Name: Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Keşfedin C. elegans'ta germ hücrelerinin nöronlara dönüşümünü in vivo araştırmak için RNAi ve ısı şoku ile CHE-1 transkripsiyon faktörü ifadesi yöntemini. Bu teknik hücre yeniden programlama mekanizmalarını ve rejeneratif terapi potansiyelini ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alina El-Halili ve Martina Hajduskova teknik yardım için teşekkür ederiz. El yazması üzerinde yorum Tursun grubunun üyeleri, teşekkür ederim. Bu eser ERC-StG-2014-637530 ve ERC çiğ PCIG12-GA-2012-333922 tarafından sponsor oldu ve Max Delbrueck Merkezi tarafından Helmholtz Association moleküler tıp için desteklenir.

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakımı açısından LaGeSo Berlin, Almanya tarafından onaylanmış olan
1. çözüm hazırlık
<ol>
	<li>NGM-Ağar kaplamalar (1 L)
	<ol>
		<li>3 g-in NaCl, pepton medya (örneğin, Bacto-pepton) 2.5 g ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 1 mL ekleyin M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL ve 1 mL amfoterisin b (2.5 mg/mL stok).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM Agar RNAi tabak (1 L)
	<ol>
		<li>3 g-in NaCl, 2.5 g pepton medya ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra eklemek, kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL, amfoterisin b (2.5 mg/mL stok) 1 mL, 1 mL 1 m IPTG ve 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g agar, 1 M Tris pH 8,0 10 mL 20 g. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ve 5 mg/mL tetrasiklin 2.5 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB orta (1 L)
	<ol>
		<li>10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g ve 1 M Tris pH 8,0 10 mL. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-tampon (1 L)
	<ol>
		<li>Na2HPO46.0 g, 3 g KH2PO4, 5 gr NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Önce kullanımı, 1 M MgSO41 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beyazlatma çözüm (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O için 10 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNAi plakaları hazırlanması
Not: C. elegans genellikle Yuvarlak solucanlar büyüme orta Agar (NGM-Agar)10,117.5 mL içeren 6 cm Petri plakalar üzerinde laboratuvarda kültürlü. Bu iletişim kuralı 15 ° C'de muhafaza solucanlar için optimize edilmiştir NGM tabak hazırlamak için mantar ve bakteri kontaminasyonu önlemek için standart steril tekniklerini kullanın. RNAi için ayıraçlar ile desteklenmiş NGM tabak hazırlamak için iletişim kuralı şudur.
<ol>
	<li>1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 50 µg/mL carbenicillin içeren 6 cm NGM Agar RNAi tabak hazırlamak. Koyup karanlık12oda sıcaklığında 24-48 h için kuruyuncaya kadar bırakın.
	<ol>
		<li>Karanlıkta 4 ° C'de RNAi plakalar tutmak. 14 gün daha büyük ise kullanmayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lin-53 gen DNA dizisi kullanılabilir RNAi Kütüphane13 50 µg/mL içeren LB-agar plakaları donmuş gliserol stoktan ile L4440 plazmid içeren RNAi bakteri (Escherichia coli HT115) klon seçin carbenicillin ve üç fazlı streaking desen kullanarak 12.5 µg/mL tetrasiklin. 37 ° C gece12bakteri büyümek. Bu klon Candidatus lin-53 dsRNA IPTG-bağımlı üretimini sağlar.
	<ol>
		<li>Ayrıca, herhangi bir Gen dizisi boş vektör kontrol14olarak olmadan L4440 plazmid içeren RNAi bakteri büyümek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ertesi gün, bir koloni lin-53 üzerinden almak veya 200 µL pipet kullanarak boş vektör LB-Ağar kaplamalar ipucu ve her biri 50 µg/mL carbenicillin ile desteklenmiş sıvı LB orta14 2 mL içeren bir ayrı kültür tüp içine aşılamak. Onlar bir optik yoğunluk (OD) ulaşana kadar 600 kültürler 37 ° C'de gecede büyümek nm 0,6-0,8. Spektrofotometre15kullanarak OD ölçmek. Dikkat: Tetrasiklin bakteri gliserol stoktan bir azalma RNAi verimliliği 12 ' ye müşteri adayları besleme sırasında tetrasiklin dahil beri çizgiler için kullanılan LB-agar plaka aksine sıvı LB medya içermemeli</li>
	<li>Her bakteri kültürü (lin-53 veya boş vektör) 500 µL 6 cm NGM Agar RNAi tabakaları bana bir multipipette kullanarak ekleyin. Tabak kuru karanlık oda sıcaklığında gecede kapalı bir kapak ile kuluçkaya. Bu süre boyunca, NGM tabak içinde IPTG dsRNA içinde bakteri üretimi teşvik.
