Name: Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, A431 hücreleri kullanarak hedef proteinlerdeki endojen translasyonel modifikasyonları tespit etmek için kapsamlı bir immunoprecipitation yöntemi. Bu teknik, deneyimsiz araştırmacıların da protein modifikasyonlarını kolayca incelemesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sitoiskeleti A.ş. araştırma bilim adamları ve Drs. Brian Hoover ve Ashley Davis onların eleştiri, düzenleme ve el yazması üzerine verimli tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca, biz Dr Robert Hom video el yazması üretimi sırasında yaptığı katkı için teşekkür ederim. Bu eser sitoiskeleti Inc. tarafından fon tarafından desteklenmiştir

1. örnek hazırlama: Hücre kültürü
<ol><li>Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş A431 hücrelerinin dört 150 mm plakalar büyümek.<ol>
<li>A431 hücreleri % 50 confluency için büyümek.</li>
		<li>Serum A431 hücre serum-Alerjik DMEM 24 h ile dört tabak kısıtlayın.</li>
		<li>1 h. bırakmak için tedavi edilmezse diğer iki tabak A431 hücreleri iki tabak 33,3 mg/mL epidermal büyüme faktörü ile tedavi. Not: Burada gösterilen hücre büyüme ve tedavi koşulları için bir örnek sağlar; Ancak, bu yöntem birçok farklı hücre tipleri ve tedavi koşulları geçerlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BlastR lizis ve seyreltme arabellekleri inhibitörleri (Tablo 1) ile hazırlayın. BlastR lizis arabelleği 2.895 mL tirozin fosfataz inhibitörü, deubiquitinase ve deSUMOylase inhibitörü, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörü 30 µL ve proteaz inhibitörü kokteyl 30 µL 30 µL 15 µL ile birleştirin.<ol>
<li>BlastR seyreltme arabelleği 9.65 mL tirozin fosfataz inhibitörü, deubiquitinase ve deSUMOylase inhibitörü, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörü 100 µL ve proteaz inhibitörü kokteyl 100 µL 100 µL 50 µL ile birleştirin. Not: Tablo reçetesi arabellek kompozisyon ve inhibitörü bilgiyle bakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür basına dökün ve hücreleri Buza koyun. Sonra iki kez 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 mL içeren hücreleri yıkayın.<ol>
<li>Hücre lizis en üst düzeye çıkarmak için blastR lizis tampon eklemeden önce mümkün olduğu kadar PBS kaldırın. Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BlastR lizis arabelleği her 150 mm plaka için 600 µL ekleyin. Arabellek miktarı beklenen protein verim (Tablo 2) dayanmaktadır.<ol>
<li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri parçalayıcı. Lysate nedeniyle nükleer lizis viskoz hale gelecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Snipped 1 mL pipet ucu içine yerleştirilen bir 15 mL toplama tüp (şekil 1) bir blastR filtre ham lysate aktarmak için kullanın. Burada, bir 15 mL Şahin tüp kullanılır.</li>
	<li>Sağlanan filtre pompası tamamen blastR filtre sıkıştırmak ve lysate akış herhangi bir kabarcıklar, dahil olmak üzere bir 15 mL tüp (şekil 1) aracılığıyla, toplamak için kullanın.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve 4 ° C'de 1 dk santrifüj lysate yaklaşık 10.000 x g de açıklık<ol>
<li>Süpernatant yeni bir 15 mL Şahin tüp aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Açıklanan seyreltik blastR seyreltme arabelleğe her 150 mm plaka için 3 mL son hacmi ile lysate. Son hacim beklenen protein verim (Tablo 2) temel alır. Not: Bu son arabellek oluşturma IP tepki sıkılık etkileyecek gibi önemli bir adımdır.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu (Bölüm 2) quantitate.</li>
</ol>2. protein Nefelometri tahlil
Not: protein Nefelometri belirlemek için bir standart Renkölçer protein Nefelometri tahlil kullanmaktadır. Burada, protein Nefelometri hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil kullanılarak belirlenir.
