Name: Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Öğrenin, yetişkin deriden birincil insan keratinositlerinin izolasyon yöntemini. Bu teknik, epidermal hücre biyolojisi ve inflamatuar deri hastalıklarının in vitro araştırmalarında güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar Annette Blak Rasmussen ve Kristine Moeller teknik verdikleri destek için teşekkür istiyor

Sağlıklı yetişkin gönüllü plastik cerrahisi uygulanan deri örnekleri koleksiyon ana bilgisayar kurumlarında etik kurul onayı gerektirir. Bu iletişim kuralı bölgesel Etik Komitesi, bölge Midtjylland tarafından Danimarka (M-20110027) kabul edildi. Burada açıklanan yöntemi Maciaq vd tarafından benzer çalışmalardan elde edilir 10 ve Liu ve Karasek11.
1. insan deri lenfositi yalıtım
<ol>
	<li>Başlatmak aşağıdaki çözümleri yaparak: 50 mL solüsyon % 0.25 tripsin ve % 0.1 glikoz DPBS içinde. Mix ve filtre (0.2 µm) çözüm sterilize. RPMI-1640 + % 2 FBS çözüm, DPBS ve keratinosit serum-Alerjik orta (KSFM) 50 mL 10 mL hazırlayın. KSFM takviyeleri ve 250 µL viomisin, 500 mL KSFM ekleyin. 37 ° C kullanmadan önce için çözümleri önceden ısıtmak.</li>
	<li>Cilt sağlıklı yetişkin gönüllüler plastik cerrahisi uygulanan toplamak. Kullanılan deri örnekleri yaklaşık 10 cm x 15 cm, vardır ama boyutu değişebilir. Ulaşım altında deri serin deri örnekleri soğutma bir öğeyi içeren bir Styrofoam kutusu taşıma tarafından tutmak. Gerekirse, deri örneği 4 ° C'de gecede depolanabilir.</li>
	<li>Steril makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümü altında gelen yağ çıkarmak.</li>
	<li>Cilt bölümü (yaklaşık 10 cm x 15 cm) steril bir kapak iğneleri kullanarak bir plaka üzerine toka. Önce Cilt Kuru steril gazlı bez pad ile temizleyin. Sonra deri % 70 etanol ile steril gazlı bez pad kullanarak temiz.</li>
	<li>Bir ayak planer kullanarak, Cilt bölüm üst tabakası (epidermis) kesin ve bir 9 cm Petri kabına yerleştirin. O zaman, hemen 25 mL (1.1 adımda hazırlanan) DPBS/tripsin/glukoz çözeltisi Petri kabına ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Bir pipet kullanarak DPBS/tripsin/glikoz çözüm Petri kabına kaldırın ve 10 mL RPMI-1640 + %2 FBS tripsin devre dışı bırakın ekleyin.</li>
	<li>İki forseps kullanarak, şimdi epidermal hücrelerin orta yavaşça kazıma ve epidermal ve deri bölümleri dermal bölmesinin Tantanacı serbest.</li>
	<li>Epidermal hücre süspansiyon bir metal filtre (1 mm delik boyutu) filtre ve bir 50 mL tüp içinde toplamak. RPMI-1640 FBS ve girdap olmadan 10 mL süspansiyon ile metal filtre epidermal hücre süspansiyon içeren bir 50 mL tüp içine 10 s. filtre içeren bir 50 mL tüp için geri kalan cilt bölümleri ekleyin. DPBS toplam hacmi 50 mL için ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon vasıl 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve epidermal hücre Pelet 37 ° C KSFM hücre Pelet boyutuna bağlı olarak yaklaşık 10 ml resuspend. Trypan boyama yöntemi mikroskop altında mavi kullanarak hücreleri saymak. Yaklaşık 50-100 x 106 hücre hücre bir 10 cm x 15 cm cilt bölümünden elde edilen sayıdır. Her 75 cm2 kültür şişesi için 8 x 106 hücreleri ile birlikte 37 ° C KSFM 12 mL aktarın. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeler sallamak.</li>
	<li>%100 nem oranı ve % 5 CO237 ° C kuluçka lenfositi kuluçkaya. Orta 2 gün ve üç kez haftalık sonra değiştirin. Geçiş hücreleri lenfositi proliferasyon oranını bağlı olarak yaklaşık 2 hafta sürer % 70-80 birleşmesi kültürdür.</li>
