Name: Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Keşfedin, metabolik etiketleme ve makroarray analizi kullanarak tüm transfer RNA seviyelerini aynı anda ölçme yöntemini. Bu hızlı ve güvenilir teknik, protein sentezi dinamiklerini anlamak için araştırmacılara kapsamlı tRNA profilleme imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser desteklenen bir SC INBRE hibe--dan Ulusal Enstitüsü genel tıp bilim - NIH (RG P20GM103499) ve CA555536 & CA154664 P.H.H. için Ulusal Kanser Enstitüsü'nden verir Bu program kısmen araştırma kaynakları (5 P20 RR016461) Howard Hughes tıp Enstitüsü öncesi üniversite ve lisans bilim eğitim programı aracılığıyla Charleston Koleji için bir hibe ve hibe Milli Merkezi tarafından desteklenen yapıldı. ve Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (8 P20 GM103499) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden.

1. Kültür ve metabolik etiketleme
<ol><li>Bir kez bir steril 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri kap ortasına doğru havalandırma izin vermek için bir 18'lik iğne ile poke. İlave steril 7 h 9 500 µL aşılamak suyu M. smegmatis 5 µL bir marş--dan ile Kültür yetişkin gece12. Not: Tarifi için bir 7H 9 litre suyu: 4,7 g ticari 7H 9 tozu, 2 mL gliserol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g dekstroz, (Toplam hacim 1 M'ye getirmek için) H2O.<ol>
<li>
(Dikkat) Standart radioprotection yöntemleri 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4kültür ortamıyla spike. Bakteri bir 9 mm kalınlığında akrilik kalkanın arkasında yerleştirilen bir shaker kuluçka 37 ° C ve 1200 rpm ajitasyon, büyümek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Midlog aşamasında (O.D.600 nm ~ 0.5), tüm kültür 2 mL vida-Kapiler tüp içine aktarmak ve 10.000 x g., 2 dk toplamak için süpernatant içeren unincorporated radyoaktif orthophosphate içinde oda sıcaklığında radyoaktif bakteri centrifuging tarafından cips uygun atık konteyner.</li>
</ol>2. Toplam RNA'ların hazırlanması
Not: Toplam RNA'ların (guanidinium thiocyanate, fenol ve kloroform içeren) ticari bir RNA ayıklama reaktif kullanarak bakteriyel çökeltilerini ayıklanır üreticinin protokol sonrası.
<ol><li>1 mL ticari RNA ayıklama reaktif ve yaklaşık 200 µL cam boncuk Pelet üzerine ekleyin. Tüp güvenli bir şekilde kap ve bir homogenizer en fazla ajitasyon altında 2 min için bakteriyel bozabilir (beş numaralı seçilen araç üzerinde ayarlama ( Tablo reçetesigörmek)).</li>
	<li>Santrifüj örneği 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ' Yeni bir 2 mL tüp süpernatant aktarım ve boncuklar uygun şekilde atın. Kloroform 0.2 mL ekleyin ve tüp el ile 12.000 x g de 15 s. santrifüj 4 ° C'de 15 dakika için shake şiddetle</li>
	<li>Sulu faz örnek yeni bir tüp içine tüp 45 ° de olta balıkçılığı toplamak. Interphase veya organik katman çizim kaçının. 2 renkli precipitant µL ve % 100 isopropanol 0.5 mL ekleyin. Tüp el ile 12.000 x g de 5 s. santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için shake şiddetle</li>
	<li>Tüm tüpünden süpernatant kaldırmak ve uygun şekilde atın gibi sıvı kesir radyoaktivite izleri içerebilir. 5 min için Kuru Pelet hava sonra 200 µL serum sodyum sitrat (SSC), % 0,1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) son X 2 resuspend. Not: Stok 20 bileşimi X SSC 3,0 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0 olduğunu.</li>
</ol>3. 96 iyi yazıcı plakaları hazırlanması
Not: tRNA microarrays el ile kırk iki 70-mer DNA oligonucleotides 3' sonuna bir 8-pin arrayer kullanarak (terminal CCA hariç) her M. smegmatis tRNA tamamlayıcı birlikte yazdırılır. DNA Oligonükleotid probları yanı sıra iyi plaka ve dizi sonda düzende dizilerini sağlanır (ek dosya 1 - sayfa 1-3 sırasıyla).