<ol><li>1 mL hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil reaktif her iki 1 mL cuvettes ekleyin.</li>
	<li>Mix 10 µL blastR lizis arabellek ve blastR seyreltme arabelleği bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp buz üzerinde 40 µL. Not: Bu boş protein örnek okumak için kullanılacaktır.</li>
	<li>20 µL lizis/seyreltme arabellek mix (Kimden adım 2.2) ilk küvet için iki ila üç kat ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın.</li>
	<li>20 µL seyreltilmiş hücre lysate (deneme) eklemek için ikinci küvet, yukarıdaki gibi karıştırma.</li>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.</li>
	<li>Boş Spektrofotometre ile lizis/seyreltme arabellek mix örnek (Kimden adım 2.3).</li>
	<li>Ölçmek Absorbans (Kimden adım 2.4) lysate örnek 600 nm.</li>
	<li>Lysate protein konsantrasyonu aşağıdaki gibi belirlemek; örnek OD600 x 5 okuma protein konsantrasyonu mg/ml = Not: OD 0,05 altına veya üstüne 0,5 protein tahlil doğrusal Aralık kapasite yakın okumaları. Okuma için > 0.5, örnekleri seyreltilmiş. Okuma için < 0,05, daha lysate hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil reaktif (en fazla 50 µL) eklenebilir. Spektrofotometre okuma mg/mL lysate protein konsantrasyonu için dönüştürmek için Tablo 3 çarpanları için görmek. Bir tabak içinde yetersiz protein Eğer 2 veya daha fazla tabak IP başına kullanmak için tavsiye edilir. Bu durumda, tabak dizi, orijinal 300 µL lizis arabelleği plakalar arasında aktarma hasat edilecek.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu dayanarak, seyreltik bir arabellek karışımı ile örnek (1 yarı blastR lizis: 4 parça blastR seyreltme) istenen son konsantrasyonu (genellikle 1 mg/mL).</li>
	<li>Ek aliquots hemen kullanılmaz örnekleri dondur.<ol>
<li>Örnekleri-70 ° C'de depolayın</li>
		<li>Bölüm 3'e geçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Immunoprecipitation (IP) tahlil
Not: Benzeşme boncuk konsantrasyonları, lysate konsantrasyonları ve kuluçka süreleri anahatları izlemeniz önerilir ve her hedef protein ve belirli PTM soruşturma için benzersiz olabilir.
<ol><li>UB benzeşme boncuk, pY benzeşme boncuk, SUMO 2/3 benzeşme boncuk ve Ac benzeşme boncuk boncuk tamamen tüp resuspended emin olmak için birkaç kez içeren stok reaktif tüpler tersine çevirin.</li>
	<li>Her IP tahlil için aliquot boncuk süspansiyon ayrı 1.5 mL microcentrifuge içine buz (IP tüp) tüpleri. Burada, 20 µL Ubikuitin benzeşme boncuk, phosphotyrosine benzeşme boncuk 30 µL, 40 µL SUMOylation 2/3 benzeşme boncuk veya 50 µL asetilasyon benzeşme boncuk bireysel 1.5 mL microcentrifuge tüpler buz ekleyin. Not: Tablo 4 boncuk süspansiyon her benzeşme boncuk için kullanmak için önerilen birim görmek.</li>
	<li>Ubiquitination IP kontrol boncuk ve IgG denetim boncuk boncuk tamamen tüp resuspended emin olmak için birkaç kez içeren stok reaktif tüpler tersine çevirin.</li>
	<li>Aliquot denetim boncuk non-spesifik bağlama (Denetim IP tüp) belirlemek için denetim tepki başına. Burada, 20 µL Ub denetim boncuk, pY denetim boncuk 30 µL, 40 µL SUMO 2/3 kontrol boncuk veya Ac denetim boncuk 50 µL bireysel 1.5 mL microcentrifuge tüpler buz ekleyin. Not: Tablo 4 boncuk süspansiyon benzeşme boncuk her türü için kullanılacak önerilen birim görmek.</li>
	<li>(Batı bir leke lysate denetim giriş olarak çalıştırmak için lysate 20 µL) küçük bir miktarda tasarruf. 5 x örnek arabelleği 5 µL ekleyin ve 5 min için 95 ° C'de kaynatın. Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.</li>
	<li>Her IP tüp ve denetim IP tüp lysate ekleyin. Burada, lysate 1 mg başına toplam 8 IP reaksiyonlar sonucu IP ve denetim reaksiyon kullanıldı. Not: bir başlangıç noktası olarak tahlil başına lysate 1.0 mg önerilir. Lysate gerekli olacak miktarda değiştirilmiş hedef protein bereket bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Tüpler için 2 h 4 ° C'de bitti sıra dönen platformda kuluçkaya. Burada, bir ATR tüp rotator 22 hızda kullanıldı.</li>
	<li>Santrifüjü 3000-5000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tarafından boncuk toplamak</li>
	<li>Kadar süpernatant mümkün olduğunca, boncuk bozmadan Aspire edin.</li>
	<li>1 mL blastR (inhibitörleri bu aşamada gerekli değildir) yıkama arabellek platformu dönen 4 ° c 5 min için boncuk yıkayın.</li>
