Name: Makrofaj Fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Keşfedin, makrofaj füzyonunu incelemek için optik mikroskopi kullanarak kapak camını füzyojenik yüzeye dönüştürme yöntemini. Bu protokol, canlı görüntüleme ve süper çözünürlüklü mikroskopi için güvenilir bir temel sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ugarova laboratuvar ve Müfettişler Merkezi üyeleri metabolik ve vasküler Biyoloji için bu eser ilgili yararlı bilgiler için teşekkür etmek istiyorum. James Faust 2015 yılında Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı süper çözünürlük mikroskobu sahasında eğitmenler için minnettarlığını ifade istiyor. Satya Khuon LLSM için numune hazırlama konusunda yardım için Janelia teşekkür etmek istiyorum. Bir daha gözden geçirme ve bu eserin filme bölümleri sırasında James Faust T32 Bursu (5T32DK007569-28) tarafından desteklenmiştir. Bu eser kafes ışık sayfası bileşeni HHMI ve Betty ve Gordon Moore Vakfı tarafından desteklenmiştir. T.U. NIH tarafından finanse edilen HL63199 verin.

Hayvanlar kullanmak yordamları hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Mayo Clinic, Janelia araştırma kampüs ve Arizona State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. asit temizledim cam hazırlanması
Not: birçok üretici satın cam beklendiği gibi temiz olmayabilir. Rutin temizlik cam mikroskobu nerede dahil herhangi bir yordamı önce toplu halde göz önünde bulundurun.
<ol><li>Yüksek sıkılık cam satın. Doğru kalınlığı (mm) 0,15 veya 0,17 seçmek için özel dikkat. Not: Seçtiğiniz kapak cam kalınlığı bir mikroskop amaçta bağlıdır ve doğrudan objektif varil üzerinde listelenir.</li>
	<li>Kapak cam 12 M hidroklorik asit iyi havalandırılmış kimyasal duman başlıklı sonication (42 kHz, 70 W) ile 1 h için kuluçkaya. Taze 12 M HCl ile iki ek kez için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Ayrı bir ölçek ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.</li>
	<li>30 dk ile sonication için iyi havalandırılan bir kimyasal başlıklı saf aseton kapak cam kuluçkaya. Bu adım için iki ek kere tekrar edin.</li>
	<li>Ayrı bir ölçek steril ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.</li>
	<li>% 100 etil alkol 30 dk ile sonication için kimyasal başlıklı kapak cam kuluçkaya. Bu iki ek kez tekrarlayın. Not: Etil alkol saflığı önemlidir. Kirletici maddeleri çözünmüş katı şeklinde cama kuruyacak ve makrofaj füzyon yükseltebilirsiniz.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için saf etil alkol ile dolu bir kap içinde asit temizledim cam yerleştirin. Alternatif olarak, azot gazı ve bir vakum desiccator mağaza ile kapak cam kuru.</li>
</ol>2. Fusogenic optik kaliteli yüzeylerin hazırlanması
<ol><li>DMSO ücretsiz dağıtılması yüksek erime noktası parafin balmumu ultrasaf toluen içinde. Not: Stok konsantrasyonları 10 mg/mL yapılır ve sulandırılmış 1:9 ultrasaf toluen çalışma çözüm 1 mg/mL yapmak vardır. Dikkat: Toluen dikkatli bir teratogen ele alınmalıdır. Toluen kurumsal kimyasal hijyen plana uygun bir biçimde atın.</li>
	<li>Çözüm bir kuru asit temizledim cam için cam yüzeyine eşit olarak kapsayan bir ses seviyesinde çalışıyor parafin uygulanır. Aşırı çözüm dikkatle boşaltmak ve cam ile azot gaz ya da hava kuru. Toplu hazırlık için kapak cam karşılamak için tasarlanmış bir Coplin kavanoz kullanın.</li>
	<li>X ekseninde 3 vuruş ve sonraki 3 vuruş y eksenindeki hav bırakmayan bir bezle Kapak cam Lehçe ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Hemen deney önce steril ultrasaf su ile kapak Cam Yıkama ve daha sonra için 15-30 dakika bir biyolojik Emanet başlıklı ultraviyole ışık ile sterilize. Alternatif olarak, kapak cam etilen oksit veya gama ışınlama tarafından sterilize.</li>
</ol>3. Micropatterning hidrokarbon içeren bileşikler Fusion sınırlamak için önceden belirlenmiş bölgeleri
<ol><li>Kuru asit temizledim cam ve cam düz bir yüzey üzerine immobilize.</li>
	<li>Forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde hidrokarbon compound(s) çalışan bir çözüm bir altın transmisyon elektron mikroskobu Bulucu kılavuzda bırakın. Denemenin sonu hedefi karşılayan bir hidrokarbon bileşik seçin (bkz. Tablo 1). Izgara filtre kağıdı üzerine hafifçe dokunarak uzak aşırı çözüm fitil ve hemen ızgara kapağı cam ortasına yerleştirin. Sonraki adıma geçmeden önce 2 dk kurumaya toluen izin.</li>
	<li>Kılavuz için cam hafifçe cam ters çevirme tarafından bağlanmış emin olun. Eğer kılavuz yeni bir cam kullanarak 3.2 adımı yineleyin ayırır. Not: bir plazma temizleyici kullanılabilir değilse, adım 3.4 atlayın.</li>
	<li>Plazma tarafından tedavi vakum gaz plazma ile kapak cam temiz. Bilginize: Bulucu kılavuz ile uzun zincirli hidrokarbon plazma üzerinden adsorbe temel yüzey korumak için bir maske olarak işlem görür. Tabloya göre korumasız bölgeleri sigara fusogenic plazma maruz tarafından işlenir. Plazma için maruz kapak camdır süreyi ampirik olarak tespit edilmelidir.</li>
	<li>İnce uçlu forseps kullanarak, micropattern ortaya çıkarmak için cam yüzeyden kılavuz dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
</ol>4. cam alt yemekleri imalatı