<ol><li>Tasarım DNA ilk alınırken tRNA dizileri veya genomik tRNA gibi tRNA veritabanlarındaki tRNA kodlama genler tarafından veritabanı13sondalar. Söve korunmuş 3' ucu kodladıysanız CCA. Tamamlayıcı elde edilen sıra ters. Sipariş sonda üzerinde ilk 70 nükleotit dayalı.</li>
	<li>Kuru DNA probları suda resuspend. Probları konsantrasyon 100 µM için ayarlayın. 96 bir şey-tabak içinde 3 X SSC, %0.01 (w/v) SDS final (seyreltik 60 µL bireysel iyi hisse senedi probları,-ile 6 X SSC'yi destek veriyor, %0.01 (w/v) SDS 60 µL. 50 µM oligos 120 µL hazırlamak</li>
	<li>Plaka folyo buharlaşma veya kontaminasyonu önlemek, hemen donma ve -20 ° C de ihtiyaç kadar tutmak için kapağı.</li>
</ol>4. dizi yazdırma
<ol><li>96-şey plaka (yaklaşık 20 dakika sürer) oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Amin kaplı cam slaytlar bir elmas kalemi ile etiketleyin. Slaytlar dizin oluşturma birim içine yerleştirin. Kılavuz yerleşimler izleyin ve aşağıdaki gibi yapın.<ol>
<li>Dikkatle Wells Çoğalıcı iğne batır.</li>
		<li>Yavaşça dizi en az basınç (küçük bir direnç hissedeceksiniz) kullanarak cam slaytlarda yazdırın. Blok a ile bitene arrayer temizlemeden yazdırmaya devam etmek</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazır olduğunuzda sonraki bloğa geçmek, aşağıda açıklanan çamaşır yordamı izleyin.<ol>
<li>Çoğalıcı %5 çamaşır suyu daldırma ve hafifçe çalkalanır.</li>
		<li>Çoğalıcı emici kağıt basın.</li>
		<li>Çoğalıcı distile su içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Çoğalıcı isopropanol içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın.</li>
		<li>Çoğalıcı yaklaşık 20 için fan üzerinde kuru s 96-şey plaka sonraki bloğuna geçmeden. Parmak izi istediğiniz sayıya devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytların crosslink oligos 254-nm UV crosslinker kullanarak slayt için Kuru izin.<ol>
<li>Enerji seviyesi 999,990 µJ/cm2olarak ayarlayın.</li>
		<li>Crosslinker temiz bir yüzey üzerinde slaytlar yüz koy. "Başlat" tuşuna basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında ve yavaş ajitasyon altında çözüm engelleme 450 mL gecede dizide engelleyin. Toplamak ve dört kat engelleme çözüm yeniden. Not: Engelleme çözüm için reçetedir: 125 mM fosfat tampon (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, %2.25 SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0.5 X SSC, % 1 BSA (w/v).</li>
	<li>500 mL distile su içinde oda sıcaklığında 2 kez 5 min için slaytlar yıkayın. Slaytlar için 10 centrifuging tarafından kuru s Mikroarray santrifüj oda sıcaklığında. Mağaza diziler için 6 aya kadar kuru ve karanlık bir yerde.</li>
</ol>5. dizi hibridizasyon
<ol><li>Hibridizasyon için önceden slaytlar kaynar suda yıkayın ve tarafından Santrifüjü (4.6) olduğu gibi kuru.</li>
	<li>Dizi içinde hibridizasyon kaset yerleştirin ve radiolabeled RNA örnek yükleyin.</li>
	<li>Otomatik hibridizasyon yıkama istasyonu maksimum tekrarlanabilirlik için çalıştırın.<ol>
<li>Program aşağıdaki adımlardan. 75 ° C'de 2 min için koşul contalar 60 ° C'de sonda tanıtmak Sonda ve örnekleri 5 dk 90 ° C'de denatüre 60 ° C'de 3 h için örnekleri melezlemek<ol>
<li>Slaytları 2 X SSC, % 0,1 (w/v) SDS, akış 10 s ile iki kez 50 ° C'de yıkama ve 20 s. 0.1 X SSC, % 0,1 SDS, akış 10 s ile iki kez 42 ° C'de yıkama slaytlar ve iki kez 0.1 ile 42 ° C'de 20 s. yıkama slaytlar tutun tutun X SSC , akış 10 s ve tutun 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuru slayt Santrifüjü (olduğu gibi 4.6) tarafından.</li>