	<li>Santrifüjü 3000-5000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tarafından boncuk toplamak</li>
	<li>Kadar süpernatant mümkün olduğunca, boncuk bozmadan Aspire edin.</li>
	<li>(Adım 3.10-3.12) yıkama adımı yineleyin iki kez daha.</li>
	<li>Son yıkama sonra tamamen arabellek süpernatant kaldırmak. Boncuk Pelet en az düzeyde kesintiye uğraması (%5 kaybı kadar) kabul edilir. Para cezası kullanarak Kaldır artık süpernatant ipucu yükleme protein taşıyordu.</li>
	<li>Boncuk elüsyon arabelleği 30 µL ekleyin ve hafifçe dokunarak/tüp tarafında flicking tarafından boncuk resuspend. Bir pipet bu aşamada kullanmayın. Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.</li>
	<li>5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Yavaşça her boncuk süspansiyon bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirildi bir 1.5 mL microcentrifuge spin sütun aktarın. Not: Bu kapalı transfer pipet ucu nazik transfer için sonunda makasla kesme için tavsiye edilir.</li>
	<li>9.000-10.000 x g IP örnek toplamak için oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>2-mercaptoethanol 2 µL her örnek için ekleyin ve iyice karıştırın. Not: Kapak kapatmak spin sütun dişlemek ve işlenmesi için toplama tüp kap için kullanma bu uygundur.</li>
	<li>Örnekleri 5 dk. toplamak örnek için 95 ° C su banyosunda Santrifüjü RT., 1 dk. için 10.000 x g de yanına koyun</li>
	<li>Gerekirse, örnekleri-70 ° C'de depolayın ve burada durdurmak veya SDS-sayfa, transfer ve western blot analizi (Bölüm 4) çalıştırmaya devam edin.</li>
</ol>4. Western Blot analizi: Protein ilgi tanımlaması
<ol><li>Sodyum Lauryl tarafından ayrı örnekleri polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) sülfat ve polivinilidin florid (PVDF) membran için standart laboratuvar protokolleri32göre transfer.</li>
	<li>Birincil bir antikor protein ilgi post-translationally değiştirilmiş sürümlerini algılamak için kullanır. Burada, PD-L1 antikor post-translationally değiştirilmiş PD-L1 algılamak için kullanıldı.</li>
	<li>Vericiyi Kemiluminesan algılama reaktif algılaması için kullanabilir. Not: Chemiluminescent reaktif bir HRP etiketli ikincil antikor birincil antikor tespit yetenekli ile birlikte kullanılmalıdır.</li>
	<li>2 mL mini gel ölçekli transfer membran (yaklaşık 8 x 7 cm) başına chemiluminescent reaktif hacmi kullanın.<ol>
<li>Kuluçka uygun ikincil antikor ile sonra (60dk, RT önerilir), leke 6 x 10 dk ara-20 (TBST) tris arabelleğe alınmış serum 30 mL yıkayın. Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.</li>
		<li>Kullanımdan hemen önce chemiluminescent Reaktif A 1 mL 1 mL chemiluminescent Reaktif B (bir 8 cm x 7 cm membran için yeterli) ile karıştırın.</li>
		<li>Chemiluminescent reaktif membran için ekleyin ve nazik RT 1-5 dk önce röntgen film ya da şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera görüntüleme kullanarak protein sinyali görselleştirme için sallanan ile kuluçkaya. Not: Kısa kuluçka süreleri chemiluminescent reaktif içinde son derece bol proteinler için gerekli olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27296530">The world of protein acetylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li>
<li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin modifications.</a> Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3996475/">The genesis of tyrosine phosphorylation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).</li>
<li>International Human Genome Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finishing+the+euchromatic+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finishing the euchromatic sequence of the human genome.</a> Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).</li>
<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+characterization+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).</li>
<li>Pellegrino, S., Altmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ubiquitin%2C+SUMO%2C+and+Poly%28ADP-Ribose%29+in+the+Cellular+Response+to+Genotoxic+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress.</a> Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).</li>
<li>Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+decorations%3A+post-translational+modifications+and+heart+disease+delineated+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics.</a> Genome Med. 5 (2), 20(2013).</li>