</ol>
2. passaging keratinositler
<ol>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 4.5 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi bir 75 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li>
	<li>Orta hücrelerden kaldırın ve 4.5 mL/75 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, hafifçe kalan hücreleri gevşetmek için el karşı kültür şişeye çarptı. Sonra tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 75 cm2 kültür şişesi için 6 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için transfer.</li>
	<li>Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 3 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. Hücreler için 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
	<ol>
		<li>KSFM (37 ° C) 10 mL pelleted hücrelerde resuspend. Hücreleri saymak ve 3 x 106 hücreler bir 150 cm2 kültür şişesi ile birlikte KSFM (37 ° C) 20 mL transfer. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeyi sallayın. Kültür bağlı olarak (bkz: Bölüm 3, iletişim kuralı aşağıdaki buz gibi) lenfositi nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yaklaşık 4-6 gün sürer % 80-90 birleşmesi olduğunda hücreleri dondur. Keratinositler uygun dondurulmuş hisse oluşturmak için genişletin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. lenfositi dondurulması
<ol>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 9 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi 150 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li>
	<li>Orta hücrelerden kaldırın ve 9 mL/150 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, yavaşça kültür şişeye el karşı kalan hücreleri gevşetmek için çarptı. O zaman, tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 150 cm2 kültür şişesi için 12 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için Aspire edin.</li>
	<li>Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 6 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. 450 x g 4 ° C'de 10 dakika için tüpler santrifüj kapasitesi Orta (KSFM + % 10 DMSO) soğuk buz gibi hücre hazırlayın.</li>
	<li>Hücre Pelet KSFM + % 10 DMSO resuspend, hücreleri saymak ve hücreleri bir yoğunluk olarak 6 x 106 hücre/mL standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri12kullanarak, Don.</li>
	<li>Keratinositler sıvı azot (Buhar fazı) kullanıma hazır kadar saklayın.</li>
</ol>
4. çözülme ve donmuş lenfositi kültür
<ol>
	<li>Hızla bir 37 ° C su banyosu uygun dondurulmuş şişeleri çözülme. % 70 etanol cryovial dışını temizlemek için kullanın. Hücreleri (yaklaşık 15.000 hücreler/cm2) uygun sayıda bir kültür şişesi aktarmak ve hemen kültür şişeye Önceden ısıtılmış büyüme orta (KSFM) ekleyin. Kültür şişeler herhangi bir boyut deneme kurulumuna bağlı olarak kullanılabilir.</li>
	<li>5 mL kültür orta bir 25 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li></ol>Hücre sayısı hücrelerinin büyümesini donör donör değiştiğinden kültür şişeye değişebilir eklendi. Hücreleri %100 nem oranı ve % 5 CO237 ° C kuluçka kuluçkaya.
	<li>Değişim orta 2 gün sonra ve üç kez haftalık taze Önceden ısıtılmış KSFM kullanarak. Not: Bizim veri ortalama burada açıklanan protokol tarafından izole hücreler % 95'i keratinosit-marker cytokeratine-1413için olumlu olduğunu gösterdi.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. Yazar hiçbir çıkar çatışması vardır.