</ol>6. dizi miktar
<ol><li>İnce bir plastik film kullanarak slaytları sarın. Bir gayger sayacı onun en hassas ayarı kullanarak radyoaktif sinyali slaytlarını denetleyin. Slaytlar bir pozlama kaset, oda sıcaklığında 10-90 h bağlı olarak sinyal gücü için bir depolama fosfor ekrana maruz. Not: Geiger sayaçları duyarlılığını farklı olarak bir enstrüman diğerine, pozlama süreleri ampirik olarak optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Slayt bir phosphorimager kullanarak 50 µm çözünürlükte tarama. Ölçmek ve radyoaktivite Koyulukları Mikroarray profiler ile yükseltilmiş ücretsiz görüntü J yazılımını kullanarak her sonda spot arka plan çıkarma.</li>
	<li>Düzenleyebilir ve bir elektronik tablo kullanarak verileri işlemek. Koşullu biçimlendirme aracını kullanarak ısı haritaları oluşturmak. Örneğin her sonda sinyal (‰ ifade edilir) bir kesir olarak toplam sonda sinyalinin temsil eder.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).</li>
<li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li>
<li>Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+transfer+RNAs%3A+similarity+and+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li>
<li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li>
<li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOt%3A+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939(2017).</li>
<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
<li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Ürünü test aralığındaki hücre fitness üzerinde önemli etkisi yoktur ancak beta parçacık emisyonları bakteriyostatik ve bakteri yok edici ajanlar14, bilinir. Mercek sayma radyoaktivite toplam-hücre özleri % 25'i ve daha sonra saf toplam RNA'ların % 1'i dahil gösterdi.
Probları aynı boyutlarda, karşılaştırılabilir erime sıcaklığı ve GC içeriğiyle macroarray lekelenme için Tekdüzen bir protokol hibridizasyon ve miktar tarafsız tRNA düzeylerinden spot sinyalleri doğrudan ölçümü için sağlar.
Tekrarlanabilir ve belirli bir noktadır. Onun geniş dinamik alan ve kolayca ayarlanabilir eşiği düşük gibi bol türlerin, sadece dizi pozlama kez9uzatan tarafından polizomlar ile ilişkili tRNA profil oluşturma sağlar. Sonra ilk yatırım için gerekli ekipman, sarf malzemeleri, dahil olmak üzere örnek maliyet çalışan $15-de örnekleri ortalamasını alır.
Nokta olan genom araştırma tasarımı için kullanılabilir herhangi bir organizma için geçerlidir. Vitro yetiştirilmektedir model organizmalar metabolik etiketleme için ideal aday olur. Memeli genleri genellikle birçok isodecoders (tRNA aynı anticodons paylaşmak, ancak onların vücut sekanslarında küçük farklılıklar görüntülemek) kodlamak gibi probları yakın tRNA türler homojen hibridizasyon korumak için kısmen dejenere olması gerekir. Son olarak, yapisan memeli hücreleri toplam RNA kültürleri önemli ölçüde ölçeklendirilmesi gereken süspansiyon gibi M. smegmatis, sonrasını organizmalar göre genellikle daha düşük miktarlarda verim.

Hücre tipi, çevre ve stres1,2,3gibi koşullara göre hücresel tRNA seviyeleri dalgalanma. Nokta, tRNA, gözlemlemek için aerodinamik Platform bir özgün, güvenilir ve laboratuvar yetiştirilen organizmalar transfer RNA düzeylerinin hızlı ve hassas miktar sağlar basit tekniği dir.