<li>Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxia%2C+dementia%2C+and+hypogonadotropism+caused+by+disordered+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination.</a> N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).</li>
<li>Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+rules%3A+regulatory+concepts+and+their+implication+in+neurologic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions.</a> Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).</li>
<li>Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+nuclear+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease.</a> Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transcription+factor+modifications+in+the+pathogenesis+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance.</a> Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).</li>
<li>West, A. C., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+emerging+HDAC+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment.</a> J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
<li>Gu, B., Zhu, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surf+the+post-translational+modification+network+of+p53+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Surf the post-translational modification network of p53 regulation.</a> Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+ubiquitination+meets+phosphorylation%3A+a+systems+biology+perspective+of+EGFR%2FMAPK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling.</a> Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
<li>Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+stimulates+the+epithelial+sodium+channel+by+reducing+its+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation.</a> J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+regulate+PKC+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation.</a> Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).</li>
<li>Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+program+FEN1+degradation+during+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression.</a> Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).</li>
<li>Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-acetyl+switch+in+PXR+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A SUMO-acetyl switch in PXR biology.</a> Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Siuti, N., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+protein+modifications+using+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry.</a> Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).</li>
<li>Mischerikow, N., Heck, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21246731">Targeted large-scale analysis of protein acetylation.</a> Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).</li>
<li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2%2F3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).</li>
<li>Emmerich, C. H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+methods+for+the+preservation%2C+capture+and+identification+of+ubiquitin+chains+and+ubiquitylated+proteins+by+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).</li>
<li>Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+proteins%3A+the+importance+of+lysis+buffer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice.</a> Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).</li>
<li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Regulatory+Posttranslational+Modifications+of+PD-L1%3A+A+Focus+on+Monoubiquitinaton%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton.</a> Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+toolset+to+identify+endogenous+post-translational+modifications+for+a+target+protein%3A+a+snapshot+of+the+EGFR+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway.</a> Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRF+phosphorylation+by+glycogen+synthase+kinase-3+promotes+axon+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+histone+post-translational+modifications%3A+emerging+issues+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects.</a> Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+combinatorial+histone+modifications+on+antibody+and+effector+protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition.</a> Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).</li>