Burada, kolayca yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi yalıtmak ve onları vitrokültür anlatan. Bu model epidermal hücre biyolojisi incelenmesi için geniş bir uygulama olabilir ve araştırmacılar Kutanöz hastalıkları okumak isteyen için yararlı olabilir.
Burada açıklanan protokol avantajları bir kısmı yeni doğan erkek sünnet geçiren elde yenidoğan sünnet derisi üzerinden izole lenfositi aksine yetişkin hastalarda birincil insan lenfositi hem erkek hem de kadın izole edilmiştir...

Deri insan vücudunun en büyük organı ve dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Deri iki ana katmandan oluşur: dermis ve epidermis nerede epidermis derinin en dış tabakası oluşturan,. Epidermisin en bol bulunan hücre türü hücre kitle1,%295'den fazla oluşan lenfositi değil. Keratinositler farklılaşma epidermisin içinde çeşitli aşamalarında korunur ve farklılaşma3belirli aşamalarında karşılık Bazal, spinöz, taneli ve cornified katmanlar halinde düzenlenir. Keratinositler birincil işlevi böylece dış dünyaya sağlam bir bariyer üreten epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır.
Keratinositler da deride patojenlere karşı savunma ilk satırı temsil eder ve bu nedenle doğuştan gelen bağışıklık yanıtı4,5' te önemli bir rol oynamaktadır. Keratinositler pozlama dış uyaranlara karşı harekete geçirmek için hücre içi sinyal yolları ve daha sonra üretim, sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptidler gibi çeşitli inflamatuar aracılar birkaç açar. Bu keratinosit kaynaklı proteinler alımı ve dendritik hücreler, nötrofil ve belirli T hücreleri6,7gibi bağışıklık hücreleri aktive tarafından inflamatuar yanıt olarak katılmak. Böylece, keratinositler çok sayıda biyolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak çünkü burada sunulan teknik arkasındaki mantığı deri Biyoloji çalışmaya bir vitro modeli oluşturmak için idi. Yenidoğan sünnet derisi elde edilen birincil keratinosit kültürler genellikle deri Biyoloji8,9incelemek için kullanılır. Ancak, burada açıklanan tekniği ile lenfositi üzerinden her iki cinsiyette hücreleri daha yüksek bir biyolojik çeşitlilik sonucu elde edilir.
Burada, yalıtım ve yetişkin deri, birincil insan lenfositi nesil için detaylı bir protokolü keratinositler dondurma ve bakım dahil olmak üzere mevcut. Bu yöntem genel amacı Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için bir model olarak kullanılan birincil insan lenfositi üretmektir.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>KSFM takviyeleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>için Takviyeler ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen DPBS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimetil sülfoksid</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Hücre kültürü ortamı katkı maddesi</td></tr><tr><td>Sterilizasyon filtresi</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Gözenek boyutu 0,2 ve mikro olan şırınga filtresi; m</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Hücreleri tripsnize etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td> Tripsin Forsepslerini <td>inaktive etmek için kullanılır</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Herhangi bir şirketten forseps kullanılabilir</td></tr><tr><td>Makas</td> <td>-</td><td></td> <td>Herhangi bir şirketten makas kullanılabilir</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Herhangi bir şirketten neşterler%</td></tr><tr><td>70 etanol</td> kullanılabilir <td>-</td><td></td><td>-</td></tr> <tr><td>Gazlı bez pedleri</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Herhangi bir sağlayıcıdan gazlı bez pedleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>Ayak planya Credo</td><td>Solingen</td><td>1510</td><td>Herhangi bir sağlayıcıdan ayak planya makinesi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Herhangi bir sağlayıcıdan Petri kapları kullanılabilir</td></tr><tr><td>Metal filtre</td> <td>-</td><td></td> <td>Ev içi 1 mm delik boyutu metal filtre</td></tr><tr><td>75 cm2 kültür şişeleri</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm2 kültür şişeleri</td><td>TTP</td><td>90151-0.05</td><td></td></tr>% <tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Geçerken hücreleri denemek için kullanılır</td></tr></tbody></table>

oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Keratinositler ana işlevi böylece dış dünya için mekanik bir engel Bakımı epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır. Buna ek olarak, keratinositler hızlı, spesifik olmayan şekilde antijenik uyaranlara yanıt doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir bölümü olarak başlatma, bakım ve düzenleme epidermal bağışıklık yanıtı, temel bir rol oynar. Burada, biz birincil insan lenfositi yetişkin deri, izolasyon için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bu hücreler farklılaşma işaret involucrin artan bir ifade göre ölçülen kalsiyum kaynaklı terminal farklılaşma yanıt göstermektedir. Buna ek olarak, izole lenfositi aktivasyonu p38 MAPK tarafından ölçülen duyarlı hücre içi sinyal yolları için IL-1β-indüklenen aktivasyonu olduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, yalıtım ve yetişkin cilt üzerinden birincil insan keratinositler, kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Lenfositi epidermis baskın hücre tipinde olduğu için bu moleküler mekanizmalar Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için yararlı bir yöntemdir.

Terminal farklılaşma kalsiyum kaynaklı İnsan lenfositi terminal farklılaşma üzerine kalsiyum14,15,16ile tedavi tabi. Birincil insan lenfositi izole ve yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi kültürlü. Ne zaman yaklaşık % 50-60 birleşmesi, hücreleri kalsiyum (1,2 mM) ile teşvik ya da araç ve hücreleri resimlerini 0, 1 ve 2 günde alınmıştır. Şekil 1 kalsiyum stimülasyon gözlenen l...

