Name: İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerini kullanarak serebellar hücre soylarını 2D veya 3D ortamlarda üretmek için basit bir farklılaşma protokolü. Bu yöntem, çocukluk çağı beyin bozukluklarının hastadan türetilmiş kök hücrelerle incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gerbren Jacobs ve Jurjen Broeke için onların uzman teknik destek, Prisca üretimi ve karakterizasyonu iki kontrol IPSC şeritleri ve Lisa Gasparotto için prosedürlerimiz gösteren için katkıda bulunmak için Leferink için sana şükrediyoruz.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).</li>
<li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li>
<li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. <a target="_blank" href="https://elsevier.ca/product.jsp?isbn=9780323352147">Fetal and Neonatal Physiology</a>. , 5th ed, (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Karmaşıklığı ve maliyeti seçerek veya farklılaşma protokoller geliştirme kök hücre araştırmacılar için ilgili faktörlerdir. Ne kadar dış denetim istediğiniz hücre tipleri, üretmek için gerekli olan bir açık soru olduğu gibi bu özellikle doğrudur ya da — farklı poz için — yetkili hPSCs kendi gelişim ortamı üreten kendilerini yeterli ile bırakılırsa ne kadar besin. Extrinsic etkenler vitro getirilmesi çok iyi istediğiniz hücre ürünleri üretmek, ama onlar da engelleyebilir içsel gelişim kapasiteleri ile hücre içinde vivosergiledik. Böyle konuları, özellikle eğer amaç hastalığı modelleme için hasta kaynaklı iPSCs kullanılması önemlidir. Yoğun kullanımı desenlendirme ve/veya büyüme faktörleri, hastalık fenotipleri maske. Bu raporda detaylı protokollerin karmaşıklığı, maliyet ve/veya dışsal desenlendirme faktörler8,9kullanımını azaltmak için önceki çalışmalarda trendi takip.
Muguruma vd., ya da bizim kendi yeni çalışma tarafından bildirilen sonuçlara dayanarak, göründüğü gibi daha önceki çalışmalar yaptık farklılaşma serebellar kader in vivo koşullarda, çoğaltmak uyumlu çabaları olmadan doğru ulaşmak mümkündür 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. en ilgi çekici kısmı iki çalışma farklı büyüme faktörleri, hem de FGF2 kullanılabilir olsa da ben de kümesi gerekli, düşündüren bir kümesi kullanılır. Biz nerede FGFs seçerek iletişim kuralından hariç ve hücreleri dışsal FGFs10olmadan aynı ürünler üretme yeteneğine sahip olduğunu gösterdi ek testler yaptım. Çalışmalarımız arasındaki farklar gerçeği biz, farklı hPSC hatları ve kültür yöntemleri kullanılan sinir farklılaşma RA ile indüklenen ve granül hücre hayatta kalma ve olgunlaşma (BDNF, GDNF, SARKMA ve KCL) desteklemek için bileşenleri dahil tarafından nitelikli11 -14. Buna ek olarak, için Muguruma vd., kıyasla daha az karmaşık bir başlangıç yöntemini istihdam edildi. Onları fiziksel ve kimyasal olarak birbirinden izole 96WPs üniforma EBs oluşturarak onların Protokolü başladı. İletişim kuralı tüm PSC'ler nispeten birlikte 6WPs içinde onları serbestçe etkileşimine izin EB oluşumu sırasında kalabalık vardı. Nasıl Bu differentially EBs ve daha sonra organoids (bileşikleri sinyal içsel üretim de dahil olmak üzere) fiziksel ve kimyasal ortamının etkilemiş olabilir bilinmeyen ve keşfedilmeyi. Biz ifade gösterirken aynı zamanda, genler ile ilişkili — ve çok düşündüren — serebellar kökeni, morfolojik benzer yapıları içinde yer alan rapor tarafından Muguruma vd., biz cant hariç nesil nöronal benzeri yapıları serebellar kimliği vardır. Gelecekteki çalışmaları, antikorlar bu gibi büyük bir panelini kullanarak Muguruma vd tarafından bildirilen (Yani, ATOH1, CALB, vb) bu tür atamaları ve her iki iletişim kurallarını, daha kesin ürünleri arasında karşılaştırma yapar.