	<ol>
		<li>Bakteriyel kültür deneme başına başına en az 3 tabak kullanın. Bu 3 teknik her deneme için çoğaltır sağlayacaktır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4 ° C'de bakteri kurutulmuş NGM agar RNAi pilakalar karanlıkta iki haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>
3. C. elegans zorlanma BAT28 hazırlanması
<ol>
	<li>Solucan zorlanma BAT288 transgenes otIs305 içeren korumak [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 15 ° C'de standart NGM-Ağar kaplamalar kullanarak OP50 bakteri Not:10nematodunun kültür için detaylı iletişim kuralı için bakın. Rol-6(su1006) dominant bir gen olduğunu ve sık kullanılan tipik yuvarlanma hareketi neden olur fenotipik enjeksiyon işaretçisi16 . Bu otIs305 transgene izlemek için kullanılan hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Her zaman 15 ° c BAT28 gerilme precautious aktivasyonu önlemek için tutmak hsp-16.2prom::che-1 transgene. 15 ° C yüksek sıcaklıklarda mümkün olduğu kadar yük taşıma sırasında azaltmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yaş-solucanlar eşitlemek için beyazlatma tekniği17kullanın.
	<ol>
		<li>Yetişkin ve 900 µL M9 tampon kullanarak yumurta BAT28 içeren 6 cm NGM-Ağar kaplamalar yıkayın. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.</li>
		<li>0.5-1 mL çözüm ağartma ekleyin ve yetişkin solucanlar patlak açık başlayana kadar yaklaşık 1 dk için tüp sallamak. Standart bir stereomicroscope kullanarak izleyin.</li>
		<li>Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.</li>
		<li>Solucan Pelet 800 µL M9 arabelleği ekleyerek ve de 900 x g centrifuging 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Temizlenmiş yumurta taze NGM-tabaklar OP50 bakteri ile seribaşı yerleştirin. L4 sahne (yaklaşık 4 gün) ulaşana kadar ağartılmış Vaha'da OP50 bakteri 15 ° c üzerinde büyür. L4 larvaları beyaz bir yama bir standart stereomicroscope kullanarak solucan18 ventral kenarı boyunca yaklaşık yarım tarafından tanınacak. Not: nöron dönüşüm fenotip lin-53tükenmesi üzerine mikrop hücresine elde etmek için bu ebeveyn üretimi (P0) tüketilmiş gerekir.</li></ol></li></ol>Dönüşüm fenotip için puanlama aşağıdaki üretimi (anne babaya üretimi F1) üstlenilmiştir. Şimdiden P0 Rutherford lin-53 elde etmek için L4 hayvanlar için RNAi tabi tutulmaktadır.
	
	
	<li>Elle herhangi bir bakteri içeren ve transfer edilen OP50 bakterileri uzak hareket solucanlar izin bir NGM plaka bir platin tel kullanarak çoğaltma başına 50 L4 sahne solucanlar aktarın. Yaklaşık 5 dakika için plaka üzerinde hareket solucanlar izin. NGM Agar RNAi plakaları bakterilerden kullanımı daha önce ilgili RNAi plakayı aktarmak için lin-53 RNAi bakteri (veya boş vektör kontrolü) numaralı seribaşı.
	<ol>
		<li>Gerçek RNAi plakayı OP50 bakteri aktarılmasını önlemek. Hızlı baskı 15 ° C'nin daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için çalışır</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solucanlar NGM Agar RNAi plakaları 15 ° C'de F1 döl solucanların L3-L4 sahne ulaşana kadar yaklaşık 7 gün kuluçkaya. Onlar büyük ve F1 döl daha kalın olduğundan P0 hayvanlardan açıkça ayrılabilir.
