Name: Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin, deterjan içermeyen hızlı yöntemle membran proteinlerini lipid çift katmanlarına nasıl yeniden yapılandıracağınızı. Füzyojenik proteolipozomlar kullanarak biyokimya ve biyofizikte çok bileşenli membran sistemleri oluşturun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar müteşekkir Robert Gennis Illinois Üniversitesi ve Christoph von Ballmoos Bern Üniversitesi için-mek şartıyla bir Plazmid ve bo3ifade etmek için büyük bir yük-oksidaz. Proje BBSRC tarafından desteklenen BB/L01985X/1 R.I. ve R.B. vermek

<ol><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Liposomes%2C+Pt+B%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31(2013).</li>
<li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li>
<li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/BFb0116295">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3750497/">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li>
<li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li>
<li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303(2014).</li>
<li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li>
<li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025(2016).</li>
<li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li>
<li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li>
<li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li>
<li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304(2013).</li>
<li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894(2014).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4083487">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li>
<li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li>
<li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+inactive%2C+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li>
<li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F%280%29+complexes+of+ATP+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li>
<li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+%26%2334%3Bwindow%26%2334%3B+between+gel+and+non-lamellar+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &#34;window&#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li>
<li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li>
<li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9624424">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li>
<li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li>
<li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayer+mixing%2C+fusion%2C+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li>
<li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li>
<li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+%28II%29%3A+a+method+of+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aşağıda bazı sorunlar bu deneysel yaklaşımın başarı için dikkat edilmesi gereken:
Seçim lipid ücretten proteoliposomes ve hedef bilayers için: Anyonik lipidler biyolojik membranlar, örneğin, ~ 25, 35 ve % 20'coli E. coli, plazma zarı S. cerevisiaeMaya ve mitokondriyal iç zarı iç zar ulaşan bol miktarda ise Katyonik lipidler doğada bulunmayan birçok tür, sırasıyla27,28,29. Membran proteinlerinin pl+ işlevselliğini Katyonik lipit bilayer ve dış iyonik göreli bir içeriğe göre sırayla değişir bilayer olumlu bir şarj gücü tarafından etkilenebilir beklemek mantıklı ol gücü. Bu nedenle, deneysel olarak ne ölçüde ilgi membran proteinlerinin işlevselliğini Katyonik lipit çevre şarjla bağlı olacaktır gidermek önemlidir. İşte, bu her iki F1Fo ATP sentaz ve bo3göstermektedir-oksidaz Katyonik lipit çevreye duyarlı, ama biz modüle ve ilk proteinler PL+ yerleştirip bunlara teslim bu etkiyi ters başardı Anyonik bilayers kabul ve sonra füzyon reaksiyonu orta iyonik gücü artan bitti.
Belirli bir Katyonik lipit seçimi: Çoğu ticari olarak mevcut Katyonik lipidler triacylglyceride sigara doğası vardır; Bu nedenle potansiyel bir aday lipid membran proteinlerinin ilgi ile uyumluluk için test edilmelidir. Biz daha önce15 etil-PC, doğal triacylglyceride lipidler DOTAP (sigara triacylglyceride içinde en yüksek yapısal benzerliği olan en iyi performansı pl+ oluşan bu çalışmada kullanılan ATP sentaz gösterdi bulundu lipid) PL+ bu protein daha az aktif.
Vezikül füzyon deneyleri: (İntravesicular sıvı içeriği karıştırdığında) doğru vezikül füzyon veziküller birbirine sulu içeriklerini karıştırma olmadan uygun, ancak kolayca onların dış veya her iki lipid içeriğini karıştırmak ara hemi-füzyon Amerika'dan ayrıştırılan gerekiyor 30broşürler. Suboptimal lipid karışımları veya belirli koşullar, veziküller belirgin sıvı içerik sızıntı füzyon31sırasında da göstermektedir. Asgari ücret lipidler fusogenic karışımlar gerçek fusion etkinleştirme konsantrasyonları her lipid türler için deneysel olarak bulunan gerekiyor, ancak genel olarak, bu membran ile az % 10 lipidler fusogenic 32işlenir ücret bulunur.