<ol><li>35-mm plastik Petri kabına bir adım matkap kullanarak alt 6-10 mm dairesel delik matkap. Not: Pürüzsüz kenarlar oluşturmak için adım matkap kullanmak önemlidir. Kenarları çok sert ise, cam yemek altına düz bağ değil. Imperfectly düz yüzeyler mikroskobu zorlaştırabilir.</li>
	<li>Dikkatle karışımı ve degas silikon elastomer göre üretici yönergelerine (Yani, polydimethylsiloxane; PDMS).</li>
	<li>Elastomer sadece kenarına yakın ince bir kaplama uygulamak (Yani, kısıtlamaya) delik. Not: Elastomer delik çevreleyen sürekli ince de olsa bir grup olarak görünmesi gerekir.</li>
	<li>Yavaşça (2 bölümünde açıklanan) fusogenic cam veya kuru asit temiz kapak (1 bölümünde açıklanan) cam yemek için elastomer tarafından çevrili deliği için geçerlidir. Cam çanak alt ile aynı hizada görüntülenir ve cam önemli bir kısmını temas plastiktir delik çapi genişletir emin olun. Elastomer 50 ° c 2-3 h için pişirme tarafından tedavi.</li>
	<li>Fusogenic cam tercih edilirse, UV standart protokolleri göre yemek ve kültür hücreleri sterilize et. Bir micropattern tercih edilir, ancak, micropattern hazırlık için adım 3.2 devam edin (micropatterning sırasında kullanılan gaz plazma çanak sterilizes ve şiddetle PDMS loşluğa çiftler).</li>
</ol>5. Thioglycollate elde edildi makrofajlar toplama
<ol><li>8-hafta-yaşlı C57BL/6 fare ile 0.5 mL % 4 Brewer'ın thioglycollate steril bir çözüm olarak yukarıda açıklanan3,4,6enjekte et.</li>
	<li>Yetmiş iki saat sonra hayvan göre onaylanmış hayvan bakımı ötenazi ve yönergeleri kullanın ve makrofajlar tarafından peritoneal lavaj buz gibi fosfat tamponlu tuz 5 mM ethylenediaminetetraacetate ile takviye ile toplamak.</li>
	<li>Makrofajlar vasıl 300 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve 15 mM, HEPES, takıma DMEM:F12 1 ml resuspend %10 FBS ve % 1 antibiyotik (kültür orta). Not: Hücreleri daha sonra Neubauer hemasitometre ile dikkate alınır. Makrofajlar için uygun toplama seyreltilmiş ve yüzeylere uygulanır. Hücreleri belirli bir yüzeye uygulamak için dikkatle deneysel soru amacıyla araştırmacı tarafından kabul edilmelidir. Birincil edebiyatında bilinen standartlarına başvurun.</li>
	<li>30 dakika sonra yüzeyler yapışık olmayan hücre kaldırma ve taze kültür orta yerine % 0,1 BSA ile takıma HBSS yıkayın. Kültürler İnkübatör (%5 CO2 37 ° C'de havada) dönün.</li>
	<li>2 h sonra orta Aspire edin ve kültür 10 ng/mL ile Il-4 takıma orta yerine. Hücreleri başka bir yerde4açıklandığı gibi görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes%2Fmacrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).</li>
<li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mediators+of+macrophage+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li>
<li>Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4973655/">The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion.</a> Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).</li>
<li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion%3A+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylsilane-modified+surfaces%3A+Inhibition+of+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation.</a> J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).</li>
<li>Vignery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+fuse+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Fusion%3A+Overviews+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to fuse macrophages in vitro.</a> Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign-body+giant+cells+and+polyurethane+biostability%3A+In+vivo+correlation+of+cell+adhesion+and+surface+cracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking.</a> J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).</li>
<li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+reaction+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li>
<li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-coupled+polyethylene+oxide+on+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).</li>
<li>DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+and+surface+chemistry+control+of+monocyte%2Fmacrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+by+photochemically+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces.</a> J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).</li>
<li>Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocyte%2Fmacrophage+adhesion%2C+macrophage+motility%2C+and+IL-4-induced+foreign+body+giant+cell+formation+on+silane-modified+surfaces+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Fölling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+method+for+molecular+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Proposed method for molecular optical imaging.</a> Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Belirlemek ve daha sonra makrofaj füzyon teşvik kaliteli optik cam yüzeyler geliştirmek gerek kaynaklandığını son Hayır yayınlanan çalışma doğrudan kadar yaşam içinde belgili tanımlık bağlam makrofaj füzyon görselleştirildiği aslında örnekler3, 4. Yaygın olarak kullanılan fusogenic plastik yüzeyler LWD hedefleri gerektirir ve faz kontrast optik için büyük ölçüde sınırlı nedeniyle gerçeğini bu. Bu engellerin sadece makrofaj füzyon olağanüstü oranda terfi, ama şaş...