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model vardır

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro olarak deri biyolojisini incelemek için bir model olarak kullanılabilecek birincil insan keratinositlerini üretmektir. Bu yöntem, insan keratinosit farklılaşmasının nasıl düzenlendiği veya enflamatuar cilt hastalıklarını incelemek için bir model olarak epidermal hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, birincil insan keratinositlerinin geleneksel olarak hem erkeklerin hem de kadınların yetişkin cildinden izole edilebilmesi ve 18 yaşından büyük herhangi bir yaştaki insanlardan alınan cildi içerebilmesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Annette Blak Rasmussen olacak. Başlamak için, DPBS'de 50 mililitrelik% 0.25 tripsin ve% 0.1 glikoz çözeltisi hazırlayın. Ardından, çözeltiyi karıştırın ve filtreleyin, sterilize edin.10 mililitre RPMI 1640 artı% 2 FBS, 50 mililitre DPBS ve keratinosit serum içermeyen ortam veya KSFM hazırlayın. 500 mililitre KSFM'ye KSFM takviyeleri ve 250 mikrolitre gentamisin ekleyin. Ardından, kullanmadan önce çözeltileri 37 santigrat dereceye ısıtın.Plastik cerrahi geçiren sağlıklı yetişkin gönüllülerden 10 santimetreye 15 santimetre cilt örnekleri toplayın. Cilt örneklerini bir soğutma elemanı içeren bir strafor kutu içinde taşıyarak cildi serin tutun. Gerekirse, cilt örneğini gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.Sterilize edilmiş makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümünün altındaki yağları alın. Ardından, iğneler kullanarak, cilt bölümünü bir plakanın üzerindeki steril bir örtü üzerine bağlayın. Kuru, sterilize edilmiş bir gazlı bezle cildi temizleyin.Ardından, sterilize edilmiş bir gazlı bez üzerinde %70 etanol ile devam edin. Daha sonra, bir ayak planyası kullanarak, cilt bölümünün üst epidermal tabakasını kesin ve dokuz santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ardından, önceden hazırlanmış DPBS tripsin glikoz çözeltisinden hemen 25 mililitre Petri kabına ekleyin.Numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bir pipet kullanarak, DPBS tripsin glikoz çözeltisini Petri kabından çıkarın ve tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mililitre RPMI 1640 artı% 2 FBS ekleyin. Şimdi, iki forseps ile, cilt bölümlerinin hem epidermal hem de dermal bölmesini nazikçe kazıyarak ve çalkalayarak epidermal hücreleri ortama bırakın.Epidermal hücre süspansiyonunu metal bir filtreden süzün ve süzüntüyü 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Kalan cilt kısımlarını FBS olmadan 10 mililitre RPMI 1640 içeren 50 mililitrelik bir tüpe ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Bu süspansiyonu metal filtreden epidermal hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik bir tüpe süzün.Ardından, DPBS'yi toplam 50 mililitre hacme ekleyin. Hücre süspansiyonunu 450 kez G ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve hücre peletinin boyutuna bağlı olarak, epidermal hücre peletini yaklaşık 10 mililitre 37 santigrat derece KSFM'de yeniden süspanse edin.Tripan mavisi boyama yöntemini kullanarak, hücreleri mikroskop altında sayın. Daha sonra, her 75 santimetre karelik kültür şişesine, 12 mililitre 37 santigrat derece KSFM ile birlikte sekiz kez 10'u altıncı hücrelere aktarın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültür şişelerini hafifçe sallayın.Keratinositleri %100 nem ve %5 CO2 ile 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Ortamı iki gün sonra ve ardından haftada üç kez değiştirin. Hücreler% 70-80 birleşmeye ulaştığında, uygun miktarda% 0.05 tripsin EDTA çözeltisini bir inkübatörde 37 santigrat dereceye kadar tutun.Ortamı hücrelerden çıkarın ve hücrelere önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin EDTA çözeltisinin 75 santimetre kare kültür şişesi başına 4.5 mililitre ekleyin. Kültür şişesini 37 derece santigrat derece inkübatöre yaklaşık beş dakika yerleştirdikten sonra, hücrelerin gevşemeye başlayıp başlamadığını mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerin yaklaşık% 50'si gevşediğinde, kalan hücreleri gevşetmek için kültür şişesini elinize hafifçe vurun.Daha sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için, 