Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Bu prosedürün genel amacı, in vivo metabolik etiketlemeyi makrodizi analizi ile birleştirerek biyolojik numunelerdeki tüm transfer RNA'larının hücresel seviyelerini aynı anda ölçmektir. Transfer RNA'ları uzun süre düzenleyici işlevlerden yoksun temizlik molekülleri olarak kabul edildi. Bununla birlikte, artan sayıda kanıt, hücresel tRNA seviyelerinin hücre tipi, çevre ve stres gibi değişen koşullara yanıt olarak dalgalandığını göstermektedir.

tRNA ekspresyonunun dalgalanması, belirli proteinlerin ekspresyonunu destekleyerek veya baskılayarak gen translasyonunu doğrudan etkiler. Protein sentezinin dinamiklerini anlamak, yüksek kaliteli tRNA profilleri sunabilen yöntemler gerektirir. Burada, laboratuvarda yetiştirilen organizmalarda transfer RNA seviyelerinin hızlı ve kesin bir şekilde ölçülmesini sağlayan güvenilir ve anlaşılır bir teknik sunuyoruz.

Başlamak için, 18 gauge bir iğneyle, uygun havalandırmayı sağlamak için steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün kapağının ortasına tek bir delik yerleştirin. Daha sonra, bir gece boyunca başlangıç kültüründen beş mikrolitre Mycobacterium smegmatis ile 500 mikrolitre takviye edilmiş steril 7H9 suyu aşılayın. Standart radyoproteksiyon uygulamalarını takiben, kültür ortamını mililitre fosfor-32 etiketli ortofosfat başına 20 mikroküri ile doldurun.

Dokuz milimetre kalınlığında akrilik bir kalkanın arkasına yerleştirilmiş bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derece ve 1.200 rpm'de bakteri büyütün. Midlog fazında, tüm kültürü iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve iki dakika boyunca yerçekiminin 10.000 katı santrifüjleme ile oda sıcaklığında radyoaktif bakterileri pelet haline getirin. Dahil edilmemiş radyoaktif ortofosfat içeren süpernatanı uygun bir atık kabında toplayın.

Toplam RNA'yı hazırlamak için, pelete bir mililitre ticari RNA ekstraksiyon reaktifi ve yaklaşık 200 mikrolitre cam boncuk ekleyin. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın ve iki dakika boyunca maksimum çalkalama altında bir homojenizatördeki bakterileri parçalayın. Numuneyi 12.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve boncukları uygun şekilde atın. 0.2 mililitre kloroform ekleyin ve tüpü 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice sallayın. Ardından, numuneyi 15 dakika boyunca yerçekiminin 12.000 katı ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Tüpü 45 derecede açılandırarak numunenin sulu fazını yeni bir tüpe toplayın. Fazlar arası veya organik katmanlardan herhangi birini çizmekten kaçının. Sulu faza iki mikrolitre renkli çökeltici ve 0,5 mililitre% 100 izopropanol ekleyin.

Tüpü beş saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı tüpten çıkarın ve sıvı fraksiyon eser miktarda radyoaktivite içerebileceğinden uygun şekilde atın. Ardından, peleti beş dakika havayla kuruttuktan sonra, hacim SDS başına% 0.1 ağırlık ile 200 mikrolitre 2X SSC içinde yeniden süspanse edin.

Genomik tRNA Veritabanını kullanarak, önce tRNA dizilerini veya tRNA kodlayan genleri alarak DNA probları tasarlayın. Kodlanmışsa korunmuş üç asal uçlu CCA'ları kırptıktan ve ters tamamlayıcıyı oluşturduktan sonra, probları ilk 70 nükleotidi temel alarak sipariş edin. Dizi yazdırmayı gerçekleştirmek için 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında çözün.

Elmas kalemle amin kaplı cam slaytları etiketleyin. Ardından, slaytları bir indeksleme ünitesine yerleştirin. Izgara yerleşimlerini takiben, çoğaltıcı pimleri dikkatlice kuyulara daldırın.

Minimum basınç kullanarak, diziyi cam slaytların üzerine nazikçe yazdırın. Blokla işiniz bitene kadar dizileyiciyi temizlemeden yazdırmaya devam edin A.It tutarlı bir şekilde yazdırabilmek için biraz pratik yapmanız gerekir. Oturum başına en fazla sekiz ila 10 dizi yazdırmanızı öneririz.

Dizi başına 10 ila 15 dakika sayın. Baskı deseni sırasının izini kaybetmek kolaydır, bu nedenle tüm dikkatinizi göreve verin ve tüm dikkat dağıtıcı unsurları kapatın. Bir sonraki bloğa geçmeye hazır olduğunuzda, çoğaltıcıyı %5'lik çamaşır suyuna batırın ve hafifçe sallayın.

