Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Bu tekniğin genel amacı, farklı bileşiklerin model organizmalar C.elegans üzerindeki etkilerini yüksek verimli bir tahlilde test etmektir. Bu yöntem, kimyasal, biyoloji ve yaşlanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin belirli kimyasal yapılar C.elegans'ın ömrünü uzatır mı? Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda bileşiğin zaman açısından verimli ve hızlı bir şekilde taranmasına izin vermesidir.

Çok sayıda solucan üretimi için toplu kültür plakaları hazırlamak için, laminer bir akış kabininde, önce 30 mililitre 60 santigrat derece nematod büyüme ortamı agarını gece boyunca katılaşma için 10 santimetrelik kültür plakalarına dağıtın. Ertesi sabah, her bir plakaya iki mililitre konsantre E.coli ekleyin, bakterileri plaka yüzeyine tamamen yaymak için plakayı eğin ve döndürün. Kitle kültürü plakaları kuruduğunda, iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.

Tarama için yüksek verimli tahlil kültürü plakaları hazırlamak için, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,15 mililitre erimiş nematod büyüme ortamı agar eklemek için otomatik sekiz kanallı bir dağıtıcı kullanın. Agarın gece boyunca katılaşmasına izin verin. Ardından, yüksek verimli tahlil plakalarını iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.

C.elegans kültürlerini kurmak için, her bir kitle kültürü plakasına 20 yumurta aktarmak için bir solucan penası ve bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve plakaları altı gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Yedinci günde, rahimdeki yumurtaların varlığını görsel olarak doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Gravid yetişkinleri toplamak için, plaka başına iki ila üç mililitre S Bazal çözeltisi eklemek için bir cam pipet kullanın ve çözeltileri her bir plakanın etrafında elle döndürün.

Solucanları 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için cam pipeti kullanın ve solucanları santrifüjleme ile peletleyin. Solucanları 10 mililitre hipoklorit çözeltisinde tekrar askıya alın ve tüpleri beş saniye boyunca hızla yukarı ve aşağı sallayın. Daha sonra, solucanları her 2,5 dakikada bir çalkalayarak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Kuluçka sonunda solucanları tekrar santrifüjleyin. Peletler sarımsı kahverengi olmalıdır. Süpernatanları 10 mililitre taze hipoklorit çözeltisi ile değiştirin ve tüpü tekrar kuvvetlice sallayın.

Solucanları ara sıra çalkalayarak bir ila üç dakika daha kuluçkaya yatırın. Sadece yumurta kaldığında, tüpleri santrifüjleyin ve süpernatanları aspire edin. Peletler beyaz olmalı ve kahverengi renkte olmamalıdır.

Steril teknik kullanarak, tüpleri steril bir laminer akış kabininde açın ve her pelete 14 mililitre S Bazal solüsyonu ekleyin. Peleti 14 mililitre S Bazal ile üç kez yıkayın. Santrifüjleme ile üç yıkamadan sonra, yumurtaları iki ila üç mililitre taze S Bazal çözeltisinde tekrar süspanse edin.

L1 aşaması larva C.elegans hazırlamak için, süpernatanları tüp başına bir steril cam Petri kabına aktarın ve tüplerden kalan yumurtaları her bir tabağa durulamak için iki ila üç mililitre S Bazal solüsyonu kullanın. Kalabalığı hafifletmek için her tabağa beş mililitre S Bazal solüsyonu ekleyin ve yumurtadan çıkmayı teşvik etmek için tabağı 16 ila 24 saat boyunca 20 santigrat derece ve 20 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Yumurtadan çıkan yavruların tümü, yiyecek eksikliği nedeniyle ilk larva aşamasında tutuklanacaktır.

Serolojik bir pipet kullanarak, L1 larvalarını santrifüjlemeleri için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüm yumurtadan çıkan L1, tekrarlanan santrifüjleme ve aspirasyon yoluyla konsolide edildikten sonra, larva peletini 10 mililitre steril S Bazal çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Daha sonra, 10 mikrolitreyi tohumlanmamış bir tabağa aktarın ve plakada bulunan larva sayısını sayın.