Bu hemen topaklanma ve lipidler agregasyon Bu iyonlar tarafından neden olabilir fusogenic SUV multi-valent iyonlarının varlığında şekillendirme sırasında karşılıklı şarj edilmiş bileşenleri karıştırmak değil önemlidir. Örneğin, SUV kobalt-calcein-EDTA yöntemi için hazırlarken, bu olmalı bileşenleri tarafından polikarbonat filtre tıkanma EDTA ile Katyonik lipit karışımı karıştırma önlemek önemlidir.
Kobalt-calcein-EDTA yöntemi, çok hassas ve gerçek zamanlı füzyon kontrolü, uygun olurken hala fusion 1 nedeniyle ölçüde hafife ki söz önemlidir) içinde ücretsiz calcein Floresan, kendi kendine Şoklama kendi kendine su verme eşik yaklaşık 20 µM33ve 2 rapor ederken 1 mM, ulaşması bekleniyor postfusion veziküller) yüzey bağlı kobalt-hangi bile jel-filtrasyon reçine geçtikten sonra SUV+ bağlı kalır calcein, ve SUV0 bir soluk portakal rengi varken veziküller parlak turuncu renk renkler. Ayrıca serbest bırakmak-in ilişkili kobalt calcein deterjan Triton X-100 EDTA huzurunda eklenmesi üzerine SUV0 (gri izle)'dan SUV+ (şekil 3 c, kırmızı izleme) için çok daha güçlü sinyaller oluşturur unutmayın.
Bakış açıları: Biz burada açıklanan hızlı yaklaşımlar büyük ölçüde kolaylaştırmak ve sentetik Biyoloji uygulamaları ortaya çıkan ihtiyaçları için karmaşık membranlar Meclisi hızlandırmak bekliyoruz. Bizim membran protein sulandırma Protokolü kırılgan büyük membran proteinlerinin sulandırma için sadece yarım saat bu fusogenic yaklaşım sadece teslim için 5-10 dakika sürer iken uzun sulandırma diyaliz tabanlı teknikleri için duyarlı olmak bilinen alır büyük lipid bilayers böyle protein. Burada, kırılgan bir protein örneği olan E. coli F1Fo ATP sentaz, manipüle ederek bu yaklaşımlar avantajları göstermektedir. 23 alt birimleri yapılır ve kolayca suboptimal koşulları (örneğin, ısı) sırasında/sonra solubilization maruz Eğer bütünlüğünü kaybedecek bilinen, ama bu yordamlarda kullanılan, protein proton pompalama tekrarlanarak yüksek etkinliğini göstermektedir.

Yapay lipid bilayers zar proteinleri ile functionalization Membran sistemleri modellemek Meclisi önemli bir adımdır. En basit modeli, proteoliposomes (PL), küçük (30-200 nm çapında) oluşur unilamellar veziküller (SUV, ayrıca denilen lipozomlar), protein ile onların membranlar entegre. PL geleneksel olarak kurulan iki içinde1adım. İlk, ön şekillendirilmesi SUV bir membran protein faiz ve onun kritik micelle konsantrasyonu (CMC) yukarıda bir konsantrasyon, bir deterjan ile karıştırılır. İkinci olarak, deterjan çeşitli diyaliz, "biyo-boncuk" veya jel filtrasyon teknikleri, membran protein bırakarak kaldırılır. İkinci yaklaşımı çok daha hızlı (~ 30 dk1) ve ilk iki yaklaşımlar ölçülmesinin birçok saat neden olabilir deterjan kaldırma hızı ile sınırlı iken bu nedenle kırılgan ve hassas membran proteinlerinin, sulandırma için tercih edilir bir etkinlik ve proteinlerin yapısal bütünlüğü kaybı önemli kaybı. Daha büyük bir functionalization veziküller (büyük unilamellar veziküller, LUV, 1 µm çapı kadar) bu yaklaşım tarafından mı daha zor, vezikül boyutu deterjan kaldırıldıktan sonra düşük olur ve dev unilamellar veziküller için mümkün değildir (Şef, > 1 µm), oldukları gibi Deterjanlar (ama görürsem Johnson ve ark. dengeleri bozdu 2 yavaş 2D-kristalleşme membran proteinlerinin büyük bilayers için). Şef membran functionalization3,4,5 için alternatif yaklaşımlar var ama zahmetli, zaman alıcı ve hala bazı deterjan CMC aşağıda konsantrasyonlarda gerektirir. Daha karmaşık veya kırılgan lipid modelleri (örneğin, damlacık hidrojel Bilayers6 ve 3D yazdırılabilir damlacık arabirimi Bilayer tabanlı yapay doku7) deterjanlar tahammül edemez. Hızlı bir şekilde sentetik Biyoloji uygulamaları8,ortaya çıkan9,10 , böyle karmaşık membran yapılar functionalization üzerinde eleştirel bağlıdır. Bu nedenle, bir kolay ve sağlam yöntemi membran proteinlerinin hızlı ve nazik teslimini hedef kırılgan bilayers içine sağlayan son derece alanında aranır.