Çoğaltıcıyı emici kağıda bastırın. Ardından, çoğaltıcıyı damıtılmış suya batırın, hafifçe sallayın ve kağıda bastırın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.

Ardından, çoğaltıcıyı izopropanole batırın, hafifçe sallayın ve kağıda bastırın. 96 oyuklu plakanın bir sonraki bloğuna geçmeden önce fan üzerindeki çoğaltıcıyı yaklaşık 20 saniye kurutun. İstenilen baskı sayısına devam edin.

Ardından slaytların kurumasını bekleyin. Kurutulmuş slaytları yüzü yukarı bakacak şekilde 254 nanometre UV çapraz bağlayıcıda temiz bir yüzeye yerleştirin. Enerji seviyesini santimetre kare başına 999, 990 mikrojoule olarak ayarlayın ve ardından başlat düğmesine basın.

Dizileri 450 mililitre bloke edici çözeltiye aktarın ve gece boyunca yavaş çalkalama altında manyetik bir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 500 mililitre damıtılmış suda, her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytları oda sıcaklığında 10 saniye boyunca bir mikrodizi santrifüjde santrifüj ederek kurutun.

Dizileri altı aya kadar kuru ve karanlık bir yerde saklayın. Hibridizasyondan önce, slaytları kaynar suda durulayın ve santrifüjleme ile kurutun. Diziyi bir hibridizasyon kasetinin içine yerleştirin ve radyoaktif işaretli RNA örneğini yükleyin.

Metin protokolüne göre maksimum tekrarlanabilirlik için numuneleri otomatik bir hibridizasyon-yıkama istasyonunda çalıştırın. Çalışmanın sonunda, slaytları santrifüjleme ile kurutun. Slaytları ince plastikle sarın.

Ardından, slaytlarda radyoaktif sinyal olup olmadığını kontrol etmek için en hassas ayarında bir Geiger sayacı kullanın. Slaytları, sinyal gücüne bağlı olarak 10 ila 90 saat boyunca oda sıcaklığında bir pozlama kasetinde bir depolama fosfor ekranında maruz bırakın. Birkaç saatten birkaç güne kadar sürebilen maruz kalma süresi doğrudan dizi sinyaline bağlıdır.

Geiger sayacındaki sayıları pozlama süresine çevirebilmek biraz pratik gerektirir. Bir fosfor görüntüleyici kullanarak slaydı 50 mikrometre çözünürlükte tarayın. Mikrodizi profil oluşturucu ile yükseltilmiş ücretsiz ImageJ yazılımını kullanarak her bir prob noktasındaki radyoaktivite yoğunluklarını ölçün ve arka planda çıkarın.

Metin protokolüne göre ısı haritaları oluşturun. Burada gösterilen, taranan bakteri, fare ve insan makrodizileridir. M.smegmatis dizileri, fare ve insan için kullanılan 48 prob yerine sadece 43 prob kullanır.

Sonuç olarak, bakteri dizisi arka planla karışan 40 boş nokta görüntüler. Üç bağımsız biyolojik replikasyon, test edilen büyüme koşulları altında, tüm M.smegmatis tRNA'larının arka plan seviyesinin üzerinde eksprese edildiğini göstermektedir. Bu özel deneyde, her prob için gözlemlenen standart sapma %2 Arginin TCT ile %22 Sistein GCA arasındadır ve medyan %5'tirEk olarak, bu deney, tRNA izoeseptörlerinin ekspresyonunun tek tip olmadığını göstermektedir.

Örneğin, tüm Alanin izoalıcıları benzer seviyelerde ifade edilirken, en yüksek ve en düşük Arginin kabul eden tRNA'lar üç kat farklılık gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa ve nokta sinyali yeterliyse yaklaşık 24 saat içinde yapılabilir. Yöntemimiz, genomu prob tasarımı için mevcut olan herhangi bir organizmaya uygulanabilir.

İn vitro olarak yetiştirilen model organizmalar, metabolik etiketleme için ideal adaylardır. Burada sunulan protokol Mycobacterium smegmatis için optimize edilmiştir, ancak aynı zamanda E.coli, maya, fareler ve insan kültürlenmiş hücrelerinde tRNA'nın profilini çıkarmak için de başarıyla kullanılmıştır. Tekniğimiz tekrarlanabilir ve spesifiktir.

Geniş dinamik aralığı ve kolayca ayarlanabilen eşiği, polizomlarla ilişkili tRNA'lar gibi düşük miktarda bulunan türlerin, yalnızca diziye maruz kalma sürelerini uzatarak profillenmesine olanak tanır.