<li>Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitination+and+Stabilization+of+PD-L1+by+CSN5%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5.</a> Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).</li>
<li>Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+method+to+measure+absolute+protein+phosphorylation+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries.</a> Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).</li>
<li>Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ubiquitin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying ubiquitin signaling.</a> Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).</li>
<li>Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+balance+between+phosphorylation+and+O-GlcNAc+glycosylation+of+Tau+proteins--a+role+in+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization.</a> Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).</li>
<li>Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Roles+of+Fructose%3A+Crosstalk+between+O-Linked+Glycosylation+and+Phosphorylation+of+Akt-TSC2-MTOR+Cell+Signaling+Cascade+in+Ovine+Trophectoderm+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells.</a> Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).</li>
<li>Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Cbl%2FSli-1+regulates+endocytic+sorting+and+ubiquitination+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor.</a> Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).</li>
<li>Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+at+K340+inhibits+tau+degradation+through+deregulating+its+phosphorylation+and+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).</li>
</ol>

H.H. ve al sitoiskeleti Inc km çalışanlarının sitoiskeleti Inc bir kurucusu vardır

Bir hedef protein PTM tarafından değiştirilip belirlemek için kullanılan ilk yaklaşımlar PTM antikor ile Batı leke ve ardından IP için hedef protein spesifik antikor kullanılarak yapılabilir (örn., Anti-asetil lizin), veya IP için PTM antikor kullanarak Hedef protein spesifik antikor30,31,33ile Batı leke izledi. Her iki yaklaşımın teorik olarak çalışırken, bir hedef protein özel antikor kullanan daha fazla potansiyel tuzaklar, antikor IP uyumlu olmayabilir veya büyük PTM değişiklikler hedef protein34 antikor tanıma ücreti engelleyebilir gibi vardır ,35. PTM benzeşme boncuk avantajı antikor veya bağlayıcı etki alanında özellikle ilgi PTM tanımak olduğunu; Böylece, hedef protein değişiklikler tanıma benzeşme boncuk tarafından değiştirmek gerekir değil. Örnek olarak, PD-L1 Ub burada açıklanan tekniği ile tespit edildi ve her iki endojen mono - ve poli-Ub görülmektedir (şekil 4). Son bir yayın tarafından Lim ve ark. vitro Ub teknikleri PD-L1 Ub araştırmak için kullanılmaktadır ve sonucu şekil 436sonuçlar çok benzer. İlginçtir ki, onlar da IP PD nerede Ub overexpressed ve MG-132 sinyal artırmak için eklendi L1 lysate, hücreden zenginleştirmek için PD-L1 antikor ile seslendirdi. Ub desen değil sağlam ve vitro Ub desen çok farklıdır. Hücre kültür modellerinde endojen PD-L1 Ub incelenmesi Lim ve arkgerçekleştirilmedi. onların hücre kültür ve vitro veri arasındaki farkı açıklamak için raporu.
Bir protein PTM tarafından değiştirilip soruşturma, düşük bereket ve geçici doğa37,38, nedeniyle zor olabilir ve genellikle IP üzerinden zenginleştirme gerektirir. PTMs etkili IP birkaç önemli adımlar ve Kimyasalları, lizis arabellekleri ve benzeşme Kimyasalları gibi duruma getirilmesi gerekir. Birden çok PTMs bir hedef protein araştıran, gerekli optimizasyonu olasılığı artar. Sağlam IP yeteneği, tek bir sistemde PTM algılama pY, SUMO 2/3, Ub ve Ac PTMs etkinleştirilirken tutar gibi blastR lizis sistemi kullanan bir kritik bu protokolü adımdır. Bu teknik zaman ve belirli hedef protein bu dört PTMs tarafından değiştirilir ve potansiyel olarak PTM çapraz karışma birden fazla lizis sistemi kullanılarak gerçekleştirilen PTM sonuçları karşılaştırarak göre daha iyi bir görüntü sağlar eğer belirlemek için gerekli kaynakları en iyi duruma getirir. Glikozilasyon gibi alternatif PTMs uyumlu blastR lizis sisteminin incelenmesi gerçekleştirildi; Ancak, bunu etraflıca PTMs tüm türleri için inceledi değil.