Alternatif, deterjan-Alerjik protein teslim yöntemi vezikül fusion, nerede intravesicular sulu içeriklerini olmadan varlık serbest bırakmak dış karışık olsun iken etkileşen veziküller membranlar sağlam postfusion bilayer birleştirmek olduğunu çevre. Vezikül füzyon etkin ve temas içinde bulunan tamamlayıcı fusogenic ajanlar (bazı proteinler11,12 ve peptidler13 ya da özel olarak değiştirilmiş DNA14) içinde konformasyon düzenlemeler tarafından tahrik bilayers veya Coulombic lipid bilayers Hofstede tamamlayıcı dolu Anyonik ve Katyonik lipidler15,16, veya Katyonik bilayers ve olumsuz şarj edilmiş proteinlerin17kurdu.
Fusogenic ajanlar etkileşen membranlarda füzyon önce varlığı nispeten yavaş (~ 30 yarı-maksimum füzyon12,18ulaşmak için min) ama hem doğal ve yapay için uygulanabilir eski yaklaşım gerektirir membranlar.
Fusogenic lipidler (şekil 1) kullanarak yaklaşım bir avantajı çok daha hızlı membran füzyon (~ 1 yarı-maksimum ve reaksiyon bitirmek için 5-10 dk ulaşmak için min) sağlar olduğunu. Ayrıca, füzyon verdiği ölçüde kolay i) bir göreli içerik dolu lipidler fusogenic bilayers ve II) iyonik ve reaksiyon orta (tuzları, 50 mM ve örneğin, sukroz15 yukarıda genel, ozmotik gücünü formüle etmek tarafından kontrol edilebilir füzyon durdurmak için gösterilir), ya da her ikisinin bir birleşimi. Füzyon başlatmak için 5-10 dk için düşük (genellikle 10-20 mM tuz) iyonik gücü ortamda karşılıklı dolu fusogenic veziküller karıştırılır. Katyonik lipidler fusion, özellikle de düşük iyonik gücü, önce Katyonik proteoliposomes membran proteinlerinin işlevselliğini üzerinde olumsuz bir etkisi uygulamak ama bu etkiyi tersine çevrilebilir ve hafifletilmiş tarafından doğal bir yöntem göreli bir dezavantaj olduğunu lipid bileşimi sonrası füzyon membran ve onun dönüş normal iyonik gücü orta.

<table><tbody><tr><td>DOPC nötr lipid</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA anyonik lipid</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC katyonik lipid</td><td>Avanti Lipidleri</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Kolesteril-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Tip 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nijeris</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferaz</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biyoteknoloji</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrüzyon sistemi</td><td>Avanti Ekstruder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek tüplü luminometre, model Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat filtre, D19 mm</td><td>Sigma, Whatman NucleporeTrack-Kazınmış Membranlar</td><td>WHA800309,</td><td>SUV oluşturmak için 100 veya 200 nm ve LUV</td></tr> <tr><td>için 400 veya 800 nm WHA800284Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kağıtta kullanılan tamponlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Tampon B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Tampon C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4</td></tr><tr><td>Tampon D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7.4 Çeşitli KCl konsantrasyonları</td></tr></tbody></table>

deterjan-alerjik membran proteinlerinin ultrafast sulandırma tamamlayıcı-proteoliposomes ücret fusogenic kullanarak lipid bilayers içine.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Daha karmaşık, daha büyük modeli lipid bilayers deterjanlar ile daha az uyumlu iken deterjanlar 30-100 nm küçük unilamellar veziküller, içine zar proteinleri, teslimi için vazgeçilmezdir.
