Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Bu prosedürün genel amacı, C.elegans'ta germ hücrelerinin nöronlara dönüşümünü indüklemektir. Bu yöntem, hücresel kaderin yeniden programlanmasının düzenlenmesinde sinyal yolları veya epigenetik gibi biyolojik süreçlerin etkisinin araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu videoda açıklanan yöntemin ana avantajı, canlı hayvanlarda, germ hücrelerinin, kaderi indükleyen bir transkripsiyon faktörünün aşırı ekspresyonu ile sorgulanabilmesidir.

Paralel olarak, hücresel yeniden programlamanın düzenlenmesinde rol oynayan yeni faktörleri tanımlamak için RNAi ekranı gibi bir genetik tarama gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin etkileri rejeneratif tedaviye kadar uzanır. Çünkü bu in vivo yöntem, farklı gelişimsel ve çevresel koşullar altında hücresel yeniden programlamayı incelemek için kullanılabilir.

Yeniden programlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Çünkü germ hücresinden nörona dönüşüm fenotipi, lin-53'ün tükenmesi üzerine, yalnızca dikkatli bir şekilde kontrol edilen koşullarda gerçekleşir. RNAi plakaları için, IPTG ve karbenisilin içeren NGM agar ile altı santimetrelik plakaları yükleyin.

Karanlıkta oda sıcaklığında 24 ila 48 saat kurumaya bırakın. Ardından bunları 14 güne kadar dört santigrat dereceye aktarın. Daha sonra, lin-53 genini taşıyan L4440 plazmidli RNAi bakteri klonları ile karbenisilin ve tetrasiklin içeren seçici plakaları çizgileyin.

Üç fazlı bir çizgi deseni kullanın ve boş bir vektör kontrolü plakaladığınızdan emin olun. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, en az üç tek koloni seçin ve her birini, karbenisilin ile desteklenmiş, ancak tetrasiklin ile desteklenmemiş, iki mililitre LB ile ayrı bir kültür tüpüne aşılayın.

Koşul başına üç sağlıklı kültüre sahip olmayı planlayın. Daha sonra, kültürleri 600 nanometrede 0,6 ila 0,8 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, altı santimetrelik bir NGM agar RNAi plakasına her bakteri kültüründen 500 mikrolitre ekleyin.

Plakaları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. Bu protokol, transgenlerin en kararlı olduğu 15 santigrat derecede tutulan BAT28 suş solucanları için optimize edilmiştir. Suş genetiği ile ilgili ayrıntılar metinde verilmiştir.

Solucanların yaş senkronizasyonu çok önemlidir. Beyazlatma tekniğini kullanın. Yetişkinleri ve yumurtaları içeren altı santimetrelik NGM agar plakalarını 800 mikrolitre M9 kullanarak yıkayın. Daha sonra solucanları santrifüjleme ile pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın.

Daha sonra, solucanlara 1/2 ila bir mililitre ağartma çözeltisi ekleyin. Ve bir stereoskop altında solucanları izlerken, yetişkin solucanlar patlamaya başlayana kadar tüpü sallayın ve ardından yumurtaları toplayın. Şimdi atıkları yumurtalardan ayırın.

Önce tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra doku peletini 800 mikrolitre M9 ile üç kez yıkayın. Yıkamalar arasında dokuları bir araya getirmek için santrifüj kullandığınızdan emin olun.

Şimdi, temizlenmiş yumurtaları OP50 bakterisi ile tohumlanmış taze NGM plakalarına aktarın. Embriyoların başarılı bir şekilde izole edilip edilmediğini ve NGM plakalarına transferini kısaca kontrol edin. Hayvanları 15 santigrat derecede büyütün.

Lin-53 tükenmesi üzerine germ hücresinden nörona dönüşümü sağlamak için, tükenmenin ebeveyn neslinde başlaması gerekir. Lin-53'ü tüketmek için L4 hayvanlarını RNAi'ye tabi tutun. Replika başına 50 L4 solucanını bakteri içermeyen bir NGM RNAi plakasına manuel olarak aktarın.

Platin tel kullanın. L4 solucanları, ventral taraflarının yaklaşık yarısında beyaz bir yama ile tanınabilir. Şimdi, solucanları karanlıkta yaklaşık yedi gün boyunca 15 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

IPTG ışığa duyarlıdır. F1 dölleri L3 ve L4 aşamalarına ulaştığında, onları daha büyük, daha kalın ebeveyn hayvanlardan ayırın. Bu noktada, lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olduğunu gösteren çıkıntılı vulva fenotipi için F1'i tarayın.

RNAi aktivitesi ayrıca 15 santigrat derecenin üzerine çıkan ölümcüllüğe neden olabilir. Che-1'i aktive etmek ve F1 soyunda germ hücresinden nörona dönüşümü indüklemek için, solucanları karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca ısı şoku verin. Daha verimli bir ısı şokuna izin verdiği için havalandırmalı bir inkübatör kullanın.

Isı şokundan sonra, plakaları gece boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin. Hayvanlar orta L3 aşamasına ulaşmadan önce ısı şoku ile che-1'in aşırı ekspresyonunu indüklemekten kaçınmak önemlidir. Bu, hedeflenmemiş dokularda che-1 proteininin ekspresyonuna yol açabilir.

Ertesi gün, hayvanları orta vücut bölgesinde transgen kaynaklı floresan açısından incelemek için bir floresan ışık kaynağı ve GFP filtresi kurun. Fenotip penetrasyonunu değerlendirmek için, floresan sinyali yayan hayvanların oranını bulun. Tipik olarak, yaklaşık% 30'u ayrı bir GFP sinyali gösterecektir.

Karşılaştırıldığında, boş vektör RNAi'yi taşıyan hayvanlarda, germ hattında dağınık bir sinyal bile popülasyonun %5'inden fazlasında görülmez. Çıkıntılı vulva fenotipini sergileyen F1 hayvanları, lin-53 RNAi'nin başarılı bir şekilde uygulandığını göstermektedir. Bu hayvanlarda, che-1'in ısı şoku indüksiyonu üzerine germ hücrelerinin ASE nöron benzeri hücrelere dönüşümü yaygındır.

Yakın inceleme, germ hattı hücrelerinden gelen nöronlar için tipik olan nöron benzeri projeksiyonları ortaya çıkarır. Buna karşılık, boş vektör kontrolleri, en fazla dağınık olan GFP'nin minimum ifadesini gösterdi. Bu hayvanlardaki germ hücreleri nöron benzeri özelliklerden yoksundu.

Hayvanlar, che-1 aşırı ekspresyon indüksiyonu sırasında çok genç olduklarında, genellikle gelişmekte olan vulva gibi vücudun diğer bölgelerinde ektopik transgen ekspresyonu gösterirler. Bu videoyu izledikten sonra, germ hücrelerini nöronlara yeniden programlamak için canlı solucanlar kullanarak deneyleri nasıl dikkatli bir şekilde planlayacağınızı ve gerçekleştireceğinizi iyi anlamalısınız. Bu videoda anlatılan yöntem, şimdi hücresel yeniden programlamanın düzenlenmesinde bir dizi farklı faktörün etkisini araştırmanıza izin verecektir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür 10 gün içinde yapılabilir. Deneyi denerken, yeniden programlamanın indüksiyonundan önce hayvanları dikkatli bir şekilde sahnelemek ve BAT28 suşunu 15 derecede tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre kaderi dönüşümleri sırasında rol oynayan altta yatan mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları ele almak için çift RNAi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.