tRNA son derece kararlı ikincil ve üçüncül yapıları4var. Bunlar da çok sayıda çoğu değişiklikler5görüntüler. Bu özellikler önemli yapısal ve kutuplama ya da bazen doğrudan ve tekrarlanabilir standart kıyaslama RNA miktar teknikleri6kullanarak tRNA profil oluşturma önleyerek sıra yollara barikat temsil eder. Araştırma grupları dünya çapında hücresel tRNA düzeylerini değerlendirmek için yaratıcı ama kez kıvrık teknikleri geliştirmek zorunda kaldılar. Bu yöntemlerden bazıları şunlardır: (1) iki boyutlu elektroforetik ayrımı metabolik olarak etiketli tRNA kombine metodik nokta atama ile Kuzey leke1tarafından; (2) Kuzey tarafından bireysel miktar leke dikkatle standart radyoaktif DNA probları7kullanarak; (3) sonrası ayıklama siyanür fluorochromes ile etiketleme ardından Mikroarray analiz3ve (4) vitro rekombinant demodification enzimler ters transkripsiyon ile kombine ve sonraki kullanarak tRNA değişiklikler sıyırma yüksek işlem hacmi sıralama8.
Basit ve özgün birleşimi iki standart ve basit yaklaşım bir noktadır: organizmalar, radyoaktif toplam RNA'ların ve (2) tRNA macroarrays, sistematik ve kırılan genomik aracı büyüyen sentez, oluşan etiketleme, (1) RNA vücut tRNA ayrımı için en iyi duruma getirilmiş.
Örnekler canlı organizmalar miktar platforma aerodinamik. Onlar doğrudan çıkarma sonra analiz edilir ve önyargıları sonrası ayıklama amplifikasyon veya enzimatik tedavi gerektiren teknikleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sınırlayan daha fazla işlenen değil. Nokta çok yönlü ve kolayca tanımlamanıza ve ribozomlar çeviri ile fiziksel olarak ilişkili tRNA altgrupları ölçmek için polysome ayırma için kombine edilebilir.
Burada sunulan protokolü Mycobacterium smegmatisiçin optimize edilmiş ve o da başarıyla profil tRNA Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, fare ve insan hücre kültürleri11 için kullanılan .

<table><tbody><tr><td>Cam slayt indeksleme sistemi</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Cam kayar dizi çoğaltıcı</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu mikroplaka indeksleme sistemi</td><td>V & P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama ve kurutma istasyonu</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Çoğaltıcı pimli kurutucu</td><td>V& P Bilimsel A.Ş.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Amin kaplı slaytlar</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizatör / Otomatik hibridizasyon ve yıkama istasyonu</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı inkübatör</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı kapak 2 ml tüpler</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform (Trizol)</td><td>İnvitrojen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm cam boncuklar</td><td>Araştırma Ürünleri International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini boncuk değirmeni</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Depolama fosfor ekranı</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Fosfor görüntüleyici</td><td>GE Sağlık</td><td>Typhoon FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonükleotidleri</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>Spectroline</td><td>Select serisi 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodizi santrifüj</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık iğneler</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2 ml santrifüj tüpü</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Çökeltici (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 et suyu</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>hibridizasyon kaseti</td><td>GE Sağlık</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Albümin</td><td>Spektrum Kimyasalları</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Etilendiamintetraasetik Asit)</td> <td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Fosfat tamponu pH 7.2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolik etiketleme ve transfer rna macroarrays kullanarak profil oluşturma

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNA (tRNA) genellikle 76-90 nükleotid uzunluğunda olan bol kısa kodlamayan RNA türü bulunmaktadır. tRNA, mRNA içinde kodon amino asit dizileri haline çevirerek protein sentezi için doğrudan sorumludur. tRNA uzun düzenleyici fonksiyonları yoksun ev tutma molekül olarak kabul edildi. Ancak, kanıt büyüyen bir vücudun hücresel tRNA düzeyleri değişen koşullara hücre tipi, çevre ve stres gibi yazışma dalgalanma gösterir. TRNA ifade dalgalanma lehine veya ifade belirli proteinlerin bastırmak gen çeviri, doğrudan etkiler. Sonuçta protein sentezi dinamik kavrama yöntem yüksek kaliteli tRNA profilleri teslim etmek mümkün geliştirme gerektirir. Burada mevcut yöntemi için aerodinamik Platform için gözlem tRNA standları yer almıştır. Hücre kültürleri radyoaktif orthophosphate, radyoaktif toplam RNA'ların guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarma tarafından takip ile metabolik etiketleme ile başlayan üç adım nokta oluşur ve nihayet hibridizasyon in-house Tarih baskılı macroarrays. tRNA düzeyleri her sonda spot radyoaktivite Koyulukları miktarının tarafından tahmin edilir. Burada sunulan protokolünde Mycobacterium smegmatis mc2' de 155, sık sık bir model organizma tüberküloz çalışırdım nonpathogenic bir bakteri tRNA profil.