Burada ters bir membran protein ilgi taşıyan lipozomlar tahsil fusogenic kullanarak bu temel sınırlama yan yol için bir strateji tanımlarlar. Füzyon böyle veziküller arasında düşük iyonik gücü arabellekte 5 dk içinde oluşur. Pozitif yüklü fusogenic lipozomlar basit Servisi vektör olarak olumsuz ücret biomimetic hedef lipid bilayers içine zar proteinleri deterjan ücretsiz teslim etmek için kullanılabilir. Biz de zar proteinleri fusogenic proteoliposomes hızlı 30 dk protokolü ile içine yeniden oluşturmak nasıl gösterir.
Bu iki yaklaşım birleştirerek, biz iki membran proteinlerinin E. colidan oluşan bir elektron taşıma zinciri hızlı Meclisi göstermek, birincil bir proton pompa bo3-oksidaz ve F1Fo ATP sentaz, zarı veziküller 0.1 kadar irili ufaklı > ATP üretimi bu zinciri tarafından yanı sıra 10 mikron.

Fusogenic kullanımını tamamlayıcı-ücret proteoliposomes içine hedef bilayer membranları membran proteinlerinin hızlı deterjan ücretsiz teslim etmek için üç adım (şekil 1) içerir: A, fusogenic SUV lipid karışımları yüksek gelen oluşumu şarj edilmiş lipidler içeriğini; Bu SUV isteğe bağlı olarak intravesicular bir yük taşıyabilir; B, bizim hızlı membran protein sulandırma kullanarak PL içine fusogenic SUV dönüşüm; C, fusogenic PL ile hedef bilayers düşük tuz ortamda füzyonu füzyon reaksiyonu durdurmak için yüksek tuz ilavesi ile izledi. (D) büyük veziküller durumunda tercih edilebilir bir strateji membran protein membran proteinlerinin etkinlik için daha iyi bir lipid ortam sağlayan Anyonik hedef bilayer teslim etmektir (metin daha fazla tartışılan).
Şef oluşumu Protokolü ters emülsiyon yöntemi ile ayrıntılı olarak Şekil 2vurgulanır. Lipid-yağ karışımı nedeniyle nispeten yüksek hexadecane kullanmayı tercih kolay katılaşmış petrol sonra Şef peletleme izin verir (18 ° C) donma sıcaklığı.
Şekil 3 . sivilce füzyon kobalt-calcein-EDTA yöntemini kullanarak gösterir. Füzyon sadece tamamlayıcı dolu veziküller ise daha yüksek tuz konsantrasyonları düşük tuz arabellekleri kullanıldığında görülür (&gt; 50 mM14) ya da sigara fusogenic veziküller kullanımını gösteren hiçbir füzyon.
Membran proteinlerinin sulandırma fusogenic SUV içine hızlı bu protokolü şekil 4Agösterilmektedir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hızlı göstermek sulandırma birincil proton pompa bo3-oksidaz ve F1Fo ATP sentaz PL ve belirli faaliyetlerini bu membranlarda değerlendirilmesi. Protein sulandırma verimi kullanılan lipid15 şarjla bağlı değildir ve yaklaşık 50-u söz önemlidir25,12ve PL içine sulandırma sonra protein için en az üç saklanabilir ki gün, protein faaliyet bariz kaybı olmadan oda sıcaklığında bile. Bu yordam Ayrıca ATP sentaz, fazla % 95, hidrofilik yan F1 odaklı dışa doğru15,26bulunduğu tek yönlü yönlendirmesini sağlar.
Şekil 5 gösterir bu etkinlik F1Fo (Masası'nda) ve bo3pompalama proton-oksidaz (Masası B) Katyonik lipidler içinde azaltılmış ve Anyonik ve tarafsız lipid çevre, kıyasla düşük iyonik gücü duyarlı ama Bu etkiyi postfusion membranlar PL+ Anyonik LUV-ile eritme sonra hafifletilmiş.
Şekil 6 F1Fo ATP sentaz teslimini büyük veziküller zarı içine gösterir. Bu deney, PL+ ve 800 nm LUV- erimiş 20 mM KCl 5 min için ve reaksiyon ürünü unfused PL+kaldırmak için pelleted, resuspended ve proton pompalama için denetlesinler. Kontrol deneyleri hiçbir proton LUV0 yerine LUV- kullanılan füzyon reaksiyonu (siyah izle), veya boş LUV- yalnız bölümü (Mavi izle) pompalama gösterdi.