3D iletişim kuralına ile başlamak önemlidir ve hücre kültürü son ürün analiz için yeterli sayıda sağlamak için yeterli sayıda korumak. Önemli die-off erken protokolünde göz önüne alındığında, EBs/iyi sırasında kültür (şekil 1) ilk 3 günde fazla 500 ile başlayan öneririz. Bu hPSCs besleyici-Alerjik kültür için verilen koloni boyutları elde etmek zor olmamalı ama hala besleyici bağımlı yöntemleri kullanarak bu kadar kolay olmayabilir. Hücreleri çok sayıda göz önüne alındığında, bu renk değişikliği (pH değişiklikleri gösteren) orta ve ölü hücreleri birikimi izlemek önemlidir. Her ikisi de kültür çöküşü önlemek için düzeltilmiş olması gerekir. Ayrıca olabilir hücreleri ve toplamları topaklanma büyük yapılar. Her ne kadar hala çözümlenebilir toplamları neden olabilir, böylece onları daha küçük toplamları ile nazik toz içine ayrılıyor yararlı olabilir ürün miktarı büyük ölçüde, azalacaktır. Ancak, rahatsız edici normal agrega, kaçının hangi kendilerini büyüyebilir büyük boyutlarda (şekil 4). Toplamları çok seyrek olur, böylece toplamları tamamen izole değildir kuyu birleştirmek için önerilir. Ürün arasındaki değişkenlik (sayısı, boyutu ve Morfoloji) 3D hücre kültürü, düşündüren izole, tek EB oluşumu adımları ile daha az karmaşık bir başlatma yordamını (burada açıklanan Protokolü gibi başlayan bu protokoller için de dahil olmak üzere iyi bilinen bir sorundur ) daha pratik8,15olabilir. Bu heterojenlik araştırmacılar, özellikle analizi sırasında unutmayın gereken bir şey ise bildirilen Protokolü ürünleri diğer 3D protokolleri8,9,15' te bulunanlar ile tutarlı oluşturulan. Boyutu ve Morfoloji dayalı, sinirsel rozet aralığı içinde beyin organoid için küresel sınıflandırılması uygun en Kelava ve Lancaster15tarafından son incelemede açıklandığı gibi düşerler. Özellikle dikkate değer, 3D yapılar varlığını düşündüren lümen, (alt) ventrikül bölgeleri ve rhombic-rını özellikleri gibi sinirsel rozet (şekil 5 ve şekil 6) tarafından tanımlandığı gibi diğer grupları8 , 15 , 16 , 17. her deney en az bir üretilen bu yana toplam sözde VZ/SVZs ve serebellar ilişkili işaretçileri (ZIC1, KIRREL2), RL benzeri ile bizim iletişim kuralını kullanarak 3D ayırt etme başarısını belirlemek yararlı ölçütleri Bunlar ek destek sağlayan özellikler. Kültür uzunluğu 35 gündür uzanan test değil ama büyüme, karmaşıklık ve olgunluk bu tekniği ile izin verilen azami ölçüde belirlemek için takip.