Bol genomik DNA kullanarak protein ölçümleri ile müdahale Renkölçer veya nanodrop yöntemleri, SDS Akrilamid jel proteinlerin geçiş etkiler ve protein ve benzeşme matris etkileşim IP deneyleri sırasında önlemek. Burada açıklanan yöntemi etkili başka bir kritik adım bu protokol genomik DNA kirlenme kaldırmak için özel bir filtre kullanır. Bu noktada vurgulamak için viskozite testleri blastR filtre işlemden önce ve sonra gerçekleştirilen ve yüksek viskozite su (veri gösterilmez) azalma viskozite için sonuçlar gösterdi. Bu değişikliği viskozite, neredeyse tüm genomik DNA çıkarmıştı gösterilen şekil 3, sonuçlarında tarafından desteklenmiştir. Yamultulmuş DNA (veri gösterilmez) filtre tarafından yakalanan değil gibi önemlisi, DNA bu yöntemle güdülmesini değil. Çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir, son derece tekrarlanabilir ve bu kesme yerine DNA kaldırır Bu sonication veya şırınga-DNA-kesme, gibi geleneksel yöntemler daha üstün bir araçtır. Ayrıca, geleneksel yöntemlerle29kullanarak ortaya çıkan protein lysate, aşağılamak değil. Filtre kullanan nerede etkili DNA dağılımı (Yani, Yamultma şırınga) birkaç dakika sürebilir ve DNA kirletici lysate içinde kalması gibi örnek heterojenite neden olabilir alternatif yöntemlere göre örnek başına 5-30 saniye sürer. Lysate öncesi ve sonrası blastR filtreleme geniş analizi gerçekleştirilmiş ve protein profil gözlemlenebilir hiçbir fark Coomassie, hedef özel Batı, veya toplam ve hedef özel PTM analizleri gözlenmiştir; Böylece, protein profil bütünlüğünü genomik DNA süzerek etkilenmiş olabileceğini değil. Sonuçta, bu filtre sistemi herhangi bir Batı veya nerede genomik DNA var ve protein analizi yorumu etkileyebilir IP uygulama için faydalıdır.
Yanlış negatif algılama kısmen benzeşme boncuk doygunluk, bağlama sitesi girişim veya PTM maskeleme için bağlı olabilir bu tekniği kullanmak için potansiyel olduğunu unutmamak gerekir. Örneğin, belirli hedef protein Ac çok düşük seviyelerde değiştirilebilir; Böylece, bu daha bol Ac-modified hedef proteinler tarafından doymuş pan-asetil lizin benzeşme boncuk tarafından izole değil. Devam eden çalışmalar bu protokol için kullanılan benzeşme reaktifler algılama sınırları değerlendirmek için gerçekleştirilir, ancak son yayınına bir çok sağlam algılama sınırı önerir. Verileri bu teknik teşhis edebilir 17 acetylated hedef protein molekülleri hücre31ücret olarak az gösterdi. Yine de, hücre gibi belirli koşullar özgüllük, belirli uyaranlara yanıt geçici PTMs yazın veya PTMs maskeleme protein etkileşim nedeniyle yanlış negatif sonuçlar tüm sonucu olabilir. Bu potansiyel tuzaklar bu tekniği yanı sıra çoğu PTM IP yöntemleri vardır. Böylece, birden fazla yaklaşımları kullanarak sonuçları onaylamak için tavsiye edilir.
Glikozilasyon ve fosforilasyon gibi değişiklikler benzer amino asitler39,40ve protein düzenleyen sırayla çalışmak gösterilmiştir ubiquitination ve fosforilasyon gibi diğer PTMs için rekabet gösterilmiştir 17,41işlev. Neuropathological protein Tau son iş PTM crosstalk, nereye gelişmiş Tau hiper-fosforilasyon ve Tau SUMOylation birbirimizi42önemi vurgulanır. Ayrıca, bu grup Tau SUMOylation Poli-Ub ve sonraki Tau bozulması, muhtemelen toplama için önde gelen engelledi olduğunu gösterdi. Bu da pek çok örnek düzenleyici PTM crosstalk biridir ve belgili tanımlık yarar bu tekniğin PTMs ve sağlık ve hastalığında anahtar protein düzenlenmesinde onların crosstalk önemini aydınlatmak için yardımcı olacaktır.