Hızlı işleyen bir elektron taşıma zinciri fusogenic PL aracılığıyla büyük veziküller membranlarda Meclisi Şekil 7' de gösterilmiştir. F1Fo SUV+ kullanılan ve bo3 SUV+ için füzyon ile 800 nm LUV-ve sırayla koenzim Q1 ve enerji için DTT ekleyerek bu zinciri postfusion veziküller içinde ATP üretimi gösterilmiştir membranlar ve fosfat ATP sentezi tarafından F1Fotetiklemek için ekleme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Şekil 1: ultrafast deterjan ücretsiz teslim membran proteinlerinin hedef lipid bilayers unilamellar veziküller füzyonu ile içine anlayışı oluşan tamamlayıcı dolu lipidler. İsteğe bağlı olarak intravesicular yükleri ile yüklü Anyonik ve Katyonik fusogenic küçük unilamellar veziküller (SUV+, SUV-)(a)oluşumu. (B) fusogenic SUV fusogenic proteoliposomes (PL) membran proteinlerinin sulandırma tarafından içine çevrimi. (C) deterjan-Alerjik membran proteinlerinin teslim postfusion membran fusogenic PL. (D) tercih strateji'membran proteinlerinin dır 100 nm PL+ arasında Fusion resimli büyük veziküller zarı içine içine ve 800 nm LUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Resim 2: bir ters emülsiyon yöntemi ile Şef oluşumu protokolü. (A)oluşumu bir lipid monolayer petrol-lipid karışımı ve su arasındaki sınırda. (B) bir ters (su, yağ) emülsiyon oluşumu. Santrifüjü aracılığıyla emülsiyon yağ-su sınır üzerinden geçirerek (C) Şef oluşumu. (D) Soğutma boru aşağıdaki &lt; kuvvetlendirmek ve petrol çıkarmak için 18 ° C. (E) A floresan mikroskobu görüntüsü onun membran (yeşil) ve vezikül'ın Lümen (kırmızı) içinde kutup fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) floresan lipid (%1 ağırlık kesir Kolesteril-Bodipy-FL12) içeren bir şef. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Şekil 3: Lipid veziküller füzyon kobalt-calcein-EDTA yöntemiyle okudu. (A)şeması yönteminin nerede ücretsiz calcein floresan kobalt-calcein kompleksi EDTA tarafından yayımlanır. (B) Fusion SUV çeşitli KCl konsantrasyonlarda. (C) serbest bırakmak-in postfusion veziküller B metinde açıklandığı gibi gösterildiği için EDTA ve Triton X-100 deterjan eklenmesi tarafından intravesicular calcein. Kırmızı iz için füzyon ölçüde (%) maksimal arka plan-düzeltilmiş füzyon sinyal bölünerek hesaplanır (1 - 2) ve 100 ile çarpımı aşağıdaki kapsüllenmiş calcein (3-2) sürümü arka plan-düzeltilmiş maksimal sinyal. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Şekil 4: Ultrafast sulandırma bo3-oksidaz ve F1Fo fusogenic proteoliposomes ve protein etkinlik ölçümler de böyle proteoliposomes. Sulandırma Protokolü'nün(a)şeması. (B) koenzim Q1 oksidasyon bo3tarafından Proton pompa tahrik-oksidaz pl ölçülen ACMA ile Şoklama (metin olarak açıklanmıştır). F1Fo pl tarafından pompa (C) ATP hidroliz tahrik proton (metin açıklanmıştır) ACMA Şoklama ile ölçülür. (D) ATP hidroliz F1Fo pl tarafından ATP rejenere sistemi (metin açıklanmıştır) ve onun stimülasyon uncoupler tarafından ölçülmüştür. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Şekil 5: lipid çevre ve iyonik gücü zar proteinleri etkinliği üzerindeki etkisi. Proton pompalama F1Fo (a)ve bo3-oksidaz (B) Katyonik PL (kırmızı izle), Anyonik PL (Mavi izle), nötr PL (siyah izleme) ve Katyonik PL erimiş Anyonik LUV (yeşil izle) 20 ve 100 mm KCl. denetim izleme () ile gri) proton pompalama F1tarafından karıştırma üzerine Fo PL- SUV-ile herhangi bir değişiklik gösterir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Şekil 6: F1Fo ATP sentaz teslim içine membranlar 800 nm LUV- yolu ile füzyon ile PL+. (A)şematik deneyin amacı: PL+ ve 800 nm LUV- 