MGCs oluşumu kronik inflamasyon1tarafından seçkin insan vücudunda patolojik devletlerin bir dizi eşlik eder. İltihap makrofajlar forma MGCs2sigorta sözleşmesi rağmen şaşırtıcı birkaç çalışmalar yaşam ile bağlamda füzyon göstermiştir örnekler3,4. Bunun nedeni çoğu görüntüleme teknikleri için gerekli olan temiz cam yüzeyler inflamatuar sitokinlerin5tarafından indüklenen zaman makrofaj füzyon teşvik yok. Gerçekten de, temiz cam bir substrat makrofaj füzyon için sonra düşük orta büyütme hedefleri (Yani, 10-20 X) ve daha 15 h sürekli kullanılırsa görüntüleme kez bir tek füzyon olayı gözlemlemek için gereklidir.
Diğer el, fusogenic plastik yüzey (örneğin, permanox) veya bakteriyolojik sınıf plastik fusion2teşvik. Ancak, çünkü belgili tanımlık substrate kalın ve ışık scatters görüntüleme plastik aracılığıyla problemlidir. Bu kadar çalışma mesafesi (LWD) hedefleri gerekli olduğundan Imaging karıştırıyor. Ancak, LWD hedefler genellikle düşük ışık coverslip-düzeltilmiş karşılık gelen göre kapasite toplama var. Ayrıca, plastik birefringent bu yana değişiklikleri fark girişim kontrast gibi numune geçen ışık polarizasyonu yararlanma teknikleri imkansız. Engelleri plastik kullanımı ile ilgili daha fazla makrofaj füzyon/MGC formasyonu yüzeyde gerçekleşeceği tahmin etmek mümkün değildir aslında tarafından vurguladı. Birlikte, bu sınırlamalar faz kontrast optik, toplam görüntüleme süreleri genişletilmiş makrofaj fusion görselleştirme kısıtlamak (> 15 sürekli saat) ve düşük çözünürlüklü.
Son zamanlarda bir çok fusogenic cam yüzey tek molekül süper çözünürlük mikroskobu ile sabit makrofajlar/MGCs4yürütürken tespit. Bu gözlem yapıldı çünkü şaşırtıcı temiz cam yüzeyler füzyon de çok düşük oranda teşvik ~ %5 İnterlökin-4 (Il-4) füzyon tarafından belirlenen huzurunda 24 saat sonra dizin4. Füzyon tanıtmak için kapasite oleamide kirlilik nedeniyle olduğunu ortaya koymuştur. Adsorpsiyon oleamide veya benzer şekilde uzun zincirli hidrokarbon bulunan diğer bileşikler cam fusogenic yaptı. Çoğu fusogenic bileşik (parafin balmumu) micropatterned yapıldı ve makrofaj fusion ve permanox için karşılaştırıldığında zaman aynı miktarda içinde gözlenen füzyon olayların sayısını logosuna 2 kat artış kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek düzeyde öğretilir. Bu optik kalitesi yüzeyler ilk bakışta Morfolojik özellikleri ve yaşam numuneler MGCs oluşumunda yöneten Kinetik tarafından sağlanan.
Bu protokol için MGCs oluşumu yaşam örnekler üzerinden izlemek için kullanılan cam yüzeyler çeşitli imalatı açıklar. Buna ek olarak, biz bu yüzeyler uzakta-tarla süper çözümleme teknikleri için mükellef olduğunu göstermektedir. Yüzey imalat denemenin amacı bağlıdır ve her yüzeyi ile ilgili örnekler devam etmeden metinde anlatılan.

