İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

Bu protokolün genel amacı, insan yetişkin cilt fibroblastlarından yüksek verimli bir indüklenmiş nöron kültürü oluşturmaktır. Bu yöntem, hücrenin yaşını koruyan hasta tabanlı bir sinir sisteminin dejenerasyonuna izin verdiği için nörolojik bozukluklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, herhangi bir yaştaki insanlardan sadece 25 gün içinde çok standart ve verimli bir şekilde indüklenmiş nöronların üretilmesine izin vermesidir.

Hastalık modellemesi, toksikoloji, teşhis ve çok büyük ölçekte ilaç tarama testleri dahil olmak üzere çok çeşitli biyomedikal uygulamalara izin verir. Prosedürü göstermek, beyin antrenmanı yapılan birimde doktora öğrencisi olan Shelby ve laboratuvarımızda çalışan Karlonia olacak. Başlamak için, yetişkin insan dermal fibroblastlarını otomatik bir hücre çözme sistemi kullanarak çözün.

Hücre sayısını otomatik bir hücre sayacı ile saydıktan sonra, 10 mililitre fibroblast ortamı içeren T-75 şişesi başına iki yüz bin hücre tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte koruyun. Ertesi gün, eski besiyerini taze fibroblast besiyeri ile değiştirin.

Hücreler% 95 birleşmeye ulaşana kadar fibroblast ortamını her üç ila dört günde bir değiştirmeye devam edin. Yetişkin insan dermal fibroblastlarının yeniden programlanmasından bir saat önce, 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 250 mikrolitre% 0.1 jelatin ile kaplayın. Plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Fibroblast ortamını şişeden aspire edin ve Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu ile bir kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, hücreleri üç dakika boyunca 37 santigrat derecede T-75 şişesi başına 1.5 mililitre% 0.05 tripsin ile parçalayın. Ardından, tripsin çözeltisini nötralize etmek için üç mililitre fibroblast ortamı ekleyin.

Şişedeki hücreleri iki kez yıkayarak ayrılan hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte soğutun. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dışarı atın ve hücre peletini bir mililitre fibroblast ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, mililitre ortam başına 100.000 hücre elde etmek için 13.2 mililitre fibroblast ortamında 1.320.000 hücrelik bir hücresel süspansiyon hazırlayın. Jelatini plakadan aspire ettikten sonra, plakayı Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu ile iki kez yıkayın. Daha sonra oyukların her birine 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

13.2 mililitre fibroblast ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, lentiviral vektörü laminer başlıkta oda sıcaklığında çözün. Yetişkin insan dermal fibroblastlarını enfekte etmek için gerekli olan lentivirüs hacmini, herhangi bir transdüksiyon arttırıcı olmadan ortama 20 enfeksiyon çokluğunda ekleyin.

Daha sonra ortamı, lentiviral vektörün eklenmesiyle 500 mikrolitre fibroblast ortamı ile değiştirin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, lentivirüs içeren besiyerini lentiviral vektör içermeyen taze fibroblast besiyeri ile değiştirin.

Viral transdüksiyondan sonraki üçüncü günde, fibroblast ortamını çıkarın ve 500 mikrolitre erken nöronal dönüşüm ortamı ekleyin. Haftada iki veya üç kez, her kuyucuktan 225 mikrolitre eski besiyerini 250 mikrolitre taze erken nöronal dönüşüm ortamı ile değiştirin. Viral transdüksiyondan sonraki 18. günde, erken nöronal dönüşüm ortamını çıkarın ve 500 mikrolitre geç nöronal dönüşüm ortamı ile değiştirin.

Ortamı, 25. güne veya deneysel son noktaya kadar daha önce olduğu gibi her iki ila üç günde bir değiştirmeye devam edin. Ortamı çıkarmak için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra her bir oyuğa iki adet 250 mikrolitre hücre ayrıştırıcı ajan ekleyin ve hücreler ayrılıp tek hücreler olarak yüzene kadar plakayı inkübatörde 10 ila 20 dakika bırakın.

Bu arada, FACS tamponunu hazırlayın. 1000 mikrolitrelik bir pipetle ezin. Kalan hücre kümeleri varsa biraz daha uzun süre kuluçkaya yatırın.

Elde edilen tek hücreli süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kuyucukları geç nöronal dönüşüm ortamı ile iki kez yıkayın ve aynı 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Ardından, beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin ve süpernatenti atın.

Ardından, hücre peletini 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın. Yine, hücreleri beş dakika boyunca 400 G'de döndürün ve süpernatenti atın. Hücreleri FACS tamponunda ve santrifüjde yeniden askıya alın.

İki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, hücre peletini insan CD56 antikoru içeren 50 mikrolitre FACS tamponunda bir ila 50 konsantrasyonda 15 dakika boyunca buz üzerinde ışıktan uzakta yeniden askıya alın. Hücreleri beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin ve hücreleri yıkamak için hücre peletini 200 mikrolitre FACS tamponunda çözün.

Yine, hücreleri beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. FACS tamponu ile iki kez yıkayın, ardından santrifüjleyin. Son olarak, mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogram içeren 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

NCAM pozitif ve propidyum iyodür negatif hücreleri, NCAM antikoru veya propidyum iyodür ile boyanmamış kontrol numunelerinin floresan yoğunluk seviyesine göre geçit kullanarak sıralayın. Hücre sayısını saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın ve geç nöronal dönüşüm ortamına sahip bir Poli-L-ornitin fibronektin ve laminin kaplı plaka üzerinde santimetre kare başına 50.000 hücre tohumlayın. Deneysel son noktaya kadar geç nöronal dönüşüm ortamı ile ortamın yarısını haftada iki ila üç kez değiştirmeye devam edin.

Temsili faz kontrast görüntüleri, dönüşüm süresi boyunca hücrelerdeki morfolojik değişiklikleri gösterir. Hücresel morfolojide önemli bir dönüşüm beşinci günden itibaren görülebilir. 22. günde, hücrelerin yaklaşık yarısı nöronlara dönüşmüştür.

Temsili amino floresan görüntüleri, hücrelerde standart nöronal belirteçlerin varlığını gösterir. 25. güne kadar, hücreler nöronal morfoloji elde eder ve MAP2 ve TAU gibi nöronal belirteçleri eksprese eder. Çekirdekler DAPI ile boyanır.

Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin insan fibroblastlarından indüklenmiş nöronların nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ve bu, hücrelerin yeniden programlama, viral transdüksiyon, hücre bakımı ve saflaştırma için FACS sıralaması için kaplanmasını içerir. Bu tekniğin geliştirilmesi, nörolojik bozukluklar alanındaki araştırmacıların, hastalıkla ilişkili farklı özellikleri ve potansiyel tedavileri incelemelerinin yolunu açmaktadır.

Ve bu sadece bir insan sinir sistemi değil, aynı zamanda hem hastaya hem de hastalığa özgü olabilen bir sistemde yapılabilir.