1 mm BEZLERİ (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl 5 kaldırmak için pelleted min için erimiş unfused PL ve aynı arabellekte resuspended. (B) Proton postfusion LUV (kırmızı izle) tarafından pompa. Kontrol deneyleri hiçbir ACMA PL0 ile LUV- (siyah izle), karışık veya boş LUV- yalnız bölümü (Mavi izle) Şoklama gösterdi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Şekil 7: 5-dak deterjan-Alerjik Meclisi bir elektron taşıma zinciri membranlarda 800 nm LUV- PL+ile füzyon yoluyla. (A)şematik deneyin amacı: 100 nm F1Fo PL+ ve 100 nm bo3-oksidaz PL+ şekil 6' da açıklandığı gibi LUV ile-, erimiş. Füzyon KCl ve SÜPÜRGEYİ 100 ve 50 mM için sırasıyla ekleyerek durduruldu. Membranlar ADP-biyoluminesans-luciferase kokteyl ile karışık ve buna ek olarak DTT ve Q1, tarafından metinde açıklandığı gibi enerjik. ATP üretimi 1 mM fosfat (Pben) ve metinde açıklandığı gibi luciferase-biyoluminesans sistemi ile izlenen gerçek zamanlı eklenmesi tarafından başlatıldı. (B) ATP sentezi postfusion veziküller (kırmızı izle) tarafından. Kontrol deneyleri hiçbir ATP üretim PL+ yüksek tuz (gri) LUV- ile karışık veya PL0 ile LUV- (siyah) karışık gösterdi. ATP sentezi oranı metin (Adım 8,8-8,9) açıklandığı şekilde hesaplanır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Uygulaması kolay prosedürümüzün genel amacı, zıt yüklü lipitlerden oluşan lipit çift tabakaları arasında füzyon kullanarak membran proteinlerinin çeşitli boyutlardaki lipit çift tabakalarına hızlı ve deterjansız bir şekilde verilmesini göstermektir. Metodolojimiz, biyokimya ve biyofizikte, tek tek katman bileşenlerinden biyomer metrik çok bileşenli lipid çift katmanlı sistemlerin tek adımlı montajı için kullanılabilir. Yaklaşımımızın avantajının, proteinler, lipitler ve diğer ilgili moleküllerle bu hızlı işlevselleştirmede veya yani karmaşık model lipid bilazda olduğunu belirtmek önemlidir.Bu metodoloji, lipid zarının enerjilendirilmesini gerektiren zar taşıma süreçlerini incelemek için de kullanılabilir. Örneğin, birincil pompalar, diğer membran proteinleri tarafından sağlanan ikincil taşımayı sağlamak için kullanılabilir. Yöntemimiz aynı zamanda sentetik biyoloji ihtiyaçlarına da hizmet edebilir.Örneğin, çeşitli program işlevlerine sahip zar vezikülleri oluşturmak için. Gelecekte, bunun gibi küçük vezikülleri benzer daha büyük olanların içine hapsetmek, belki de yapay bir hücre inşasına doğru bir adımdır. Lipid ve yağ çözeltisini oluşturmak için, Kloroform stoğunu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre hekzadekan ile karıştırın.Daha sonra, Kloroformu buharlaştırmak için, tüpü açık bırakarak karışımı 80 santigrat derecede yatay bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca sürekli karıştırın ve ısıtın. Buharlaştıktan sonra tüpü kapatın ve oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, lipid tek tabakasını oluşturmak için, yağ sulu tampon arayüzündeki lipidde, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpü alın ve 0.5 mililitre Tampon B'nin üzerine yağ çözeltisinde 200 mikrolitre lipid aktarın.Faz ayırma sınırının dışbükey şekli, yağ ve sulu tampon arasındaki yüzey gerilimi uyumsuzluğundan kaynaklanmaktadır. Daha sonra, su ve yağ emülsiyonunu hazırlamak için, Tampon B'de sudan daha yüksek bir yoğunluğa sahip iyonik olmayan bir poli sakkarit çözeltisini karıştırın. Daha sonra karışımın 0.5 mikrolitresini, yağ çözeltisinde 100 mikrolitre lipid içeren yeni bir 1.5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra karışımı ultra sonik bir su banyosunda 30 saniye boyunca 44 kilohertz