<table><tbody><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PCD-32G</td><td></td></tr><tr><td>Bulucu ızgara</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>G400F1-Au</td><td>herhangi bir altın TEM ızgarası işe yarayacak</td></tr><tr><td>Kapak camı (22x22 mm)</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>yalnızca yüksek sıkılığa sahip kapak camı kullanın</td></tr><tr><td>Parafin mumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17310</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16415</td><td>ikame edilirse &alfa;-tokoferol içermemelidir</td></tr><tr><td>Oleamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O2136</td><td>taze</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>hazırlayın Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>VWR International</td><td>BDH1101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>15050</td><td>düşük çözünmüş kullanın katılar etanol</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212</td><td>asit yıkama kapak camı</td></tr><tr><td>Slyguard 184</td><td>VWR International</td><td>102092-312</td><td>1:10 oranında karıştırın ve 50 ° C'de sertleştirin; 4 saat 35</td></tr><tr><td>mm petri kabı</td> için C <td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-351864</td><td></td></tr><tr><td>Dumont no. 5 forseps</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>72705</td><td>bölüm 3.5'teki TEM ızgarasını çıkarmak için ideal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Corning</td><td>10-092</td>, <td>15 mM HEPES</td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td> içerir</tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576</td>, <td>yapışmayan makrofajları yıkamak için HBSS'de% 0.1'de kullanın</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Genscript</td><td>Z02996</td><td>alikot 10 & mu'da; g / mL ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td>sabit numuneler veya kontrast madde gerektirmeyen teknikler için kullanım</td></tr><tr><td>eGFP-LifeAct fareler</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>canlı floresan görüntüleme için kullanım</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark&nbsp;</td><td>34155</td><td>Hidrokarbon adsorbe edilmiş yüzeyleri parlatmak için kullanın</td></tr></tbody></table>