Üç bağımsız biyolojik, test büyüme koşullarda tüm M. smegmatis tRNA arka plan seviyesinden (şekil 1) ifade edilir göstermek çoğaltır. Belirli bu deneyde %2 (Arg (TCT)) ve medyan (şekil 1) % 5 ile % 22 oranında (Cys (GCA)) arasında gözlenen standart sapma her sonda için oluşur. Yanlış değişiklikleri çoğaltır arasında önemli ölçüde dizi hazırlık ve hibridizasyon gibi faktörlerden etkilenmektedir. Gibi örnek hibridizasyon otomatik yüksek tekrarlanabilirlik dikkatli ve tutarlı dizi baskı yoluyla elde edilir. TRNA arasında 5-fold fark Ile (GAT) ve tRNA (Val (TAC), en yüksek ve en düşük bol türler anılan sıraya göre. Nokta tRNA isoacceptors ifade tek tip olmadığını gösteriyor. Isoacceptors aynı amino asit tutun ancak farklı antikodon sıralarını görüntülemek ve bu nedenle farklı kodon mRNA'ların üzerinde kod çözme türü bulunmaktadır. Örneğin, tüm alanin isoacceptors benzer düzeyde ise ifade edilir kabul tRNA farklı tarafından 3-fold en yüksek ve en düşük arginin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> Şekil 1: temsilcisi tRNA macroarray sonuçları. (A) taranan bakteriyel, fare ve insan macroarrays. M. smegmatis diziler sadece 43 Probe prob 48 yerine fare ve insan için kullanın. Sonuç olarak, bakteriyel dizi arka plan ile Harman (probları her dizi üzerinde sekiz kez yinelenir) 40 boş noktalar görüntüler. Bunların çoğu sol üst köşesinde kümelenir. (B) çubuk grafik ve heatmap temsilleri M. smegmatis tRNA profillerinde optimal büyüme koşullar altında. Sonda sinyalleri üç bağımsız deneyler (dahil Bakteriyel büyüme, metabolik etiketleme, ayıklama ve dizi hibridizasyon) ortalama ve toplam tRNA bin değerleri başı olarak ifade edilir. Üç çoğaltır için standart sapmalar hata çubukları ve çubuk grafik ve heatmap turuncu tonları olarak sırasıyla belirtilmiştir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Bu prosedürün genel amacı, in vivo metabolik etiketlemeyi makrodizi analizi ile birleştirerek biyolojik numunelerdeki tüm transfer RNA'larının hücresel seviyelerini aynı anda ölçmektir. Transfer RNA'ları uzun süre düzenleyici işlevlerden yoksun temizlik molekülleri olarak kabul edildi. Bununla birlikte, artan sayıda kanıt, hücresel tRNA seviyelerinin hücre tipi, çevre ve stres gibi değişen koşullara yanıt olarak dalgalandığını göstermektedir.tRNA ekspresyonunun dalgalanması, belirli proteinlerin ekspresyonunu destekleyerek veya baskılayarak gen translasyonunu doğrudan etkiler. Protein sentezinin dinamiklerini anlamak, yüksek kaliteli tRNA profilleri sunabilen yöntemler gerektirir. Burada, laboratuvarda yetiştirilen organizmalarda transfer RNA seviyelerinin hızlı ve kesin bir şekilde ölçülmesini sağlayan güvenilir ve anlaşılır bir teknik sunuyoruz.Başlamak için, 18 gauge bir iğneyle, uygun havalandırmayı sağlamak için steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün kapağının ortasına tek bir delik yerleştirin. Daha sonra, bir gece boyunca başlangıç kültüründen beş mikrolitre Mycobacterium smegmatis ile 500 mikrolitre takviye edilmiş steril 7H9 suyu aşılayın. Standart radyoproteksiyon uygulamalarını takiben, kültür ortamını mililitre fosfor-32 etiketli ortofosfat başına 20 mikroküri ile doldurun.Dokuz milimetre kalınlığında akrilik bir kalkanın arkasına yerleştirilmiş bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derece ve 1.200 rpm'de bakteri büyütün. Midlog fazında, tüm kültürü iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve iki dakika boyunca yerçekiminin 10.000 katı santrifüjleme ile oda sıcaklığında radyoaktif bakterileri pelet haline getirin. Dahil edilmemiş radyoaktif ortofosfat içeren süpernatanı uygun bir atık kabında toplayın.Toplam RNA'yı hazırlamak için, pelete bir mililitre ticari RNA ekstraksiyon reaktifi ve yaklaşık 200 mikrolitre cam boncuk ekleyin. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın ve iki dakika boyunca maksimum çalkalama altında bir homojenizatördeki bakterileri parçalayın. Numuneyi 12.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve boncukları uygun şekilde atın. 0.2 mililitre kloroform ekleyin ve tüpü 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice sallayın. Ardından, numuneyi 15 dakika boyunca yerçekiminin 12.000 katı ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Tüpü 45 derecede açılandırarak numunenin sulu fazını yeni bir tüpe toplayın. Fazlar arası veya organik katmanlardan herhangi birini çizmekten kaçının. Sulu faza iki mikrolitre renkli çökeltici ve 0,5 mililitre% 100 izopropanol ekleyin.Tüpü beş saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı tüpten çıkarın ve sıvı fraksiyon eser miktarda radyoaktivite içerebileceğinden uygun şekilde atın. Ardından, peleti beş dakika havayla kuruttuktan sonra, hacim SDS başına% 0.1 ağırlık ile 200 mikrolitre 2X SSC içinde yeniden süspanse edin.Genomik tRNA Veritabanını kullanarak, önce tRNA dizilerini veya tRNA kodlayan genleri alarak DNA probları tasarlayın. Kodlanmışsa korunmuş üç asal uçlu CCA'ları kırptıktan ve ters tamamlayıcıyı oluşturduktan sonra, probları ilk 70 nükleotidi temel alarak sipariş edin. Dizi yazdırmayı gerçekleştirmek için 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında çözün.Elmas kalemle amin kaplı cam slaytları etiketleyin. Ardından, slaytları bir indeksleme ünitesine yerleştirin. Izgara yerleşimlerini takiben, çoğaltıcı pimleri dikkatlice kuyulara daldırın.Minimum basınç kullanarak, diziyi cam slaytların üzerine nazikçe yazdırın. Blokla işiniz bitene kadar dizileyiciyi temizlemeden yazdırmaya devam edin A.It tutarlı bir şekilde yazdırabilmek için biraz pratik yapmanız gerekir. Oturum başına en fazla sekiz ila 10 dizi yazdırmanızı öneririz.Dizi başına 10 ila 15 dakika sayın. Baskı deseni sırasının izini kaybetmek kolaydır, bu nedenle tüm dikkatinizi göreve verin ve tüm dikkat dağıtıcı unsurları kapatın. Bir sonraki bloğa geçmeye hazır olduğunuzda, çoğaltıcıyı %5'lik çamaşır suyuna batırın ve hafifçe sallayın.Çoğaltıcıyı emici kağıda bastırın. Ardından, çoğaltıcıyı damıtılmış suya batırın, hafifçe sallayın ve kağıda bastırın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.Ardından, çoğaltıcıyı izopropanole batırın, hafifçe sallayın ve kağıda bastırın. 96 oyuklu plakanın bir sonraki bloğuna geçmeden önce fan üzerindeki çoğaltıcıyı yaklaşık 20 saniye kurutun. İstenilen baskı sayısına devam edin.Ardından slaytların kurumasını bekleyin. Kurutulmuş slaytları yüzü yukarı bakacak şekilde 254 nanometre UV çapraz bağlayıcıda temiz bir yüzeye yerleştirin. Enerji seviyesini santimetre kare başına 999, 990 mikrojoule olarak ayarlayın ve ardından başlat düğmesine basın.Dizileri 450 mililitre bloke edici çözeltiye aktarın ve gece boyunca yavaş çalkalama altında manyetik bir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 500 mililitre damıtılmış suda, her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytları oda sıcaklığında 10 saniye boyunca bir mikrodizi santrifüjde santrifüj ederek kurutun.Dizileri altı aya kadar kuru ve karanlık bir yerde saklayın. Hibridizasyondan önce, slaytları kaynar