75 santimetre karelik kültür şişesine altı mililitre 37 santigrat derece RPMI 1640 artı% 2 FBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik tüplere aktarın. Kültür şişelerini üç mililitre RPMI 1640 artı% 2 FBS ile durulayın ve ortamı 50 mililitrelik tüplere ekleyin. Daha sonra hücreleri 450 kez G ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin.Peletlenmiş hücreleri yeniden askıya almak için 10 mililitre 37 santigrat derece KSFM kullanın. Daha sonra, 20 mililitre 37 santigrat derece KSFM ile birlikte 150 santimetre karelik bir kültür şişesine 10 ila altıncı hücrelere üç kez sayın ve aktarın. Hücreleri inkübatöre geri göndermeden önce, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültür şişesini hafifçe sallayın.Kültür% 80-90 birleştiğinde, bu videoda daha önce gösterildiği gibi, hücreleri tripsinizledikten ve 50 mililitrelik tüplere aktardıktan sonra, kültür şişelerini altı mililitre RPMI 1640 artı% 2 FBS ile durulayın ve 50 mililitrelik tüplere ekleyin. Tüpleri 450 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, buz gibi soğuk hücre dondurma ortamı hazırlayın.Hücre peletini KSFM artı% 10 DMSO'da yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri saydıktan sonra, standart, yavaş dondurma kriyoprezervasyon yöntemlerini kullanarak mililitre başına altı çarpı 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda dondurun. Keratinositleri kullanıma hazır olana kadar sıvı nitrojen içinde saklayın.Burada görüldüğü gibi, insan keratinositleri bu videoda gösterildiği gibi izole edildi ve kültürlendi ve daha sonra Kalsiyum ile uyarıldı. Bu görüntüler, kontrollü tedavi edilen hücrelere kıyasla, birinci ve ikinci günlerde Kalsiyum ilavesine bağlı morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Morfolojik değişikliklere ek olarak, Kalsiyum ilavesi ayrıca farklılaşma belirteci Involucrin için mRNA'nın transkripsiyonunda, 24 saat sonra 5.5 kat ve 48 saat sonra 3.5 kat artışa neden oldu.Bu deneyde, kültürlenmiş keratinositler çeşitli süreler boyunca IL-1 beta ile uyarıldı. Western blotlamada görüldüğü gibi, beş dakika içinde, IL-1 beta stimülasyonu, p38 MAP kinaz toplam protein seviyeleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığından, p38 MAP kinazın hızlı bir aktivasyon fosforilasyonuna yol açtı. Bir saat sonra, IL-1 beta ile indüklenen p38 MAP kinaz fosforilasyonu bazal seviyelere geri döndü.Geliştirildikten sonra, bu teknik, insan epidermal hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, keratinositlerin doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinde ve cilt gelişimindeki rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro olarak deri biyolojisini incelemek için bir model olarak kullanılabilecek yetişkin insan derisinden birincil keratinositlerin nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Bu videoda, genetik olarak değiştirilmiş primer insan keratinositleri rekombinant retrovirüs üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, keratinositlerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılabilir.

Primer İnsan Keratinositlerinin Genetik Modifikasyonu: Rekombinant Retrovirüsler Kullanılarak Keratinositlerin Genetik Olarak Manipüle Edilmesi İçin Bir Yöntem

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu protokol, üç boyutlu yeniden oluşturulmuş insan epidermisini tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde yetiştirmek için basit bir yöntemi açıklar. Ek olarak, epidermal bariyer modelinin yapı-işlev ilişkisini karakterize eder. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin proinflamatuar uyaranlar üzerine biyolojik tepkileri de sunulmaktadır.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, canlı hücre görüntülemede kullanılmak üzere taze elde edilen (pasaj 0) keratinositlerin kültürünü ana hatlarıyla belirtir.

Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Öğrenin, yetişkin deriden birincil insan keratinositlerinin izolasyon yöntemini. Bu teknik, epidermal hücre biyolojisi ve inflamatuar deri hastalıklarının in vitro araştırmalarında güvenilir bir model sunar.

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Daha fazla video keşfet