makrofaj fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Multinucleated dev hücreler (MGCs) oluşumunu yaşam örnekler görüntülenmesi en canlı görüntüleme teknikleri cam aracılığıyla ışık yayılmasını gerektirir, ancak camına makrofaj füzyon nadir bir olaydır nedeniyle aslında bu zor oldu. Bu iletişim kuralı birkaç kaliteli optik cam yüzeyler imalatı nerede adsorpsiyon uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşiklerin fusogenic yüzey içine cam dönüşümleri sunar. İlk olarak, hazırlık temiz cam yüzeylerin yüzey modifikasyonu için malzeme başlangıç olarak tanımlanır. İkincisi, bir yöntem adsorpsiyon sigara fusogenic cam fusogenic substrat dönüştürmek için uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler için sağlanmıştır. Üçüncü olarak, bu iletişim kuralını MGC oluşumu üzerinde kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek derecede teşvik yüzey micropatterns imalatı açıklar. Son olarak, cam alt yemekleri imalatı açıklanmıştır. Makrofaj füzyon ve MGC oluşumu için bir model olarak bu vitro hücre sisteminin kullanım örnekleri gösterilir.

Malzemelerin fizikokimyasal parametreler makrofaj fusion7,8,9,10ölçüde üzerinde dramatik etkileri var. Ayrıca, yüzey kirletici makrofaj füzyon11teşvik bilinmektedir. Bu nedenle, bir negatif kontrol makrofaj fusion için önemli ile başlamak temiz cam gibi. Adsorpsiyon yüzey parlatma tarafından takip uzun zincirli hidrokarbonların nanotopogr...

Bu iletişim kuralı, makrofaj füzyon yaşam örneklerin izlemek için kullanılan ve süper çözünürlük mikroskobu sabit örneklerin sağlayan uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler ile adsorbe kaliteli optik cam yüzeyler imalatı açıklar .

