için çözeltiye batırılmasına izin vermeyin. Nitrojen tankından gelen hortumu hidrojelin altına batırılmış hipodermik iğneye bağlayın ve nitrojeni sıvı içinde sabit bir şekilde köpürene kadar yavaşça açın.

Oksijeni alındıktan sonra, tüp ile çevre arasında daha fazla gaz alışverişini önlemek için her iki iğneyi de hızlı bir şekilde çıkarın ve kapağı bir parafin filmle kapatın. Son olarak, hidrojeli polimerize etmek için numuneyi üç saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Polimerizasyondan sonra, kalan hidrojelden herhangi birini dökün.

Ardından, numuneyi her yıkama adımında 15 dakika boyunca 0.01 molar PBS'nin 3 ila 5 değişiminde yıkayın. Yıkandıktan sonra, numuneyi 40 mililitre veya temizleme tamponu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Numuneyi temizleme tamponunda 37 santigrat derecede inkübe edin ve numuneyi her gün yeni temizleme tamponuna değiştirin.

Uygun temizlemeyi kontrol etmek için, numuneyi bir ışığa tutun ve numunenin ışığın içinden geçmesine izin verdiğinden, ancak ekzokrin bölgelerde bir miktar ten rengini koruduğundan emin olun. Aşırı temizlenmiş bir numune, kenarlarda yıpranmış görünecek ve forseps ile alındığında doku çok yumuşak olacaktır. Bir numunenin düzensiz bir şekilde temizlenmesi yaygın bir durumdur.

Temizleme tamponunu 40 mililitre 0.01 molar PBS ile değiştirin ve numuneleri oda sıcaklığında bir gün boyunca 60 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Dört ila beş tampon değişikliği yapın ve son yıkamanın gece boyunca devam etmesine izin verin. Daha sonra, 2 mililitrelik düz tabanlı bir tüpte PACT boyama tamponu hazırlayın ve 1 mililitre baz PACT tamponuna% 2 normal serum ekleyin.

Daha sonra, boyama tamponuna standart primer antikor miktarının yaklaşık beş katını ekleyin. Bir spatula kullanarak, numuneyi yıkama tamponundan çıkarın ve fazla tamponu bir kağıt havluya sürün. Numuneyi birincil antikor çözeltisi ile tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde, 60 RPM'de iki ila dört gün boyunca çözelti içinde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, antikor çözeltisini çıkarın ve 0.01 molar PBS ekleyin. Numuneleri çalkalayıcı üzerinde 60 RPM'de iyice yıkayın, dört ila beş kez taze tampona geçin ve son yıkamayı gece boyunca çalkalayıcı üzerinde bırakın. Daha sonra, ikincil antikoru% 2 ilave serum ile PACT boyama tamponuna 1 ila 200 arasında ekleyin.

Numuneyi yıkama tamponundan çıkarmak için bir spatula kullanın ve fazla tamponu bir kağıt havluya kurutun. Daha sonra numuneyi ikincil antikor çözeltisi ile tüpe yerleştirin. Numuneyi oda sıcaklığında iki gün boyunca 60 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe ederken numuneyi ışıktan koruyun.

İnkübasyonun ardından, antikor çözeltisini çıkarın ve 0.01 molar PBS ile değiştirin. Numuneleri çalkalayıcı üzerinde 60 RPM'de iyice yıkayın, dört ila beş kez taze tampona geçin ve son yıkamayı gece boyunca çalkalayıcı üzerinde bırakın. Başlamak için, önce 11 gram iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamını tartarak ve dikkatlice 50 mililitrelik konik bir tüpe aktararak kırılma indisi eşleşen çözelti tamponunu hazırlayın.

Ardından, toz haline getirilmiş iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamından havayı boşaltmak için bir spatula kullanarak 5 mililitre 0.02 molar fosfat tamponu ekleyin. Gerekirse, daha fazla 0.02 molar fosfat tamponu kullanarak hacmi 10 mililitreye getirin, bir spatula ile karıştırın ve ardından spatuladaki fazlalığı tüpe kazıyın. Tamponu tamamen eriyene kadar 37 santigrat derecede inkübe edin, ters çevirin ve periyodik olarak hafifçe karıştırın.

Numuneleri kırılma indisi eşleşme çözeltisi tamponuna aktarın ve görüntülemeden önce iki ila dört gün boyunca ışıktan korunan tezgahta inkübe edin. Görüntülemeden hemen önce, az miktarda kırılma indisi eşleşme solüsyonunu sekiz kuyulu bir lamel alt hazne kızağına yerleştirin. Ardından numuneyi kuyuya ekleyin ve slaydı kapatın.

İnsan pankreasında adacıklar, sırasıyla beta hücreleri, alfa hücresi veya tüm endokrin hücreleri için İnsülin, Glukagon ve Salgılanan Grana Üç ile tanımlanabilir. Schwann hücreleri beyaz görünür ve endokrin hücreler İnsülin veya Glukagon ile boyanmış olarak gösterilir. Adacık çevresindeki kan damarlarının yanından geçen sinirler beyaz çizgiler halinde göze çarpar ve adacıklara doğru uzanır.

Burada Schwann hücreleri ile endokrin hücreler arasındaki temas açıkça görülebilir. Burada, bu videoda gösterilen yöntemler kullanılarak hazırlanan bir örnek, vazoaktif bağırsak peptidi için boyandı ve bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Sinir lifleri yüksek çözünürlükte net bir şekilde görülür ve ön planda bir kanal ve arka planda bir ganglion sarılırken gösterilir.

Bu prosedürü denerken, ana kanallardan ve damarlardan arınmış pankreas asiner bölgelerini kullanmayı unutmamak önemlidir.