2D protokolü aynı yapışık olmayan EB oluşumu ve sinirsel indüksiyon işlemi 3D iletişim kuralı olarak kullanır ve bu nedenle belgili tanımlık yorum yukarıda da geçerli. Bir kez kaplama, dikkat edilmesi gereken noktalar farklı bir dizi düşünülmelidir. EBs hızlı bir şekilde dışa tabağa çoğalırlar hücreler için uygun olmalıdır. Bağlılık, RI, (zaten kullanılıyorsa) eklenmesi ile ilgili sorunlar orta hacmi azaltılmış veya PLO/LAM konsantrasyon deneysel yapılan değişiklikler geçerli varsa. Hücre büyümesini çok yoğun ya da seyrek (tercihen 20-%80 confluency arasında Yetişkin) tutmak önemlidir Wells; günlük izleme ve zamanında passaging bitti-confluency ya da yüzen hücreleri önlemek önemli. 3D Protokolü olmamalıdır önemli die-off kültür sırasında olabilir rağmen zavallı gelişim alanları veya bir nükleer silahların yayılmasına karşı oranları yavaşlama. Passaging hücreleri (örneğin, hücre oluşum ve Gelişmiş ağ hücreleri arasında kaldırma) olgunlaşma durumunu etkiler ve nerede hücreleri toplanan veya bir şekilde analiz Puan yaklaşırken göz önünde tutulmalıdır. Örneğin, kalsiyum için bu düşsel analiz önce 2-6 gün arasında geçiş hücrelere önemlidir. Yakın passaging analiz hücreleri bağlamak için zamanım olmadı ve/veya olgun ve çok uzak aşırı kalabalık, görüntüleme zorlaştırır hücrelerde neden olabilir anlamına gelebilir. Deneyler arasında değişkenlik var olabilir rağmen ilk 2D serebellar protokolleri1,2' bildirdi tutarlı sonuçlarıdır. ICC boyama ve gen ifade analizi de diğer sinir ve serebellar kimlikleri ile (Şekil 7 ve şekil 8) ilişkili işaretçileri belirlenmesi sırasında hücreleri için granül hücre işaretçisi ZIC1, pozitif varlığını doğrulamaktadır. Fluor5 boya ile inkübe hücrelerinin elektriksel stimülasyon içerir, kalsiyum görüntüleme belirtilen işlev nöronal aktivite (Şekil 9, ek resim 1ve tamamlayıcı Şekil 2) değil doğruladı rağmen eğer bu Granül hücreleri vardı. Hücreleri daha fazla zaman veren Kültür uzunluğu 35 gündür genişleterek olgun tarafından fonksiyonel nöronal aktivite miktarı artırmalıdır tartışılabilir. Bu potansiyeli gelecekte keşfedilmeyi.
Yukarıda önerilen araştırma satır ek olarak, bu ürün kimliklerini (miktar ve kalite) farklılıkları belirlemek için ilgi 2D ve 3D iletişim kuralları arasında olacak. Dışsal FGFs önemini 2D protokolünde test değil ve eğer bilmek yararlı olacaktır kaplama sonra 3D yapısını eksikliği ve çok ilişkili sinyal yollar yapmak istiyorum 2D kültürler erken bileşikler biçimlenme üzerindekiler daha fazla veya daha az bağımlı. Daha fazla stripped-down iletişim kurallarını (örneğin, hayır RA, BDNF, SARKMA) aynı derecede daha fazla araştırma yapılması için makul satırları vardır. Son olarak, gelecekteki çalışmaları daha iyi karakterize (ve üretimi verimliliğini değerlendirmek için) yeni araştırma araçlardan yararı olabilir insan özgü serebellar nöronal alt türlerinden.
Akılda verilen uyarılar ile her ikisi de farklı amaçlar için uygun ürünlerle serebellar saptamaları için kullanılabilir iletişim kurallarını bildirdi. Onlar pilot çalışma, yürütmektedir araştırmacılar hücre hatları için böyle saptamaları veya hedeflenen sinirsel farklılaşma diğer türleri için temel bir model olarak canlılık test için pratik başlangıç noktası hizmet verebilir.

Vitro iletişim kuralları hPSCs serebellar soy doğru başlangıçta differentiating için in vivo Serebellar geliştirme1,2,3,4taklit eden ilke üzerine işletilen. Bu nedenle, onlar bir arkaya faktörlerin sürücü pro serebellar desenlendirme ve olgunlaşma için belirli zamanlarda tanıttı gerekli. Bunlar arasında Şef WNT, vardı kemik morfogenetik proteinler (BMP) ve orta arka beyin gelişimi ve oluşumu isthmic Organizatör5,6,7bilinen rolleri ile fibroblast büyüme faktörleri (FGFs). Tabii ki, her ek adım ve faktör emek yoğun işlemler ve daha fazla gider bir artış için araştırmacı anlamına gelir, ve çok daha basit protokolleri eşit sonuçları ulaşma yeteneğine sahip gelişmekte olan ilgi. Hücreleri üzerinde kendi geliştirme içinde vitroböyle sıkı, dış denetim gerektiren olup olmadığını pratik bu sorun güzel varsayımsal soru ile dovetails.