Sayede değişiklik eklendiğinde veya kaldırıldığında belirli bir şekilde bir protein için son derece düzenlenmiş değişiklik translasyonel modifikasyonlar (PTMs) vardır. PTMs çoğu zaman önemli ölçüde değiştirme protein yapısı, en dinamik, geçici değişiklikler ortak proteinler ve kayma Yerelleştirme ve sonuçta farklı işlevler1,2 gerçekleştirmek protein etkinleştirme , 3 , 4. PTMs onlar yaklaşık 30.000 gen Urun bir milyondan fazla proteoforms5,-6benzersiz protein formları (veya proteoforms) sayısını artırmak bol. PTMs belirlenmesi ve bir hedef protein üzerindeki etkileri tanımlama protein'ın fizyolojik ve patolojik işlevleri7,8,9,10anlama doğru önemlidir, 11,12,13,14. Tübülin, p53 ve epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) PTMs15,16,17düzenleyici rol aydınlatılmamıştır gibi select proteinler üzerinde çalışır. Bu çalışmalar, düzenleme, bu proteinler tarafından birden çok PTMs oluşur ve birçok durumda bu değişiklikleri belirli bir işlevi tanıtmak için konserde çalışma Aslında ortaya çıkardı. Yeni çalışmalar bu kooperatif ve negatif PTM crosstalk birkaç farklı proteinler18,19,20,21,22, oluşabilir göstermiştir 23,24,25. Ancak, protein çoğunluğu PTM profilleri farklı modeller ve benzersiz koşulları-si olmak kullanılmış çeşitli çalışmalardan inşa edilir. Bir sistemde birden çok PTMs araştırmak için en iyi duruma getirilmiş bir sistemine sahip bir hedef protein için potansiyel PTM crosstalk anlayış kazanmak son derece faydalı olacaktır.
PTMs tek bir sistemde soruşturma ile bir özel PTMs ayrı lizis arabellekleri kullanarak incelenmiştir mücadeledir. Örneğin, fosforilasyon veya ubiquitination araştırmalar için yaygın olarak kullanılan arabellekleri RIPA-NP-40 gibi kullanımı küçük Ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) ylation26gibi bir değişken PTM eğitimi için yetersiz olabilir. Ayrıca, Sigara denaturing arabellekleri protein etkileşimleri dissociating için yetersiz ve yanlış pozitif PTM kimlik27için yol açabilir. Proteinler tüm hücresel kompartmanlarda28üzerinden yalıtma önemli ölçüde daha iyi, çoğu protein etkileşimleri ayırmak ve PTM Birleşik, gibi alter proteaz yapılmasını engeller olarak PTMs bir denaturing lizis arabellekte soruşturma tercih edilen, olabilir deSUMOylases 26; Ancak, arabellek denaturing belirli benzeşme reaktifler Ubikuitin etki alanı tabanlı araçları27bağlama gibi bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Bir benzeşme reaktif uyumlu sisteme birden çok PTMs bir protein çalışmaya denaturing benzeri lizis sistemi geliştirme PTM crosstalk araştırmalar için son derece faydalı olacaktır.
Denaturing arabellek PTMs soruşturma için arabellekleri sigara denaturing anahtar avantajları olmasına rağmen onlar daha az yaygın olarak geleneksel protein deneyleri, önemli uyumsuzluk gibi onların önemli sakıncaları nedeniyle kullanılan genomik Deoksiribonükleik asit (DNA) kirlenme ve bozulma immunoprecipitation (IP) reaktifler29. Bu sakıncaları genişletilmiş hazırlama süresi ve potansiyel hasar hedef proteinler için genomik DNA kesme zaman neden olabilir. DNA yamultmak için iki yaygın olarak kullanılan yöntem şırınga lizis ve sonication29içerir. Her iki yöntem geniş optimizasyonu gerektirir ve genellikle hassas tekrarlanabilirlik eksikliği. Genomik DNA kaldırmak için alternatif yöntemler DNAses ilavesi içerir; Ancak, bu ek iyileştirme ve arabellek oluşturma değişiklikler gerektirebilir. Sonuçta, ne zaman lizis arabellekleri PTM araştırmalar için denaturing ile çalışma genomik DNA kirlenme kaldırmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem faydalı olacaktır.
