Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Bu prosedürün genel amacı, protein agregatlarının prion benzeri yayılmasını in vivo olarak izlemektir. İzole hücre popülasyonlarında aynı proteinin çözünür bir versiyonunda agregasyona eğilimli bir proteini eksprese eden transgenik sineklerin kullanılması. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanlarındaki bir hücre biyolojisinde, protein agregat mitolojisi veya beyindeki hücreden hücreye diğer materyallerin nasıl aktarıldığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, sağlam bir merkezi sinir sisteminde bir hücre bölgesi opossumundan diğerine yayılan protein agregatının görüntülenmesine izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, Huntington hastalığı ve diğer prion benzeri nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için uzanır. Çünkü agregaların yayılması, bu ölümcül bozuklukların ilerlemesinin altında yatan yaygın bir mekanizma gibi görünmektedir.

Standart kültür koşullarını kullanarak, dokuya özgü Gal4 veya QF sürücüleri içeren transgenik drosophila melanogaster hatları oluşturun. Gal4-UAS veya QF-QUAS'ın akış aşağısında vahşi tip veya mutant huntingtin trans genleri içeren hatların yanı sıra. Arzu genotipinin döllerini toplayın ve incelemeye hazır olana kadar yaşlandırın.

Beyin diseksiyonuna hazırlanmak için, gerekli çözeltileri toplayın ve cam çok kuyulu tabak, pipet uçları ve bir çift forseps ile birlikte buz üzerinde soğutun. Daha sonra, yetişkin sinekleri karbondioksit kullanarak uyuşturun ve onları cam tabağın bir kuyusuna aktarın. Daha sonra, sineklerle birlikte kuyuya ve bitişik bir kuyuya yaklaşık yarım mililitre PBST ekleyin.

Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, tek bir sineğe odaklanın ve her iki taraftan da deveboynu ışıklarıyla aydınlatın. Ardından, diseksiyon aletlerini temizlemek için tabağın altına katlanmış bir doku yerleştirin. Şimdi, baskın olmayan eldeki üç numaralı forseps kullanarak, tek bir sineği PBST içeren kuyuya aktarın.

Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde karnını tutarak sineği hareketsiz hale getirin ve sineği tamamen suya batırın. Şimdi, hortumun bitişiğindeki küçük boşluğa kütikülün altına beş numaralı forsepsten bir çatal yerleştirin. Ardından, gözü her iki taraftan sıkıştırarak başın üzerindeki tutamağı sabitleyin ve kafayı ayırmak için forsepsleri ayırın.

Kafayı PBST'ye daldırırken sinek gövdesini katlanmış doku üzerine atın. Daha sonra, hortumun diğer tarafındaki aynı boşluğa üç numaralı forsepsten bir çatal yerleştirin ve beyni ortaya çıkarmak için kafa kütikülünü nazikçe ayırın. Devam etmeden önce, kütikül kalıntısını bir laboratuvar dokusu üzerine atın.

Kütikülü çıkarırken, forseps ile zarar vermemek için beyne doğrudan temas etmekten kaçının. Şimdi, disseke edilmiş beyni, ya bağlı bir trakeayı tutarak ya da kılcal hareket kullanarak forseps uçları arasındaki boşluğa aspire ederek PBST'den çıkarın. Daha sonra, sinek beynini buz üzerinde fiksatif çözelti içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Beynin forsepsten serbest kalmasını izlemek için dikkatlice gözlemleyin. Tüm beyinler diseke edildikten sonra, toplama tüpünü oda sıcaklığında bir nutatora aktarın ve yaklaşık beş dakika sarın. Fiksasyon süresinden sonra, fiksatif solüsyonun çoğunu bir p1000 pipeti kullanarak çıkarın ve beyinleri tüplerde bırakmaya çok dikkat ederek atın.

Bu, nazik emme ve dikkatli gözlem gerektirir. Ardından, beyinlere bir mililitre taze PBST ekleyin. Tüpü örtün ve kalan sabitleyiciyi yıkamak için yaklaşık bir dakika nutatör üzerinde sallanmasına izin verin.

Ardından solüsyonu çıkarın ve bu kısa yıkama adımını tekrarlayın. İki kısa yıkamayı beş dakikalık bir yıkama, ardından 20 dakikalık üç yıkama ve son olarak bir saatlik tek yıkama ile takip edin. Son yıkamadan sonra, PBST'nin çoğunu dikkatlice çıkarın ve beyinleri 30 mikrolitre gliserol bazlı antifade reaktifine batırın.

Daha sonra beyinleri karanlıkta 4 santigrat derecede bir ila 24 saat boyunca hareket etmeden kuluçkaya yatırın. Daha sonra, körelmiş bir pipet ucu kullanarak beyinleri toplama tüpünden çıkarın ve bunları bir mikroskop lamına aktarın. Ardından, forseps kullanarak görüntüleme için beyinleri gerektiği gibi nazikçe yönlendirin.