suda durulayın ve santrifüjleme ile kurutun. Diziyi bir hibridizasyon kasetinin içine yerleştirin ve radyoaktif işaretli RNA örneğini yükleyin.Metin protokolüne göre maksimum tekrarlanabilirlik için numuneleri otomatik bir hibridizasyon-yıkama istasyonunda çalıştırın. Çalışmanın sonunda, slaytları santrifüjleme ile kurutun. Slaytları ince plastikle sarın.Ardından, slaytlarda radyoaktif sinyal olup olmadığını kontrol etmek için en hassas ayarında bir Geiger sayacı kullanın. Slaytları, sinyal gücüne bağlı olarak 10 ila 90 saat boyunca oda sıcaklığında bir pozlama kasetinde bir depolama fosfor ekranında maruz bırakın. Birkaç saatten birkaç güne kadar sürebilen maruz kalma süresi doğrudan dizi sinyaline bağlıdır.Geiger sayacındaki sayıları pozlama süresine çevirebilmek biraz pratik gerektirir. Bir fosfor görüntüleyici kullanarak slaydı 50 mikrometre çözünürlükte tarayın. Mikrodizi profil oluşturucu ile yükseltilmiş ücretsiz ImageJ yazılımını kullanarak her bir prob noktasındaki radyoaktivite yoğunluklarını ölçün ve arka planda çıkarın.Metin protokolüne göre ısı haritaları oluşturun. Burada gösterilen, taranan bakteri, fare ve insan makrodizileridir. M.smegmatis dizileri, fare ve insan için kullanılan 48 prob yerine sadece 43 prob kullanır.Sonuç olarak, bakteri dizisi arka planla karışan 40 boş nokta görüntüler. Üç bağımsız biyolojik replikasyon, test edilen büyüme koşulları altında, tüm M.smegmatis tRNA'larının arka plan seviyesinin üzerinde eksprese edildiğini göstermektedir. Bu özel deneyde, her prob için gözlemlenen standart sapma %2 Arginin TCT ile %22 Sistein GCA arasındadır ve medyan %5'tirEk olarak, bu deney, tRNA izoeseptörlerinin ekspresyonunun tek tip olmadığını göstermektedir.Örneğin, tüm Alanin izoalıcıları benzer seviyelerde ifade edilirken, en yüksek ve en düşük Arginin kabul eden tRNA'lar üç kat farklılık gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa ve nokta sinyali yeterliyse yaklaşık 24 saat içinde yapılabilir. Yöntemimiz, genomu prob tasarımı için mevcut olan herhangi bir organizmaya uygulanabilir.İn vitro olarak yetiştirilen model organizmalar, metabolik etiketleme için ideal adaylardır. Burada sunulan protokol Mycobacterium smegmatis için optimize edilmiştir, ancak aynı zamanda E.coli, maya, fareler ve insan kültürlenmiş hücrelerinde tRNA'nın profilini çıkarmak için de başarıyla kullanılmıştır. Tekniğimiz tekrarlanabilir ve spesifiktir.Geniş dinamik aralığı ve kolayca ayarlanabilen eşiği, polizomlarla ilişkili tRNA'lar gibi düşük miktarda bulunan türlerin, yalnızca diziye maruz kalma sürelerini uzatarak profillenmesine olanak tanır.

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

Bu protokolün amacı, in vitro, canlı memeli hücrelerinde ve üç boyutlu hücresel modellerde tekrarlanabilir RNA görüntüleme iş akışları için Riboglow problarının nicel floresans ömür ölçümünü sağlamaktır. Tarafsız floresan ömür ölçümlerini çıkarmak için örnek hazırlama, prob teslimatı, veri toplama ve nicel analiz iş akışlarını özetliyoruz.

Riboglow Problarının In Vitro Olarak Canlı Memeli Hücrelerinde Floresans Ömür Boyu Görüntülemenin Temeli Olarak Karakterize Edilmesi ve Üç Boyutlu Hücresel Modeller

Keşfedin, metabolik etiketleme ve makroarray analizi kullanarak tüm transfer RNA seviyelerini aynı anda ölçme yöntemini. Bu hızlı ve güvenilir teknik, protein sentezi dinamiklerini anlamak için araştırmacılara kapsamlı tRNA profilleme imkanı sunar.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Daha fazla video keşfet