Makrofaj Fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Bu protokolün genel amacı, fsorojenik olmayan örtü camını, herhangi bir optik mikroskopi kullanarak makrofaj füzyonunu incelemek için kullanılabilecek fusojenik bir yüzeye dönüştürmektir. Bu yöntem, makrofaj füzyonunun moleküler mekanizması ile ilgili temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajı, makrofaj füzyonunu incelemek için herhangi bir mikroskop tekniğinin, özellikle canlı görüntülemenin kullanılabilmesidir.Prosedürü gösterenler, üçüncü bursiyer James Faust ve laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Arnat Balabiyev olacak. Başlamak için, iyi havalandırılan bir kimyasal davlumbazda, 12 molar hidroklorik asitte yüksek sıkılığa sahip kapak camını bir saat boyunca sonikasyon ile inkübe edin. Taze 12 molar HCL ile adımı iki kez daha tekrarlayın.Ayrı bir kabı ultra saf suyla doldurun ve kapak camını ekleyin. Ardından kapak camını beş ila 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, kapak camını sonikasyon ile 30 dakika boyunca saf asetonda inkübe edin.Adımı iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra ayrı bir kabı steril ultra saf suyla doldurun ve kapak camını ekleyin. Kapak camını beş ila 10 dakika boyunca sonikleştirin.Kapak camını sonikasyon ile 30 dakika boyunca% 100 etil alkolde inkübe edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Uzun süreli saklama için, asitle temizlenmiş kapak camını saf etil alkol ile doldurulmuş bir kaba koyun.Alternatif olarak, kapak camını nitrojen gazı ile kurutun ve vakumlu bir desikatörde saklayın. DMSO içermeyen yüksek erime noktalı parafin mumunu ultra saf toluen içinde çözün. Bir cam pipet kullanarak, cam yüzeyini eşit şekilde kaplamak için kuru asitle temizlenmiş bir kapak camına yeterli miktarda parafin çalışma solüsyonu uygulayın.Fazla çözeltiyi boşaltın ve nitrojen gazı veya hava ile kapak camını kurutun. Tüy bırakmayan bir silme ile, X ekseni boyunca üç vuruş ve ardından Y ekseni boyunca üç vuruş kullanarak kapak camını parlatın. Deney yapılmadan hemen önce, kapak camını yıkamak için steril ultra saf su kullanın ve ardından 15 ila 30 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik başlığında ultraviyole ışıkla sterilize edin.Asitle temizlenmiş kapak camını kurutun ve camı düz bir yüzey üzerinde hareketsiz hale getirin. Forseps kullanarak, bir altın transmisyon elektron mikroskobu bulucu ızgarasını bir hidrokarbon bileşiğinin çalışma çözeltisine dikkatlice daldırın. Izgarayı filtre kağıdına hafifçe vurarak fazla çözeltiyi fitilleyin, ardından ızgarayı hemen kapak camının ortasına yerleştirin.Toluenin iki dakika kurumasını bekleyin. Camı nazikçe ters çevirerek ızgaranın cama yapıştığından emin olun. Izgara ayrılırsa, asitle yıkanmış yeni bir kapak camı kullanarak yapıştırmayı tekrarlayın.TEM ızgarasını çıkardıktan sonra, düşük büyütme ile mikro desenin sürekliliğini inceleyin. Mikro desen sürekli görünmeli, ancak malzeme desenin kenarlarının dışına taşmamalıdır. Ardından, kapak camını metin protokolüne göre temizlemek için vakumlu gaz plazmalı bir plazma temizleyici kullanın.Ardından, ince uçlu forseps kullanarak, mikro deseni ortaya çıkarmak için ızgarayı cam yüzeyden dikkatlice çıkarın. Kademeli matkap ucuyla, 35 milimetrelik plastik bir petri kabının dibinde pürüzsüz kenarları olan altı ila 10 milimetrelik dairesel bir delik açın. Silikon elastomeri üreticinin talimatlarına göre dikkatlice karıştırın ve gazını alın.Petri kabındaki deliğin kenarına hemen yakın ince bir elastomer kaplama uygulayın. Elastomer, deliği çevreleyen sürekli ince bir bant olarak görünmelidir. Elastomer ile çevrili deliği kapatmak için tabağa fosisojenik veya kuru asitle temizlenmiş kapak camını nazikçe uygulayın.Kapak camının tabağın alt kısmıyla aynı hizada göründüğünden ve camın önemli bir kısmı plastikle temas edecek şekilde deliğin çapının ötesine uzandığından emin olun. Elastomeri 50 santigrat derecede iki ila üç saat pişirerek sertleştirin. Sekiz haftalık C57 siyah-6 farelere, metin protokolünde belirtildiği gibi 0.5 mililitre steril bir %4 Brewer Tiyoglikolat çözeltisi enjekte edin.72 saat sonra, onaylanmış hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına göre hayvana ötenazi yaptıktan sonra, beş milimolar EDTA ile desteklenmiş buz gibi soğuk PBS kullanarak interperitoneal lavaj ile makrofaj toplayın. Makrofajları üç dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve hücre peletini 15 milimolar yığınlar% 10 FBS ve% 1 antibiyotiklerle desteklenmiş bir mililitre DMEM / F-12 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri saydıktan ve seyrelttikten ve 30 dakika boyunca yüzeylere uyguladıktan sonra, yüzeyleri yıkamak için HBSS% 0.1 BSA kullanın ve kültür ortamını değiştirin.Sonra kültürleri inkübatöre geri koyun. İki saat sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri görüntülemeden önce mililitre IL4 başına 10 nanogram ile takviye edilmiş kültür ortamı ile değiştirin. Bu videoda anlatıldığı gibi temizlendiğinde, kapak camı son derece düzdür ve belirgin bir yüzey özelliği yoktur; oysa uzun zincirli hidrokarbonların emilmesi ve ardından yüzey parlatma, burada görülen bir dereceye kadar nanotopografya oluşturur.Temiz kapak camı yüzeylerde makrofajlar çok düşük bir oranda kaynaşır. Buna karşılık, IL4 varlığında 24 saat sonra, uzun zincirli hidrokarbonlar içeren bileşiklerle adsorbe edilen yüzeylere uygulanan makrofajlar sağlam füzyona uğrar. Ayrıca, tek başına çözücünün emilmesi camı füsojenik bir yüzey yapmaz.Burada, çözünürlükteki potansiyel farklılıkları kantitatif olarak değerlendirmek için ışık mikroskobunun kırınım sınırından daha küçük yapıların yarı maksimumunda tam genişlik veya FWHM kullanılır. Daha da önemlisi, çeşitli yüzeyler arasında 100 nanometre floresan boncukların FWHM'sinde belirgin bir fark yoktur, bu da floresan görüntüleme için gerekli olan camın özelliklerinin yeterince korunduğunu düşündürmektedir. Bu deneyde makrofajlar uzun zincirli hidrokarbonlar içeren yüzeylere uygulanmıştır.Daha sonra 3D Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi gerçekleştirildi. Bu videolar, makrofajlar yüzeylere uygulandığında çeşitli canlı görüntüleme tekniklerinin mümkün olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yüzeyi fosisojenik hale getirmek için camı değiştirmek, uygun şekilde yapılırsa yarım saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, dikkatli bir şekilde takip etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, moleküle özgü kontrast ile füzyon görünümleri elde etmek için floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu, füzyon sırasında doğrudan yer alan proteinleri tanımlamak için tasarlanmış deneyleri mümkün kılacaktır.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların makrofaj füzyonunun zaman çözümlü görüşlerini elde etmelerinin yolunu açtı. Gelecekte, bu makrofaj füzyonunun mekanizmasını daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, makrofaj füzyonunu incelemek için kapak camını değiştirebilmelisiniz.Asit ve toluen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman KKD ve uygun havalandırma kullanılması gerektiğini lütfen unutmayın.