Serebellar farklılaşma için 2015 yılında yayınlanan bir protokol amacıyla8desenlendirme için sadece FGF2, FGF19 ve stromal hücre kaynaklı faktörü 1 (SDF1) kullanarak büyüme faktörlerinin geniş bir numarasını kullanarak gerekliliği ele. Bu çalışma aynı zamanda bir serbest yüzer 3D kültür sistemi kullanılarak önceden serebellar kurallarından farklıydı. Serebellar işaretçileri için hücreleri olumlu üreten ek olarak, "kendi tekniği ile üretilen beyin organoids" ilgili Morfoloji, rhombic dudak benzeri yapıları gibi geleneksel 2D monolayer kültürlerde kullanılamaz sergilemek gösterilmiştir. Daha az karmaşık ve pahalı büyüme faktörleri, tek tip embryoid organları (EBs) ve 96-şey tabak (96WPs), kültür gibi diğer özellikleri ile ilgili olarak her ne kadar ilk adımları uyguladığınızda procedurally karmaşık yaptı. Başka bir 3D protokol aynı yıl yayınlanan, sinirsel soy yaygın ve ucuz hücre kültürü teknikleri9kullanarak için başarılı farklılaşma bildirdi. Her ne kadar bu grup serebellar farklılaşma yerine kortikal araştırıyordu, uygulama serebellar farklılaşma için onların kavramının indirimli değil.
Biz son zamanlarda desenlendirme faktörlerin azaltılmış bir kullanan bir 3D serebellar farklılaşma Protokolü rapor (yani, FGF2, 4 ve 8), yanı sıra boyunca orta gereksinimleri10en aza indirmek için 6-şey levha (6WPs) hücreleri tutarak basitleştirilmiş bir Kur. Granül hücrelerinin üretimini yardımcı olmak için smoothened agonist (SAG) son olgunlaşma adımı sırasında kullanıldı. SAG olduğunu daha önce serebellar protokolleri, granül hücre öncüleri (GCPs) vivo1,2, büyüme teşvik rolü nedeniyle kullanmıştı sonic kirpi (SHH), daha az pahalı bir kimyasal alternatif 11,12,13. Farklılaşma ürünleri serebellar ilişkili işaretçileri varlığı morfolojik ilgili yapıları8,9' da dahil olmak üzere diğer 3D protokollerinden gelen tutarlı edildi. Böyle sonuçlar asla bilemeycek ayrıntılı önceki mesajı takviye vivo çevre karmaşık 3D vitro farklılaştırma protokolleri için gerekli olmayabilir.
3D protokolüne ek olarak, bu rapor aynı hızlı kurulum ile temel malzemeler, tasarlanmış bir 2D protokolünü açıklar ve büyüme faktörleri sayısını azalttı. Bu insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) hücrelerden üretebilen veya pluripotent kök hücreler (hiPSCs) indüklenen, işaretçileri için olumlu associated ile erken sinirsel, serebellar ve granül hücre kimlikleri. Buna ek olarak, kalsiyum görüntüleme fonksiyonel insan nöronlar varlığını gösterir. Araştırmacılar, ya da bu ilgi için protokolleri arasında seçmek için yetenek ekler bir düzeyde bir esneklik: (1) üreten belirli hücre türleri, (2) modelleme insan beyin gelişimi ve ilişkili yapıları, (3) analiz monolayer içinde en iyi duruma getirilmiş ayarlar (örneğin, yama-kelepçe kayıtları) veya (4) hücre-hücre etkileşimleri karışık sinirsel kültürlerde. Basit ve düşük maliyetli doğaları onları erişilebilir hPSC alana yeni veya temel hPSC yordamlar daha fazla farklılaşma seçenekleri keşfetmek için gerek araştırmacılar için yapar.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>glutamin takviyeli DMEM/F12</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>nöral temel ortam</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>İmgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poli (2-hidroksietil metakrilat)</td> <td>Sigma</td><td>P3932</td>, <td>diğer adıyla Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 orta ve takviye</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC orta ve takviye</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK inhibitörü)</td> <td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC'ye uygun yapışkan kaplama (PAAC)</td></tr> <tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 um filtre</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpü</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>sargısı