Birden fazla numune aynı kızağa ayrı sıralar halinde monte edilebilir. Ardından, katlanmış bir laboratuvar dokusunun köşesini kullanarak fazla antifade reaktifini slayttan çıkarın. Dokunun beyinle temas etmesine izin vermeyin.

Ardından, beynin slayta yapışmasını sağlamak için örnekleri beş ila 10 dakika karanlıkta bırakın. Daha sonra, kırık kapak camından küçük parçalar alın ve bunları yaklaşık 19 milimetre karelik bir alanı kaplayan beynin etrafına yerleştirin, ardından bir köprü montajı yapmak için 22 milimetre karelik bir kapak camını beyin ve cam mozaiğinin üzerine nazikçe indirin. Ardından, boş alanları doldurması için kapak fişinin altına taze antifade reaktifini yavaşça dağıtın.

Bunu çok dikkatli bir şekilde yapın, böylece beyin ve cam yerinde kalır. Ardından kapak fişini oje ile kapatın. İlk olarak, sadece köşelere uygulayın.

Kenarlar boyunca sızdırmazlığı tamamlamadan önce köşe lekelerinin beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin. Beyin mümkün olan en kısa sürede görüntülenmelidir. Trans genlerin ifade edildiği beyin bölgesinde Z dilimlerini toplamak için 40X veya 63X yağ objektifi ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak monte edilmiş beyinleri görüntüleyin.

Ardından, tek tek Z dilimlerindeki punktayı ölçerek veya alternatif olarak dilimleri üç boyutlu olarak oluşturduktan sonra verileri analiz edin. İyi ayrılmış ve çok az arka plan sinyaline sahip mutant huntingtin agregalarını ölçmek için, konfokal Z serisini 3D görüntüleme modunda açın. Ardından, seçici bir kanaldaki tek tek noktaları tanımlamak için analiz sihirbazını kullanın.

Ayarlarda, görüntüdeki tek tek nesneler olarak tüm heterojen boyutlu toplamaları doğru bir şekilde temsil etmek için eşiği ve filtreleri ayarlayın. Ardından, yakından ilişkili toplamaları ayırmak için ikili işleme ön filtresi altında nesneleri bölmeyi etkinleştirin. Yazılım tarafından tanımlanan nesnelerle ilgili nicel bilgiler, ölçümler altında raporlanır.

Punktaları saydıktan sonra, bunları görüntü analiz yazılımında daha fazla karakterize edin. Örneğin, agrega çapı, hacmi veya yoğunluğu hakkında bilgi edinmek için noktaların veya yüzeylerin ilgili ölçümlerini yapın. Bazı yabani tip av kalaylığı agregaları, Z yığını boyunca manuel olarak hareket ettirilerek ve çevredeki dağınık sinyalden ayırt edilebilen yeşil punktalar sayılarak ölçülebilir.

Birden fazla dilimde göründüklerinde tek agregaları iki kez saymaktan kaçınmaya dikkat edin. İlgilenilen bir diğer analiz, huntingtin Q25-YFP ve huntingtin Q91-mCherry agregaları arasındaki kolokalizasyon sıklığının belirlenmesidir. Bunu, konfokal bir Z yığını boyunca dilim dilim hareket ettirerek manuel sayma kullanarak yapın.

Genetik sürücülerin ve floresan protein trans gen füzyonlarının dikkatli bir şekilde seçilmesi, örtüşmeyen hücre popülasyonlarında mutant ve vahşi tip huntingtin proteinlerinin net bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Yabani tip huntingtin'in diffüzden punktata dönüşümü, donör koku alma reseptörü nöronlarındaki huntingtin Q91-mCherry ekspresyonunun bir sonucu olarak alıcı glia'daki YFP füzyon proteininin doğrudan floresansı ile gözlenir. Genetik sürücülerin ve floresan protein trans gen füzyonlarının dikkatli bir şekilde seçilmesi, örtüşmeyen hücre popülasyonlarında mutant ve vahşi tip huntingtin proteinlerinin net bir şekilde tespit edilmesini sağlar.

Mutant ve vahşi tip avcı agregaları, manuel olarak veya görüntü analiz yazılımı kullanılarak noktasal nesneler olarak ölçülebilir. Agregalar, popülasyonlar ve birlikte lokalizasyon sıklıkları açısından daha fazla ölçülebilir ve karakterize edilebilir. Co lokalize punkta, floresan protein füzyonlarının yakınlığını göstermek için floresan enerji rezonans transferi veya FRET ile daha fazla analiz edilebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, beyin diseksiyonu ve görüntüleme, uygun şekilde yapılırsa, sekiz saatten daha kısa bir sürede baştan sona yapılabilir. Bu prosedürü denerken, uygun kontrolleri kullanarak noktasal kümelenmiş nesneleri aynı dokudaki diğer floresan yapılardan dikkatlice ayırt etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedür, farklı hücre tipleri arasındaki agrega transferi için moleküler mekanizmaları belirlemek için gen yıkımı gibi diğer yöntemleri içerecek şekilde değiştirilebilir.

Teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.