fabricating-optical-quality-glass-surfaces-to-study-macrophage-fusion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Bu videoda, bağımsız makrofaj aracılı kırmızı kan hücresi (RBC) fagositoz olaylarını izlemek için yapılan bir test gösterilmektedir. Fare immünoglobulin G (IgG) ile opsonize edilmiş insan RBC'leri fare makrofajları ile inkübe edilir ve konfokal mikroskop altında gözlenir. RBC'ler, fagositik bir kap oluşumu yoluyla makrofajlar tarafından yutulur ve lizozomal bozunma için hedeflenir.

IgG-opsonize Kırmızı Kan Hücrelerinin Makrofaj Fagositozunun Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

Bu protokol, 3D lazer baskı kullanılarak implante edilebilir bir entegre görüntüleme penceresinin imalatını açıklar. Pencere, mikro iskelelerle birleştirilmiş bir mikro mercek sisteminden oluşur. Yöntem, biyouyumlu fotorezist SZ2080'in sürekli bir sırayla iki fotonlu polimerizasyonunu (2PP) içerir ve üretim verimliliğini ve farklı bileşenler arasındaki hizalamayı optimize eder.

Gelişmiş In Vivo Görüntüleme için Mikroyapılı Görüntüleme Penceresine Entegre Edilmiş İmplante Edilebilir Optiklerin Mikrofabrikasyonu

Cam yünü filtreler dünyada araştırma gruplarının bir dizi su bazlı virüsler kullanılır konsantre edilmiştir. Burada cam yünü filtreleri oluşturmak için basit bir yaklaşım göstermek ve filtreleri de su kaynaklı viral, bakteriyel ve parazitik patojenlerde konsantre etkilidir göstermektedir.

Konsantre Su Bazlı Virüsler ve Tarım Zoonotik Patojenler için Cam Yünü Filtreler

Keşfedin, makrofaj füzyonunu incelemek için optik mikroskopi kullanarak kapak camını füzyojenik yüzeye dönüştürme yöntemini. Bu protokol, canlı görüntüleme ve süper çözünürlüklü mikroskopi için güvenilir bir temel sağlar.

Makrofaj Fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler

Daha fazla video keşfet