için kültür plakaları</td></tr><tr><td>kriyotüpler</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>tripsin bazlı ayrışma ajanı</td></tr><tr><td>Tanımlanmış Tripsin İnhibitörü (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik Asit</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Glial Türetilmiş Nörotrofik Faktör</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Nörotrofik Faktör 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Düzleştirilmiş Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield görüntüleme mikroskobu</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield görüntüleme - görüntü elde etme</td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5810</td> Hücre <td>kültürü için</td> <td>Eppendorf</td><td>521-0996</td> santrifüj</tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serolojik pipetler</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serolojik pipetler</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu kültür plakaları</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESC WiCELL</td><td></td><td></td><td>satır H01</td></tr></tbody></table>

İsteğe bağlı 2d değişiklik ile akıcı 3d serebellar farklılaşma protokolü

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Karmaşıklık ve farklılaşma protokolleri maliyetini azaltarak araştırmacılar için önemlidir. Bu faiz olası istenmeyen etkileri dışsal desenlendirme faktörler model beyin gelişimi ya da hastalık fenotip maskeleme gibi patofizyolojisi, insan pluripotent kök hücre (hPSC) oluşturabileceğine kaygıları ile uyuyor. Burada, iki serebellar farklılaşma protokol için tasarlanmış basit başlangıç yöntemini, daha az desenlendirme faktörler ve daha az önceki iletişim kuralları daha malzeme gereksinimleri hPSCs, mevcut. Son zamanlarda, biz serbest yüzer 3 boyutlu (3D) ürünleri beyin "organoid" iletişim kuralları türleri Morfoloji beyin gelişimi gibi alt/ventrikül bölge - modelleme ile ilgili ve rhombic de dahil olmak üzere diğer tutarlı oluşturmak kültür yordamlar geliştirilen dudak benzeri yapılar. İkinci ürün serebellar ilişkili işaretçileri için olumludur ve nöron benzeri kalsiyum influxes sergilemek gibi fonksiyonel serebellar nöronlar, üretme yeteneğine sahip gösterilir tam farklılaşma yapışık, 2D monolayer yordamına kullanır. Birlikte, bu protokoller bilim adamları aerodinamik sinirsel saptamaları diğer türleri test etmek için farklı araştırma amaçlı, hem de bir temel modeli için uygun seçenekleri sunuyoruz.

Genel bakış düşük büyüme faktörü 2D ve 3D serebellar farklılaşma protokolleri Şekil 1 extrinsic faktörler ve kaplama süreyi belirleme 2D ve 3D serebellar farklılaşma protokolleri için genel zaman çizelgesini gösterir. 3D serebellar başkalaşım geçiren hPSCs için tipik ilerleme Şekil 2' de tasvir edilir: koloniler besleyici-Alerjik kültür gün 0 (sol üst rakam); hESC çizgi H01 ile geçiren EB oluşumu ile gün 2 (üst orta); gün 14 (sağ üst); RA ve FGF8 sinir indüksiyon takip belirgin Lümen ile daha büyük hücre toplamları büyüyen toplamları büyüklüklerde ve gün 28 (sol alt); şekil şekillendirme bir tek agrega farklı yapıları ile karmaşıklık gelişmekte belirtilen gün 28 (alt orta); ve aynı yapıları (sağ alt) gün 35 morfolojik değişiklikler devam etti. 2D serebellar başkalaşım geçiren hPSCs için tipik ilerleme şekil 3' te tasvir edilir: Besleyici-Alerjik kültür gün 0 (sol üst alan hESC kolonileri arasında farklılaştırılmış hücrelerin gösteren daire ile figür) kolonilerde olarak H01 ile hESC satır ; geçiren EB oluşumu ile gün 2 (üst orta); gün 13 (sağ üst); RA ve FGF8 sinir indüksiyon takip belirgin Lümen ile daha büyük hücre toplamları büyüyen (alt); yapışık hücreleri sola kaplama 14 gün sonra Proliferasyona ve hücre daha fazla karmaşık/olgun görünümdeki monolayer sonra günde 35 yüksek büyütme (sağ alt) ve düşük (alt orta) altında.