ve 14 watt'ta sonikleştirin. Sonikasyondan sonra, yağ emülsiyonunda su oluşturmak için 45 dakika boyunca kuvvetlice girdap. Daha sonra, yağ emülsiyonundaki suyu anyonik GUV'ye dönüştürmek için emülsiyonu dikkatlice lipit ve yağ sulu arayüzünün üzerine aktarın.Emülsiyonda, her damlacık lipit tek tabakası ile kaplanır. Yağ emülsiyonunda suyun uygun sendikasyon girdaplanması, GUV oluşumunun başarısını belirler. Doğru şekilde oluşturulmazsa, emülsiyon damlacığı sırayla birleşerek GUV oluşumunun verimini azaltır.GUV peletini elde etmek için, numuneyi iki dakika boyunca 1000 kez G'de hızlı bir şekilde santrifüjleyin. Yağın içine oturacak şekilde boruya bükülmüş bir metal tel yerleştirin. Daha sonra lipit ve yağ karışımını katılaştırmak için tüpü buz üzerinde bırakın.Donmuş yağı dikkatlice çıkarın ve sulu fazı toplayın. Ardından, GUV peletini 50 mikrolitre taze Tampon B'de yeniden süspanse edin ve yeni bir tüpe aktarın. GUV'yi bir floresan mikroskobun 100 X yağ çıkarma objektifi altında inceleyin.Bir yerçekimi akış kolonu hazırlamak için jel filtrasyon reçinesi kullanın ve oda sıcaklığında tutulan Tampon A ile eşdeğerleyin. Daha sonra saflaştırılmış zar proteinini, ekstraksiyon tamponunu kullanarak mililitre başına 0.7 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, proteini önceden oluşturulmuş katyonik SUV ile bir ila 30 oranında karıştırın ve Tampon A içeren harmanlamayı 660 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar karıştırın.Ardından, numune tüpünü bir külbütör üzerine yerleştirin ve karışımı 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Daha sonra, karışımı jel filtrasyon reçinesinden geçirin ve bulanık proteolipozom fraksiyonlarını toplayın ve 15 dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, sulandırılmamış protein süpernatanını atın ve peleti bir mililitre taze Tampon A.In bir florometre küvetinde çözün, 0.5 mikromolar ACMA varlığında iki mililitre Tampon A ile birlikte B03 oksidaz ile 20 mikrolitre proteolipozom ekleyin ve 430 nanometre uyarılma ve 515 nanometre emisyonda kararlı sinyal bekleyin.Daha sonra küvete 40 mikromolar koenzim Q1 ekleyin. Daha sonra, proton pompalamaya başlamak için proteolipozoma iki milimolar DTT ekleyin ve ardından oluşan delta pH'ı dağıtın. Ayrı bir küvette, 0.5 mikromolar ACMA varlığında 2 mililitre Tampon A'ya F1-F0 ile 40 mikrolitre proteolipozom ekleyin ve proteolipozoma 0.2 milimolar ATP ekleyerek proton pompalamasını tetikleyin ve ardından oluşan delta pH'ı dağıtın.50 mikrolitre PL + 'yı 50 mikrolitre 800 nanometre LUV ile bir mililitre Tampon D içinde sigortalayın, bir milimolar Magnezyum Klorür ve 20 milimolar Potasyum Klorür ile beş dakika boyunca destekleyin. Ardından, füzyon sonrası LUV'yi peletlemek için numuneyi beş dakika boyunca 6.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, reaksiyona girmemiş PL+'dan oluşan süpernatanı atın, ardından bir milimolar Magnezyum Klorür ve 100 milimolar Potasyum Klorür ile desteklenmiş bir mililitre Tampon D'de oluşan peleti yeniden süspanse edin.Yine, ACM Söndürme Testini gerçekleştirin. İlk olarak, üç mikrolitre B03 oksidaz PL + ve beş mikrolitre F1F0 PL + karıştırın, ardından karışımı Tampon D'de üç mikrolitre LUV veya GUV-in 800 mikrolitre ile birleştirin, 20 milimolar Potasyum Klorür ve bir milimolar Magnezyum Klorür ile desteklenmiş beş dakika boyunca. Daha sonra, 150 milimolar nihai konsantrasyonda erimiş membran karışımına Potasyum Klorür ve Paspas Tamponu ekleyin.Bir lusiferin lusiferaz ADP kokteyli hazırlamak için 400 mikromolar ADP, 50 mikromolar