	<ol>
		<li>Görsel olarak bir standart stereomicroscope altında F1 döl solucanlar şekil 1' de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotip gösterir olup olmadığını kontrol edin. RNAi lin-53 karşı pleiotropic etkileri vardır ve RNAi lin-53 karşı başarılı olmuştur değerlendirmek için kullanılan pvul fenotip neden olur. Not: RNAi lin-53 karşı da ölümcül F1 embriyoların neden olabilir. Önce hayvanlar L3-L4 aşamaya plakaları 15 ° C daha yüksek derece maruz kalır bu etkisi artar. Ölü embriyo tutuklandı gelişim ve çıkım eksikliği tarafından kabul edilebilir.</li>
		<li>IPTG ışığa duyarlı olduğundan plakaları karanlıkta kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>

4. indüksiyon Germ hücre yeniden programlama
<ol>
	<li>Lin-53 içeren muayene RNAi plakaları kuluçkaya ve vektör RNAi tedavi F1 döl CHE-1 etkinleştirmek için karanlıkta 37 ° C'de 30 dk için boş. İçin daha verimli bir ısı şok sağlar beri Bacalı kuluçka makinesi kullanın.</li>
	<li>Isı şok hayvanların yeniden elde etmek için 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında ve plakaları gecede karanlıkta 25 ° C'de kuluçkaya izin.</li>
	<li>Bir çift stereomicroscope Floresan ışık kaynağı için birleştiğinde kullanarak incelemek gcy-5prom::gfpiçin GFP filtre altındaki hayvanlar- Şekil 2' de gösterildiği gibi sinyalleri orta gövde alanında solucanların türetilmiş. GFP sinyalleri için set mikroskop: 488 maksimum uyarma nm ile emisyon 509 maksimum nm.</li>
	<li>Montaj hayvanların agar pedi içeren mikroskobu slaytlar19orta gövde alanında GFP sinyallerle germ hücreli nöron dönüşüm derecesini değerlendirmek.
	<ol>
		<li>Germ hücreli nöron dönüşüm fenotip alellerle değerlendirmek için karanlık hayvanlar vs gösterilen hayvanları saymak. Hayvanlar değil fazla % 5 boş vektör RNAi üzerine germline diffüz GFP sinyalleri gösterir, ancak genellikle, yaklaşık hayvanların % 30 ayrı GFP sinyalleri germline lin-53 tükenmesi, üzerine gösterir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
<li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+barriers+and+enhancers%3A+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li>
<li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-Dependent+Heterochromatin%3A+Barrier+to+Cell+Fate+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Gent%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li>
<li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li>
<li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li>
<li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).</li>
<li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li>
<li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100(2017).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_introreversegenetics/introreversegenetics.html">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).</li>
<li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li>
<li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li>
<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
<li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_intromethodscellbiology/intromethodscellbiology.html">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları var olduğunu ilan etti.

Transgenik C. elegans açıklanan iletişim kuralı'nı BAT28 strain ve RNAi lin-53 karşı birkaç adım sırayla kritik germ hücreli nöron yeniden programlama için beklenen sonuç sağlamak için basittir. Bu zorlanma BAT28 deneyler önce her zaman 15 ° C'de tutulur önemlidir. Kullanım ve bakım baskı sırasında olmak en aza indirgemek zaman 15 ° C üzerindeki sıcaklıklarda, mümkün olduğu kadar ihtiyacı var. Che-1 overexpression yetersiz indüksiyon germ hücre ASE nöron dönüşüm için neden değil bu yana doğru ısı-şok önemli koşullardır. Bu iletişim kuralında tanımlandığı gibi fenotip alellerle ölçerek tespit edilebilir. Geniş ısı-şok için hayvanların ölümcül yol açabilir. Örneğin, iç duvarları yakınında veya statik hava kuluçka makinesi alt yere genellikle yerleştirildi plakaları kapsamlı ısıl işlem deneyim. Bu nedenle, bu Bacalı ısı kuluçka makinesi kullanmak için tavsiye edilir. O zaman L3 Ektopik gcy-5prom::gfp indüksiyon vulva (şekil 3) gibi farklı vücut bölgelerde neden olabilir Ayrıca, zamanlama ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade daha önce larva aşamalarında beri önemlidir 9. Ayrıca, geniş ısı-şok fenotip alellerle % 5 ve diğer dokuların, yani bağırsak artan otomatik Floresans genişletmeniz değil boş vektör RNAi hayvanlar tarafından tespit edilebilir.
Düzensiz, RNAi bakteri verimli bir şekilde hedef gen dsRNA üretmek için faaliyetlerini kaybedebilir. Ne yazık ki, bu algılanan önceden RNAi deney için mümkün değildir. Bu gibi durumlarda gliserol gelen taze bir çizgi Bölüm 2'de iletişim kuralının açıklandığı gibi yetişkin olmak. Eğer hala yok RNAi neden pleiotropic fenotip pvul fenotip lin-53, sonra bir plazmid karşı başarılı RNAi ilgili bakteri DNA izolasyonu neden olduğu gibi görünür yapılmalıdır ve taze HT115 bakteri olması gerekir lin-53 sıra içeren L4400 plazmid ile dönüştürülmüş.