3D ürün sergi işaretleri ve erken Neuroepithelium yapılarının Resim 2 (alt sol görüntü) ve şekil 4 3D toplam Morfoloji, değişen büyüme ve/veya olgunlaşma oranları yanı sıra Stokastik birleştirme veya agrega ayrı kırılma nedeniyle kültür boyunca görülen heterojen göster. Heterojenite rağmen her farklılaşma serebellar granül işaret ZIC1, şekil 5' te boyama immunocytochemistry (ICC) tarafından belirtildiği şekilde dahil olmak üzere erken sinirsel ve nöronal işaretleri sergilenmesi toplamları oluşturur. Daha da önemlisi, şekil 5 ve şekil 6 düşük büyüme faktörleri ile basit bir 3D kültür karmaşık yapıdaki erken neuroepithelium ve rhombic dudak gibi beyin gelişimi ile ilgili toplamları üretme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.
2D ürünleri sergi serebellar işaretleri ve fonksiyonel nöronal aktivite 2D kültürler karmaşık 3D yapılar yeniden olamaz, onlar serebellar granül hücre işaretçisi ZIC1, Şekil 7' deki ICC boyama tarafından belirtildiği şekilde dahil olmak üzere erken sinirsel ve nöronal işaretleri sergilenmesi hücre üretme yeteneğine sahip vardır. Erken granül hücre işaretçisi ATOH1 varlığı deneyler ve satırları arasında değişken olsa Gene ifade analizi yoluyla RT-PCR, ICC boyama sonuçları, şekil 8' de görüldüğü gibi destekler. Kalsiyum görüntüleme 2D kültüründe daha kolay işlenir. Şekil 9, ek Video 1ve tamamlayıcı Video 2görüldüğü gibi işlevsel nöron nesil düşündüren nöronal ateş şekillerinin tipik kalsiyum influxes elektriksel olarak uyarılmış olan hücreleri gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Şekil 1: zaman çizelgesi (farklılaşma 0 gün başlayarak) farklılaşma Protokolü'nün. Düz çizgi kutuları belirli faktörler kültür ortamına eklenir ve plaka-kaplama isteğe bağlı 2D değişiklik için noktalı çizgi kutuları gösterir gösterir. FGF2 için aşağı oku düşük konsantrasyonlarda (4 ng/mL) ve yukarı ok daha yüksek konsantrasyonlarda (20 ng/mL) gösterir. Bu rakam Holmes ve Heine10değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Şekil 2: temsilcisi aydınlık alan görüntüleri 3D Protokolü'nün. hESC colonies adlı d0, EBs, d2, indüksiyon d14, farklı boyut ve Morfoloji (numaralandırılmış 1-5) adlı d28, (harfler bir-ctarafından gösterilen) d28, benzersiz, tanımlayıcı özellikleri ile tek bir toplamak agrega takip toplar ve d35 aynı özellikleri görünür değişiklikleri. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine10değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi aydınlık alan görüntüleri 2D Protokolü'nün. hESC kolonileri d0 EBs, d2, indüksiyon, d13, 5 x büyütme ve 20 x büyütme, görüldüğü gibi olgunlaşma itibariyle d35 sonra toplamları, d14, kaplama sonra sonra toplar. Üst sol panelinde beyaz daire farklılaşmış hücreler arasında hESC kolonileri alanında gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Şekil 4: değişen boyut ve karmaşıklık 3D kültüründe gösterilen aydınlık alan görüntüleri. Toplamları(a)günde 8 (hESCs) ve (B) d35 (hiPSCs). İkinci görüntü tüm toplama göstermek için üç ayrı görüntülerini oluşur. Her iki toplamları küçük toplamları veya kaybı (yapılarının kopması) birleştirerek etkilenmiş olabilir. Ölçek çubuğu 200 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine10yayınlanacaktır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Şekil 5: ICC resimleri 3D ürünlerin ilgili işaretleri ve yapıları göster. Kültür d35 3D ürünler Sergi: PAX6 (yeşil) ve TBR2 (kırmızı) tarafından Lümen sinirsel rozet benzeri oluşumu (ilk sıra); DCX (yeşil) ve dış kenarı ventrikül bölgesinden (VZ) yayılan NeuN (kırmızı)-gibi (ikinci sırada) yapısı; KIRREL2, serebellar neuroepithelium ile ilişkili bir işaretleyici (üçüncü satır, sol); ve bir işaretleyici serebellar granül ile ilişkili ZIC1 (3. sıra, sağ) hücreleri. Deneme dört farklı hPSC satır birden çok kez kullanılarak yapılmıştır: hESC satır H01 (n = 5) ve IPSC satırları hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3) ve hvs51 (n = 1). Oklar işaret Rhombic dudak (RL)-hangi tarihlerde yapısı. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine10yayınlanacaktır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Şekil 6: büyük ölçekli ventrikül bölge gibi yapısında 3D ürün. Kültür d35 bir hESC elde edilen toplam PAX6 (yeşil) ve TBR2 (kırmızı) yaygın ventrikül bölgeleri (VZs) ve subventricular bölgeleri (SVZs), içinde vivoiçinde bulunan erken nöronlar ile ilişkili pozitiftir. (Üst) Bir yıldız işareti (*) işaretleri toplamak, kenarı boyunca derinlik/Anabilim Dalı VZ belirten köşeli ayraç ile çalışan VZ benzeri bölge apikal yan / SVZs. (orta) birleştirilmiş sinyalleri show PAX6 dağınık bölümlerini + / TBR2-hücre boyutu üst sağ sonuna doğru artan VZ. (Alt) Yüksek büyütme Resim bölümünün bir dikdörtgen orta panelinde gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine10değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Şekil 7: ICC resimleri 2D ürünlerin ilgili işaretleri göster. Kültür d35 hESCs (üst satır) ve hiPSCs (alt satır), 2D ürünlerini sergilemek için pozitif hücreleri: granül hücre işaretçisi ZIC1 ve göçmen serebellar nöron marker (sol sütun); TAG1 ve nöronal işaret neurofilament (NF) ve TAG1 (sağ sütun). Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Şekil 8: RT-PCR 2D ürünleri. mRNA ifade analizi (üst satır) hESC hattı H01 ve hiPSC satır hvs60 (alt satır) 2D sonunda ürünler için Jel Elektroforez ile iletişim kuralı gösterir: granül hücre işaretçisi ZIC1, granül hücre işaretçisi ATOH1, göçmen serebellar nöron marker TAG1, Purkinje hücre işaretçisi Calbindin (CALB), voltaj bağımlı kalsiyum kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gama - aminobütirikasit (GABA) B reseptör 1 (G-Br1) ve Oda temizliği gene EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Şekil 9: kalsiyum görüntüleme/analiz 2D ürünleri. Kültür d35 hPSC farklılaşma ürünler için mikroskop altında 2 dk fluor5 boya ile kuluçka sonra kaydedildi. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik s, 10 Hz.(a)sabit görüntüler Haritayı hESCs at 0 s (solda) ve 30 elektriksel stimülasyon başladıktan sonra s (sağda). Oklar bölge kalsiyum akını çözümlenmesi için (ROI) ilgi gösterir. Yatırım Getirisi için zaman karşı göreli floresan (B) grafik çözümlemesini gösteren değişiklik (floresan içinde değiştirme = (F-F0) / f0, nereye F0 (∑F1-n) = / n), nöron gibi dikenli önce sırasında ve sonrasında meydana gelen uyarım. Siyah bar elektriksel stimülasyon uzunluğunu gösterir. Ölçek (beyaz) sırasıyla = 50 µm. tam kayıt (burada görüldüğü gibi) hESC ve (gösterilmez) hiPSC çizgisi ek Video 1 ve ek Video 2, kullanılabilir. AVI formatında, 4 x hızda kayıtları vardır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Video 1: video hESC çizgi H01 2D ürünün Imaging kalsiyum. Kültür d35 farklılaşma ürünleri H01 kaydedildi mikroskop altında 2 min için kuluçka ile fluor5 sonra hESC satırından boya. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik 10 Hz. kayıtları s 2 kare/s yapılmış ve AVI video ~ 7 kare/s, ~ 30 kalıcı bir video üreten içine işlenmiş s ~ 4 x hızda. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Video 2: video hiPSC çizgi hvs51 üzerinden 2D ürünün Imaging kalsiyum. Kültür d35 kuluçka fluor5 boya ile sonra mikroskop altında 2 min için hiPSC satır hvs51 Urun farklılaşma kaydedildi. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik 10 Hz. kayıtları s 2 kare/s yapılmış ve AVI video ~ 7 kare/s, ~ 30 kalıcı bir video üreten içine işlenmiş s ~ 4 x hızda. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Biz bir basitleştirilmiş 3D farklılaşma tanımlanan protokolü kullanarak hPSCs, orta tarif ve büyüme faktörleri, erken neuroepithelial yapıları ile hücre toplamları oluşturma yeteneğine ve serebellar ilişkili işaretçileri, hem de bir isteğe bağlı için olumlu azaltılmış Hücreleri işlevsel sinir hücreleri oluşturmak için monolayer ayırt için 2D değişiklik.

İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Bu farklılaşma kültürlerinin genel amacı, 2D veya 3D ortamlarda serebellar hücre soyları oluşturmaktır. Bu yöntemler, hasta kaynaklı kök hücreler kullanılarak çocukluk çağı beyin bozukluklarının altında yatan yeni gelişmeler veya hastalık mekanizmaları ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birkaç faktörle basit bir başlatma ve bakıma sahip olması ve daha karmaşık nöral protokolleri test etmek için bir temel olarak kullanılabilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Lisa olacak. Modifiye edilmiş yöntemle farklılaşmayı ayarlamak için, hPSC'lerin G-yöntemi ile gerekli hacimde nöral bakım ortamını steril bir tüpe aktarın ve mililitre başına 4 nanogram FGF2 ve on mikromolar kaya inhibitörü ile takviye edin. Ardından, orta tüpü oda sıcaklığında veya 37 ° C'lik su banyosunda tutun

streamlined-3d-cerebellar-differentiation-protocol-with-optional-2d

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, fare beyinciğinden doku dilimleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Serebellar dilimler, miyelinasyon dinamikleri de dahil olmak üzere nörogelişimsel mekanizmalar hakkında bilgi sağlayan organotipik kültürleme için kullanılabilir.

Beyincik Diseksiyonu ve Dilim Hazırlama: Fare Beyinciğinden Doku Dilimleri Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri serebellar progenitörlere ayırmak için bir protokolü göstermektedir. Embriyoid cisimcikleri oluşturmak için kök hücre kolonilerinin ultra düşük bir bağlanma plakasına aktarılmasını, büyüme faktörleri ile farklılaşmanın teşvik edilmesini ve daha sonra embriyoid cisimciklerinin yapışma için matris kaplı bir plakaya aktarılmasını içerir. Sonraki adımlar, hücre göçünü indüklemeyi ve glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncülerin ve...

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden 2D Tek Tabakalı Serebellar Hücreler Oluşturma Tekniği

Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Doğum sonrası beyincik gelişimi sırasında, germinal bölgeden köken alan olgunlaşmamış granül hücreleri, nihai hedeflerine ulaşmak ve nöronal ağlar kurmak için farklı göç yöntemleri sergilerler. Bu protokol, serebellar kesitlerin hazırlanmasını ve nöronal göçü düzenleyen faktörleri araştırmak için kullanılan konfokal makroskopik yaklaşımı tanımlar.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

Nükleer zarf proteinleri birçok temel biyolojik süreçte merkezi bir rol oynar ve çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır.  Bu protokol, LINC komplekslerinin bozulmasının uzay-zamansal kontrolüne izin veren yeni bir Cre/Lox tabanlı fare modelini açıklar.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Öğrenin, insan çok yönlü kök hücrelerini kullanarak serebellar hücre soylarını 2D veya 3D ortamlarda üretmek için basit bir farklılaşma protokolü. Bu yöntem, çocukluk çağı beyin bozukluklarının hastadan türetilmiş kök hücrelerle incelenmesine olanak tanır.

İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü

Daha fazla video keşfet