lusiferin ve 2.5 lusiferazı 200 mikrolitre Tampon A'da karıştırın. Daha sonra kokteyli erimiş membran karışımına ekleyin. Doğru ADP sentezi ölçümü için, Q1 ve DTT eklenmeden önce yanlış pozitiften kaçınmak için kararlı bir lusiferaz sinyaline sahip olmak önemlidir.Daha sonra 40 mikromolar oksitlenmiş koenzim Q1 ekleyin ve ardından kaynaşmış zarın enerjilenmesini başlatmak için iki milimolar DTT ekleyin. Bir dakika sonra, ATP sentezini başlatmak için enerjili veziküllere beş milimolar Potasyum Fosfat çözeltisi ekleyin. Donmuş hekzadekanı lipid ve yağ karışımından çıkarırken yeniden askıya alınan GUV'yi incelemek için floresan mikroskobu kullanıldı.Elde edilen GUV görüntüleri, zarında floresan kolesterol biyopoti FL12'nin ve lümende polar bir florofor olan kendi kendine erodimin 101'in varlığını göstermektedir. Artan Potasyum Klorür konsantrasyonunda SUV'nin füzyonunu ölçmek için bir grafik çizildi. Grafik, 50 milimolar'ın üzerine çıkan Potasyum Klorür konsantrasyonu ile SUV lipid veziküllerinin füzyonunun azalmaya başladığını açıklamaktadır.Bununla birlikte, düşük Potasyum Klorür konsantrasyonunda, bir ila 20 milimolar arasında, tamamlayıcı yüklü veziküller birleşir. Daha sonra, koenzim Q1 substratının BO3 oksidaz meditasyonlu proton pompalama sürücü oksidasyonunu ölçmek için, ACMA Söndürme Testine dayalı bir grafik çizildi. Sonuçlar, bir birleştirici eklemenin, grafiğin Y ekseni boyunca temsil edilen ACMA Floresan sinyalini artırdığını göstermektedir.Daha sonra, F1F0 ile ATP hidrolizine bağlı proton pompalaması da ACMA Söndürme Testine dayalı olarak ölçüldü. Grafikte, bir birleştirici eklemenin AMCA Floresan sinyalini artırdığını göstermektedir. Ayrıca, kaynaşmış veziküllerde ATP sentezini izlemek için lusiferin lusiferaz sistemi kullanıldı.Koenzim Q1 DTT'nin sıralı ilavesi ve ardından Fosfat ilavesi, kaynaşmış veziküller tarafından başarılı ATP üretimini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, deterjanlardan, sembolize edilen zar proteinlerinden ve sendika miyomedikallerinden fusogentic proteolipozomun ilk teknik oluşumu sadece 30 dakika içinde yapılabilir. İkinci teknik olan fiziksel füzyon, sadece on dakika içinde daha da hızlı yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, işlevselleştirilmiş lipid vezikülleri tarafından sunulan çeşitli bireysel yapı taşlarını birleştirerek çok bileşenli membran sistemlerinin nasıl oluşturulabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Zar proteinlerinin bir adımda yeniden yapılandırılması ile imkansız olan temel özelliklerin ve işlevlerin bulunduğu bu tür modüler sistemler bekliyoruz. Genel olarak, prosedürlerimiz, biyo-tuğlalar olarak adlandırılan daha basit, bölümlere ayrılmış biyo-kimyasal sistemler oluşturmak için basit bir çerçeve sağlar.

detergent-free-ultrafast-reconstitution-membrane-proteins-into-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, sergi farklı özellikleri nedeniyle tek zincir amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren bu diacylphospholipids göre. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da bu amphiphiles bütün teknikleri açıklar.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Öğrenin, deterjan içermeyen hızlı yöntemle membran proteinlerini lipid çift katmanlarına nasıl yeniden yapılandıracağınızı. Füzyojenik proteolipozomlar kullanarak biyokimya ve biyofizikte çok bileşenli membran sistemleri oluşturun.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine. (Video) | JoVE Journal

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Daha fazla video keşfet