Önemlisi, BAT28 zorlanma olan bir transgenesis ile hayvanların sırasında kullanılan iğne işaretçisi pRF4 nedeniyle silindir fenotip hsp-16.2prom::che-1 DNA yapısı. Zaman zaman, hayvanlar, susturmak belirtebilirsiniz haddeleme fenotip kaybetmek hsp-16.2prom::che-1 transgene. Düzgün BAT28 zorlanma korumak için taze bir tabak için 10 silindir hayvan almak ve hayvanlar haddeleme için seçme aktarabilirsiniz.
Uygulama Protokolü'nün (P0 üretimi) ailesi lin-53 için RNAi maruz kalmış değil hayvanlar germ hücreli nöron dönüşüm nedeniyle anne kurtarma4göstermez anlamına gelir F1 RNAi yordam sınırlıdır. Germ hücreleri nöronlar için dönüştürmek için alternatif bir yordam RNAi knock-down gld-1 ve mex-3 aşırı ifade bir transkripsiyon faktörü olmadan kullanarak Ciosk ve meslektaşları15 tarafından tarif edilmiştir. Ancak, elde edilen nöronlar nöronlar belirli bir türüne ait olmayan ve germ hücreleri de kas benzeri hücreler gld-1 ve mex-315RNAi aracılı tükenmesi üzerine dönüştürmek. Daha önce kanıtlanmıştır lin-53 karşı RNAi germ hücreli dönüşüm GABAergic nöron benzeri hücrelere Pitx tipi homoedomain transkripsiyon faktörü UNC-3016 CHE-14 yerine aşırı ifadesi üzerine izin . Gelecekteki tarifin için farklı kader-inducing transkripsiyon faktörleri lin-53 germ hücreleri tükenmiş olup olmadığını test edilecek diğer hücre tipleri belirli nöronlar daha dönüştürülebilir. Bu bağlamda, overexpression myogenic bHLH transkripsiyon faktörü HLH-1, homolog memeli Tanrım17, germ hücreli dönüşüm lin-53 RNAi5 üzerine kaslara neden olmaktadır. Kurulan özel somatik hücre tipi lin-53 RNAi üzerine ve uygun bir kader-inducing transkripsiyon faktörü aşırı ifade germ hücrelerinin yeniden şekillendirmek için birkaç farklı genetik ekranlar için kullanılabilir. Böyle bastırıcı veya artırıcı ekranlar hücre kader dönüştürme sırasında bir rol oynamak yasal yolları dissekan yardımcı olabilir.

Kader gibi myogenic TF Tanrım, Ektopik TF ifade tarafından yeniden programlama hücre hangi overexpressed zaman dönüştürür fibroblastlar kas benzeri hücreler1, içine doğrudan olmuştur bir araştırma odak yıllardır. Ancak, farklı hücre hücresel kimliklerini korumak mekanizmaları nedeniyle bu işlem için ateşe dayanıklı çoğu kez. Germ hücreleri koruma benzer derecede gösterir ve genellikle diğer hücre tipleri kader-inducing TF aşırı ifadesi üzerine içine germ hücreli dönüşüm önlemek için bir engel olarak hareket temel mekanizmaları vardır. Genellikle, epigenetik yönetmelik Histon modifikasyonları ve Kromatin yapısı gibi bir engel hücre kaderi2,3dönüşüm için uygular. Biz daha önce ters genetik RNAi knock-çıkışlar C. elegans içinde kullanarak uygulanan ve hücresel kimlikleri korumak ve böylece germ hücrelerinin nöron4yeniden şekillendirmek için karşı koymak faktörler tespit. Özellikle, polycomb baskıcı karmaşık 2 (PRC2) ve son derece korunmuş Histon refakatçi LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 insanlarda) önlemek germ hücreleri doğrudan dönüşüm içine glutamatergic tat nöronlarda C. elegans gibi belirli somatik hücre türleri 4 , 5. ısı şok indüklenebilir Zn-parmak TF CHE-1 taşıyan Transjenik hayvanlar kullandığımız bariyer faktörler yeniden programlama bu germ hücre tanımlamak için. CHE-1 normalde iki baş C. elegansburada glutamatergic tat nöronlar kaderi ASE6olarak adlandırdığı belirtir, nöronlarda ifade edilir. ASE nöron kader ASE özgü floresan muhabir gcy-5prom::gfpifade tarafından görüntülenmeyecektir. GCY-5 ASE doğru nöron7' ifade bir chemoreceptor var. Lin-53 tükenmesi RNAi tarafından ve indüksiyon ısı şok tarafından CHE-1'in geniş Ektopik ifade üzerine, germ hücreleri nöronlar vivo içinde4,5dönüştürülebilir. Önemlisi, zaman RNAi tedavi gibi sadece yetişkin solucanlar (P0 üretimi) lin-53 için RNAi maruz F1 döl hayvanlarla nöronlar4yeniden programlama için izin veren bir germline çıkmasına çok önemlidir.
