Ipecac düğümler arası kültür sırasında endojen Auxin ve Cytokinin miktar

Bu prosedürün genel amacı, ipecac'ta adventif sürgün oluşumu sırasında endojen fitohormon seviyelerinin nasıl değiştiğini tanımlamaktır. Bu yöntem, bitki doku kültürü çarkındaki doku rejenerasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, endojen İndol-3-asetik asit seviyesidir ve sitokininler yüksek hassasiyetle basitçe analiz edilebilir.

Bu tekniğin anlamı, bitki dokusu dejenerasyonunun oluşumu boyunca uzanır, çünkü endojen fitohormon seviyesindeki değişiklikler adventif sürgün oluşumunu tetikler. Başlamak için, fitohormon içermeyen bir B5 ortamı hazırlayın ve yüzde 0,2 gellan sakızı ekleyin. Ardından, sterilize etmek için ortamı otoklavlayın.

Steril bir akrilik plaka üzerinde cerrahi bir neşter kullanarak, ipecac bitkiciklerinin sekiz milimetrelik internodal segmentlerini dilimleyin ve bunları ortama yerleştirin. Daha sonra, ipecac segmentlerini beş hafta boyunca 14 saatlik ışık, 10 saatlik karanlık döngüde metrekare başına 15 mikromol saniye altında 24 santigrat derecede kültürleyin. İpecac segmentlerini kültürledikten sonra, her segmentte bir ila dört arasındaki bölgeleri belirleyin.

Haftada bir kez, her bölgedeki maceracı sürgünlerin sayısını saymak için bir mikroskop kullanın. İlk olarak, dört adet iki mililitrelik numune tüpüne beş milimetrelik bir zirkonya boncuğu yerleştirin. Daha sonra, ipecac segmentlerini I'den IV'e kadar olan bölgelere kesmek için steril bir akrilik plaka üzerinde cerrahi bir neşter kullanın.Daha sonra her bölgeden sekiz segmenti bir numune tüpüne toplayın.

Numunelerin her birini tartın ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Ardından, donmuş numuneleri ezmek için boncuk bazlı bir homojenizatör kullanın. Numuneleri, her bir dahili öküz ve CK standardının 500 pikogramı ile asetonitrilin bir mililitresinde askıya almak için bir girdap karıştırıcı kullanın.

Numuneleri bir saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3500 G'de santrifüjleyin. Peletleri yüzde 80 asetal nitril içinde yüzde bir asetik asit ile yıkayın.

Ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanları birleştirmek için tek kullanımlık bir sınıf tüp kullanın. Kombine süpernatanıma yüzde bir asetik asit içeren 600 mikrolitre su ekleyin. Ardından asetal nitrili buharlaştırmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın.

Numune çözeltilerini ayrı ayrı dengelenmiş HLB kartuşlarına yükleyin. Ve kartuşları yüzde bir asetik asit içeren bir mililitre su ile yıkayın. Daha sonra tüm hormonları bir cam tüp içinde iki mililitre yüzde 80 asetil nitril ve yüzde bir asetik asit ile ima edin.

Bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak, yüzde bir asetik asit içeren suda ekstrakt elde etmek için asetal nitrili buharlaştırın. Numune çözeltilerini ayrı ayrı dengelenmiş MCX kartuşlarına yükleyin ve kartuşları bir mililitre su ile yüzde bir asetik asit ile yıkayın. Daha sonra, IAA'yı iki mililitre yüzde 30 asetal nitril ve yüzde bir asetik asit içeren bir cam tüpte ima edin.

Ardından kartuşları iki mililitre yüzde 80 asetal nitril ile yüzde bir asetik asit ile yıkayın. Daha sonra, kartuşları bir taslak haznesinde iki mililitre su ve bir mililitre su ile yüzde beş sulu amonyak ile yıkayın. CK'leri, bir taslak odasında yüzde beş sulu amonyak ile iki mililitre yüzde 60 asetal nitril içeren bir cam tüpte ima edin.

Ardından, her bir hormon fraksiyonunun çözücüsünü buharlaştırmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Numuneleri eksi otuz santigrat derecede LCMSMS analizine kadar karıştırın. İlk olarak, her bir hormon ekstraktını 600 mikrolitre metanol içeren bir tüpte çözün.

Daha sonra çözeltiyi vidalı bir toplam geri kazanım şişesine aktarın ve çözücüyü buharlaştırmak için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. IAA fraksiyonunu 20 mikrolitre yüzde 30 asetal nitril içinde ve CK fraksiyonlarını 20 mikrolitre suda yüzde bir asetik asit ile çözün. Daha sonra, numuneleri pozitif iyon modunda analiz etmek için bir HPLC sistemi ile donatılmış üçlü dört kutuplu bir MS sistemi kullanın.

Son olarak, CK seviyelerinde endojen IAA'yı, etiketlenmemiş döteryum etiket standartlarına göre rasyonun standart bir eğrisine karşı ölçün. Bu protokolde, adventif oluklardaki endojen oksidan sitokinin, beş hafta boyunca LCMSMS ile ölçüldü. İlk hafta, hiçbir maceracı oluk oluşmamıştı ve ilk küçük oluklar ikinci hafta boyunca ortaya çıktı.

Üçüncü ve dördüncü haftalarda, oluk sayısı çoğunlukla birinci ve ikinci vekillerde arttı. Beşinci hafta boyunca, oluk sayısı birinci bölgede yaklaşık yedi ve ikinci bölgede beş idi. Kültürden önce, IAA seviyesi birinci bölgede ikinci, üçüncü ve dördüncü bölgelere göre biraz daha yüksekti.

İlk hafta boyunca, IAA seviyesi dördüncü bölgede büyük ölçüde arttı ve bir, iki ve üçüncü bölgelerde biraz azaldı. Beş haftalık kültürde bir IAA konsantrasyon gradyanı ortaya çıktı. Birinci bölgeden dördüncü bölgeye yükselen seviyelerle.

Kültürden önce, CK'lerin çoğunun sadece eser seviyeleri vardı. İlk haftada, tZR seviyesi ikinci bölgede miligram başına 13.8 pikograma yükseldi. Ve üçüncü bölgede miligram başına 18.1 pikogram.

Buna karşılık, tZ, iP ve iPR seviyeleri kültür sırasında çok az değişti. Bu prosedürü denerken, endojen kısım hormonunun stabil olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu teknik, insan tarafından geliştirildikten sonra bitki doku kültürü alanında faaliyet gösteren araştırmacıların önünü açmaktadır.

Diğer organizmalarda maceracı oluşumu keşfetmek. Bu videoyu izledikten sonra, endojen İndol-3-asetik asit ve sitokininlerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.