Çözeltinizdeki L1'lerin ortalama yoğunluğunu elde etmek için bunu 10 kez tekrarlayın. Steril bir serolojik pipet ile L1'leri içeren toplam çözelti hacmini belirleyin. Ardından, çözümünüzde bulunan toplam L1 sayısını hesaplamak için L1 çözeltisinin hacmini ve çözeltideki L1'lerin yoğunluğunu kullanın.

Solucanları 96 kuyulu yüksek verimli bir tahlil plakasında kaplamak için, L1 süspansiyonunu, orta derecede yavaş dönen bir karıştırma çubuğu ile donatılmış steril, yuvarlak bir ortam şişesinde mikrolitre başına bir L1 larvasına seyreltin ve tahlil plakalarının oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Daha sonra, bir laminer akış kabininde, her bir oyuğa beş mikrolitre konsantre E.coli ekleyin, ardından kuyu başına ortalama 10 solucan elde etmek için kuyu başına 10 mikrolitre L1 süspansiyonu ekleyin. Tüm solucanlar kaplandıktan sonra, plakaları örtün ve larvaların yetişkinlere dönüşmesine izin vermek için solucanları 25 santigrat derecede iki gün boyunca kuluçkaya yatırın.

Kuluçka işleminin sonunda, kimyasal kütüphane plakalarını donma durumundan oda sıcaklığına getirin. Çözülmüş plakaları kullanımdan hemen önce bir dakika boyunca bir mikro plaka çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de hafifçe çalkalayın. Otomatik 96 kuyulu bir sıvı işleyici kullanarak, 0.75 mikrolitre bileşiği kütüphane plakasından tahlil plakasına aktarın.

Tüm kuyucuklar arıtıldığında, bileşiği plakaların yüzeyinden laminer bir akış kabininde dört ila sekiz saat havayla kurutun ve tek tek plakaları kuruduktan hemen sonra çıkarın. Kurumuş plakaları şeffaf film ile kapatın ve kapatın. Daha sonra plakaları 1000 G'de 45 saniye döndürün ve 25 santigrat derecede ters konumda saklayın.

C. elegans'ın ilgilenilen bileşiklere verdiği yanıtları test etmek için, kontrol hayvanlarının% 95'i ölene kadar toplam sağkalımı puanlamak için negatif bir kontrol plakası kullanılabilir, bu noktada tüm test plakaları puanlanabilir. Örneğin, bu çalışmada, 179 bileşikten oluşan tekrar test kütüphanesinden 57 isabet gözlemlendi ve bu da tekrar test kimyasallarının toplamda% 32'sinin pozitif test ettiğini gösterdi. Negatif kontrol ve test kuyuları için ortalama yüzde canlı skorların gruplandırılması, test kuyularının kontrol kuyularından daha iyi performans gösterdiğini göstermiştir.

Test bileşiğinin 50 mikromolar ve 100 mikromolar konsantrasyonlarının kullanıldığı bu temsili test testinde gösterildiği gibi küçük ölçekli ekranlar da gerçekleştirilebilir. Negatif kontrol ile tedavi edilen hayvanların% 99'undan fazlası öldüğünde bu küçük ekranlı tahlil test plakalarının yeniden puanlanması, pozitif kontrol kuyularının negatif kontrol ve test kuyularından çok daha iyi performans gösterdiğini, test kuyularının negatif kontrollerden biraz daha iyi performans gösterdiğini gösterdi. Bu deneyde, ikinci sonuç, test kuyularının birçoğunun kontrol işlemine göre toksisite sergilediği ve dolayısıyla bu basit yorumu karıştırdığı göstergesi ile önyargılıydı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki ila dört hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, test plakalarının bütünlüğünü korumak, kullanılmadan önce bozulmamış olduklarından emin olmak önemlidir. Bu tekniği takiben, bu bileşiklerden hangisi mitofajiye neden olur gibi ek sorular cevaplanabilir.

Bir mitofaji tahlili için, bir mitofaji raportör ipliği kullanılacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, C.elegans'ı model organizma olarak kullanarak yüksek verimli bir kimyasal ekranın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.