C. elegans nöron dönüştürme yordamına yukarıda açıklanan germ hücre hücre kaderi yeniden programlama içinde yollar sinyal dolaylı gibi biyolojik soruları çeşitli eğitim için kullanılabilir. Örneğin, biz CHE 1 bağlı germ hücreli lin-53 karşı RNAi üzerine ASE nöronların içine yolu germ hücreli8yeniden programlama sürecinde sinyal çentik dolaylı çalışma için yeniden şekillendirmek için kullanılır. Lin-53 ve Histon demethylase kodlama co tüketmek için çift RNAi gerçekleştirerek bu yolu zıt PRC2-aracılı gen UTX-1'in ifadesinde germline8 etkinleştirerek susturmak sinyal çentik gösterdik gen utx-1 . Bu bulgu germ hücreli dönüşüm Bu protokol için açıklanan nöronlar için sağlam bir canlı ve bağlamında farklı gelişim ve çevresel hücresel yeniden programlama gibi karmaşık bir biyolojik süreç çalışma için kullanılan olabilir gösterir koşullar. Ayrıca, germ hücreleri aşırı farklı kader-inducing TFs sınırlama-in hücresel plastisite9içindeki rolü çalışma veya germ hücre için yeniden programlama inducing için potansiyellerini değerlendirmek için ifade ederek meydan okumak için bakış açısı sağlar diğer hücre içinde vivotürleri.
Memeli doku kültürleri de hücre kaderi yeniden şekillendirmek için farklı yönlerini eğitim izin verirken, hücre kültüründe yetiştirilen için sağlam bir organizma karşılaştırıldığında sinyal yol koşulları taklit kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, C. elegans çentik vivo içindeyeniden programlama sırasında sinyal verme gibi çeşitli biyolojik süreçlerin rolleri incelenmesi için çok yönlü bir model. Ayrıca, o korumak ve genetik olarak değiştirmek için düşük maliyetleri nispeten kolay bir güçlü genetik ekranlar için modeldir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Kimyasallar&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Maya özü&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>USBiolojik</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<alt>4</alt></td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt></td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > inkübatörler < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>inkübatör&nbsp;</td><td>Isı şoku</td>İnkübatörü için <td>New Brunswick Scientific</td><td>C24 M1247-0052</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>15 ° C'de solucan suşlarının bakımı için; C veya 25 & derece; C</td></tr><tr><td>Mikroskoplar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Görsel düzenleme) + kamera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Görsel düzenleme) + kamera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td> <td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizojen: lavUV5 promotörü -T7 polimeraz) (IPTG ile indüklenebilir T7 polimeraz) (RNAse III eksi).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Urasil oksotrof E. coli suşu</td></tr><tr><td><güçlü>Solucan suşları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>BAT28:</güçlü> otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>OH9846'dan N2</td></tr><tr><td><güçlü>RNAi Klonları</td> ile 4 kat daha fazla geri çaprazlama ile türetilmiştir</güçlü><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>KaynakBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer kütüphanesi 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>boş vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solucan toplama&nbsp;</td><td></td><td></td><td>bir pastör pipeti ve bir platin tel kullanarak kendi kendine yapılır</td></tr></tbody></table>

uygulama için yeniden programlamak germ hücreleri için c. elegans nöronlarda rnai ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Hücre biyolojik süreçlerin belirli hücre tiplerinin kimlikleri dönüştürme sırasında eğitim korumak ve hücresel kimlikleri korumak önemli anlayışlar içine mekanizması sağlar. Germ hücreleri dönüştürme nematodunun Caenorhabditis elegans (C. elegans) belirli nöronların içine kurulan hücre kimlikleri korumak yasal yolları incelemek için genetik ekranlar gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. ASE olarak adlandırdığı nöronların belli bir türe germ hücrelerinin yeniden programlama (TF) CHE-1 Zn-parmak transkripsiyon geniş aşırı ifade izin Transjenik hayvanlar faktör gerektirir. Endojen CHE-1 sadece iki baş nöronlarda ifade edilir ve kolayca gcy-5prom::gfp muhabiri tarafından görüntülendi glutamatergic ASE nöronlar kaderini belirlemek için gereklidir. Isı şok organizatörü tahrik che-1 gen ifade yapısı içeren bir trans gen ısı şok tedavisi üzerine tüm hayvan CHE-1'in geniş yanlış ifade sağlar. RNAi kombinasyonu faktör LIN-53 Kromatin düzenleyen ve che-1 ısı şok bağlı aşırı ifade karşı ASE nöron benzeri hücrelere germ hücre yeniden programlama için yol açar. Biz burada Transjenik hayvanlar ısı şok tedavisi için uygun koşul ve belirli RNAi yordamı başarıyla germ hücreli nöron dönüşüm için ikna etmek için açıklamak.

Şekil 1' de gösterildiği gibi pvul fenotip sergi F1 hayvanlar lin-53 RNAi başarılı uygulama gösterilmektedir. Bu hayvanlar onların germ hücreleri dönüştürme ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade üzerine ASE nöron benzeri hücreye Şekil 2' de gösterildiği gibi izin yatkındır. Denetimde boş büyüdü solucan aksine RNAi lin-53 tedavi Ektopik GFP-sinyalleri ısı-şok ve 25 ° C kuluçka açıklanan önceki4, gece sonra orta gövde alanında görüntülemek hayvanlar verecek RNAi vektör 8. bu solucanları bir epifluorescence mikroskop altında daha yakından incelendiğinde ortaya koymaktadır GFP sinyalleri de gösteren hücreler nöronal hücre için tipik olan nöron benzeri projeksiyonlar (2B şekil, beyaz ok) görüntüler. Eğer RNAi lin-53 karşı başarısız oldu veya ısı şok koşulları uygunsuz GFP sinyalleri bu denetim RNAi tedavi hayvanlar (Şekil 2) benzer. Önemlisi, hayvanlar orta L3 sahne ulaşmadan önce ısı indüksiyon tarafından che-1 ' in aşırı ifade inducing kaçının. Che-1 overexpression indüksiyon anda çok gençtin hayvanlar Ektopik gcy-5prom::gfp ifade gelişmekte olan vulva gibi vücudun diğer bölgelerinde şekil 313' te gösterildii gibi görüntülenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Şekil 1: Pvul fenotip RNAi tarafından lin-53 karşı neden. (Üst) L4/genç yetişkin sahne F1 döl Worms DIC resim denetimi veya lin-53 tedavi RNAi anne türetilmiş. Ölçek çubukları- lin-53 RNAi ekran çıkıntılı vulva (pvul) fenotip (siyah ok-uçları) tedavi 20 µm. (alt) hayvanlar =. Pvul fenotip RNAi lin-53 karşı başarılı olduğunu doğruluyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Resim 2: Başarılı bir şekilde programlanmış germ hücreli Kurtlarla nöronların içine. (A)BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör yetiştirilen gösterme GFP sinyalleri germline che-1 overexpression ısı-şok indüksiyon sonra. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları = 20 µm. (B) BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör kontrolü RNAi ekran gcy 5prom::gfp sinyalleri orta gövde alanında lin-53 üzerinde yetiştirilen RNAi hayvan yetiştirilen aksine. Orta gövde bölümü 63 X büyütme oranında alınan GFP sinyallerle resimlerini çıkıntılar (beyaz ok-uçları) gösterilen GFP pozitif hücreler ortaya koyuyor. Morfolojik bu özellik germ hücreleri dönüştürme ASE nöron benzeri hücrelere uygulanan gösterir. Beyaz Yıldız bağırsak kaynaklı auto-floresan işaretleyin. Tüm resimleri 20 X büyütme ve 63 X büyütme ile bir epifluorescence mikroskop kullanarak elde. Kesikli beyaz çizgi solucanlar özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Şekil 3: Erken sahne solucanı Ektopik GFP. Isı şok L2 gibi erken larva aşamalarında che-1 overexpression için indüklenen vardı boş vektör RNAi bakteri yetiştirilen BAT28 zorlanma hayvanlar GFP sinyalleri orta gövde alanında (beyaz yıldızlar) göster. Bu sinyaller germ hücre yeniden programlama nedeniyle değildir. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Bu prosedürün genel amacı, C.elegans'ta germ hücrelerinin nöronlara dönüşümünü indüklemektir. Bu yöntem, hücresel kaderin yeniden programlanmasının düzenlenmesinde sinyal yolları veya epigenetik gibi biyolojik süreçlerin etkisinin araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu videoda açıklanan yöntemin ana avantajı, canlı hayvanlarda, germ hücrelerinin, kaderi indükleyen bir transkripsiyon faktörünün aşırı ekspresyonu ile sorgulanabilmesidir.Paralel olarak, hücresel yeniden programlamanın düzenlenmesinde rol oynayan yeni faktörleri tanımlamak için RNAi ekranı gibi bir genetik tarama gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin etkileri rejeneratif tedaviye kadar uzanır. Çünkü bu in vivo yöntem, farklı gelişimsel ve çevresel koşullar altında hücresel yeniden programlamayı incelemek için kullanılabilir.Yeniden programlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Çünkü germ hücresinden nörona dönüşüm fenotipi, lin-53'ün tükenmesi üzerine, yalnızca dikkatli bir şekilde kontrol edilen koşullarda gerçekleşir. RNAi plakaları için, IPTG ve karbenisilin içeren NGM agar ile altı santimetrelik plakaları yükleyin.Karanlıkta oda sıcaklığında 24 ila 48 saat kurumaya bırakın. Ardından bunları 14 güne kadar dört santigrat dereceye aktarın. Daha sonra, lin-53 genini taşıyan L4440 plazmidli RNAi bakteri klonları ile karbenisilin ve tetrasiklin içeren seçici plakaları çizgileyin.Üç fazlı bir çizgi deseni kullanın ve boş bir vektör kontrolü plakaladığınızdan emin olun. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, en az üç tek koloni seçin ve her birini, karbenisilin ile desteklenmiş, ancak tetrasiklin ile desteklenmemiş, iki mililitre LB ile ayrı bir kültür tüpüne aşılayın.Koşul başına üç sağlıklı kültüre sahip olmayı planlayın. Daha sonra, kültürleri 600 nanometrede 0,6 ila 0,8 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, altı santimetrelik bir NGM agar RNAi plakasına her bakteri kültüründen 500 mikrolitre ekleyin.Plakaları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. Bu protokol, transgenlerin en kararlı olduğu 15 santigrat derecede tutulan BAT28 suş solucanları için optimize edilmiştir. Suş genetiği ile ilgili ayrıntılar metinde verilmiştir.Solucanların yaş senkronizasyonu çok önemlidir. Beyazlatma tekniğini kullanın. Yetişkinleri ve yumurtaları içeren altı santimetrelik NGM agar plakalarını 800 mikrolitre M9 kullanarak yıkayın. Daha sonra solucanları santrifüjleme ile pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın.Daha sonra, solucanlara 1/2 ila bir mililitre ağartma çözeltisi ekleyin. Ve bir stereoskop altında solucanları izlerken, yetişkin solucanlar patlamaya başlayana kadar tüpü sallayın ve ardından yumurtaları toplayın. Şimdi atıkları yumurtalardan ayırın.Önce tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra doku peletini 800 mikrolitre M9 ile üç kez yıkayın. Yıkamalar arasında dokuları bir araya getirmek için santrifüj kullandığınızdan emin olun.Şimdi, temizlenmiş yumurtaları OP50 bakterisi ile tohumlanmış taze NGM plakalarına aktarın. Embriyoların başarılı bir şekilde izole edilip edilmediğini ve NGM plakalarına transferini kısaca kontrol edin. Hayvanları 15 santigrat derecede büyütün.Lin-53 tükenmesi üzerine germ hücresinden nörona dönüşümü sağlamak için, tükenmenin ebeveyn neslinde başlaması gerekir. Lin-53'ü tüketmek için L4 hayvanlarını RNAi'ye tabi tutun. Replika başına 50 L4 solucanını bakteri içermeyen bir NGM RNAi plakasına manuel olarak aktarın.Platin tel kullanın. L4 solucanları, ventral taraflarının yaklaşık yarısında beyaz bir yama ile tanınabilir. Şimdi, solucanları karanlıkta yaklaşık yedi gün boyunca 15 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.IPTG ışığa duyarlıdır. F1 dölleri L3 ve L4 aşamalarına ulaştığında, onları daha büyük, daha kalın ebeveyn hayvanlardan ayırın. Bu noktada, lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olduğunu gösteren çıkıntılı vulva fenotipi için F1'i tarayın.RNAi aktivitesi ayrıca 15 santigrat derecenin üzerine çıkan ölümcüllüğe neden olabilir. Che-1'i aktive etmek ve F1 soyunda germ hücresinden nörona dönüşümü indüklemek için, solucanları karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca ısı şoku verin. Daha verimli bir ısı şokuna izin verdiği için havalandırmalı bir inkübatör kullanın.Isı şokundan sonra, plakaları gece boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin. Hayvanlar orta L3 aşamasına ulaşmadan önce ısı şoku ile che-1'in aşırı ekspresyonunu indüklemekten kaçınmak önemlidir. Bu, hedeflenmemiş dokularda che-1 proteininin ekspresyonuna yol açabilir.Ertesi gün, hayvanları orta vücut bölgesinde transgen kaynaklı floresan açısından incelemek için bir floresan ışık kaynağı ve GFP filtresi kurun. Fenotip penetrasyonunu değerlendirmek için, floresan sinyali yayan hayvanların oranını bulun. Tipik olarak, yaklaşık% 30'u ayrı bir GFP sinyali gösterecektir.Karşılaştırıldığında, boş vektör RNAi'yi taşıyan hayvanlarda, germ hattında dağınık bir sinyal bile popülasyonun %5'inden fazlasında görülmez. Çıkıntılı vulva fenotipini sergileyen F1 hayvanları, lin-53 RNAi'nin başarılı bir şekilde uygulandığını göstermektedir. Bu hayvanlarda, che-1'in ısı şoku indüksiyonu üzerine germ hücrelerinin ASE nöron benzeri hücrelere dönüşümü yaygındır.Yakın inceleme, germ hattı hücrelerinden gelen nöronlar için tipik olan nöron benzeri projeksiyonları ortaya çıkarır. Buna karşılık, boş vektör kontrolleri, en fazla dağınık olan GFP'nin minimum ifadesini gösterdi. Bu hayvanlardaki germ hücreleri nöron benzeri özelliklerden yoksundu.Hayvanlar, che-1 aşırı ekspresyon indüksiyonu sırasında çok genç olduklarında, genellikle gelişmekte olan vulva gibi vücudun diğer bölgelerinde ektopik transgen ekspresyonu gösterirler. Bu videoyu izledikten sonra, germ hücrelerini nöronlara yeniden programlamak için canlı solucanlar kullanarak deneyleri nasıl dikkatli bir şekilde planlayacağınızı ve gerçekleştireceğinizi iyi anlamalısınız. Bu videoda anlatılan yöntem, şimdi hücresel yeniden programlamanın düzenlenmesinde bir dizi farklı faktörün etkisini araştırmanıza izin verecektir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür 10 gün içinde yapılabilir. Deneyi denerken, yeniden programlamanın indüksiyonundan önce hayvanları dikkatli bir şekilde sahnelemek ve BAT28 suşunu 15 derecede tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre kaderi dönüşümleri sırasında rol oynayan altta yatan mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları ele almak için çift RNAi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Neurexins ve neuroligins sinaptik farklılaşma ve iletiminde önemli rolleri yerine membran nöron yapışma proteinleri. Neuroligin, eksik...

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Bu video, C. elegans'ta RNAi tedavisinin arkasındaki prensipleri açıklar ve bir transgenik solucan suşunda lin-35'i nakavt etmek için bir protokol gösterir.

C. elegans Beslemesi için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA Ekspresyonunu İndüklemek İçin Bir Teknik

RNAi, C. elegans araştırmacılarının kullanabileceği güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarını kullanarak plaka beslemeden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunmaktadır.

Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu video, nematod germ hücrelerinin nöronlara hücre kaderinin yeniden programlanmasını göstermektedir. Nematod Caenorhabditis elegans'ın transgenik larvaları, spesifik bir kromatin düzenleyici faktörü parçalamak için RNA girişimine (RNAi) maruz kalır ve bu da döllerinin germ hücrelerini hücre kaderinin yeniden programlanmasına daha duyarlı hale getirir. Döllere ısı şoku uygulanır ve germ hücrelerini, ifade edilen bir floresan raportör kullanılarak tanımlanan nöronlara dönüşümlerini tetikleyen...

Hücre Kaderi Nematod Germ Hücrelerinin Nöronlara Yeniden Programlanması

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Burada, moleküler düzeyde RT-qPCR kullanan Caenorhabditis elegans ısı şok tepkisi (HSR) indüksiyondeğerlendirmek için standart protokoller sunulmaktadır, hücresel düzeyde floresan muhabirler, ve organizma düzeyinde termokurtarma.

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Keşfedin C. elegans'ta germ hücrelerinin nöronlara dönüşümünü in vivo araştırmak için RNAi ve ısı şoku ile CHE-1 transkripsiyon faktörü ifadesi yöntemini. Bu teknik hücre yeniden programlama mekanizmalarını ve rejeneratif terapi potansiyelini ortaya koyar.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Daha fazla video keşfet