Bu teknik yalıtmak ve daha iyi bir hedef protein için PTM crosstalk araştırmak için tek bir sistem içinde ubiquitination (Ub), tirozin fosforilasyon (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) ve asetilasyon (Ac) PTMs araştırmak için bir sistem geliştirmek için hedeftir. Bu PTM algılama sistemi hızla tek bir sistemde endojen PTM profil birkaç hedef proteinlerin araştırmak için kullanılmıştır. Yeni potansiyel crosstalk içgörü tanımlanmış30,31oldu. Genel olarak, burada açıklanan tekniği PTMs ve PTM araştırmak için mevcut yöntemler geliştirir üç farklı şekilde crosstalk: 1) benzersiz bir denaturing arabellek hala ile uyumlu olurken proteinler üzerinden tüm hücresel kompartmanlarda, yalıtan geliştirilmiştir PTM benzeşme reaktifler, 2) benzersiz filtre sistemi hızla genomik DNA kirlenme denatüre lysates ile yüksek tekrarlanabilirlik kaldırır ve hiçbir özel ekipman ve 3 gerektirir geliştirilmiştir) sağlam benzeşme boncuk, lizis sistemi ve inhibitör reaktifler uyumludur; Böylece, PTM zenginleştirme en üst düzeye çıkarmak ve verimli bir şekilde potansiyel crosstalk incelemek için bu dört PTMs bir hedef protein için yalıtım basitleştirme.

<table><tbody><tr><td><>Hücre lizisi/genomik DNA çıkarılması ve analizi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>ortak tampon</td><td></td><td>Tarifi: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4</td></tr><tr><td>BlastR lizis tamponu</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BLST01</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>Radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponu (RIPA)</td> <td>ortak tampon</td><td></td><td>Tarif: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodyum Deoksikolat, Igepal</td></tr><tr><td>Memeli protein ekstraksiyon reaktifi (mPER)</td> <td>Thermofisher</td><td>78503</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>İmmünopresipitasyon (IP) Lizis</td><td>Pierce</td><td>87787</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>%1 sodyum dodesil sülfat (SDS) denatüre edici tampon</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>Tarif: PBS, SDS, EDTA, EGTA</td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>Tarif: Tris-HCl, SDS, gliserol, bromofenol mavisi</td></tr><tr><td>BlastR seyreltme tamponu</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BDB01</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl Hücre</td><td>İskeleti A.Ş.</td><td>PIC02</td><td></td></tr><tr><td>N-Etilmaleimid (NEM) & N, N, N ve asal ;, N ve asal ;-Tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamin (TPEN)</td> <td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td></td><td></td>NEM09BB</tr><tr><td>Trichostatin A (TSA) & Nikotinamid</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>TSA01</td><td></td></tr><tr><td>Aktif Sodyum Ortovanadat (Na3VO 4)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>PYI01</td><td></td></tr><tr><td>hücre sıyırıcılar</td><td>Costar</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>BlastR Filtre</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>BLR02</td><td></td></tr><tr><td>BD İnsülin şırınga iğnesi</td><td>BD</td><td>08290-3284-11</td><td></td></tr><tr><td>sonikatör (Branson Sonifier)</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Kırmızı Gelişmiş Protein Reaktifi</td><td>Hücre İskeleti, Inc.</td><td>ADV02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL küvetler</td><td>Fisher</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre (Genesys20)</td><td>Thermofisher</td><td>4001</td><td>Protein konsantrasyonunu ölçmek için diğer spektrofotomerler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr><tr><td>1kb Deoksiribonükleik asit (DNA) merdiveni</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>DNA jel kutusu</td><td>Thermofisher</td><td>7312 B1A</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borat/EDTA (TBE) tampon</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>Tarifi: Tris-HCl, Borik Asit, EDTA</td></tr><<tr><td>güçlü>PTM İmmünopresipitasyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfotirozin boncuk</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>APY03-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>Ubikitinasyon boncuk</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>UBA01-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>SUMOylation 2/3 boncuk</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>ASM24-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>Asetilasyon boncuk</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>AAC04-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotirozin kontrol boncukları</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>CIG01-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>Ubikitinasyon kontrol boncukları</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>CUB02-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>SUMOylation 2/3 kontrol boncukları</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG01-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>Asetilasyon kontrol boncukları</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>CIG02-boncuk</td><td></td></tr><tr><td>BlastR yıkama tamponu</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>BWB02</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>Boncuk elüsyon tamponu</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BEB01</td><td>Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417</td><td>Diğer mikrosantrifüjler kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>tüp döndürücü</td><td>ATR</td><td>RKVSD</td><td>Diğer uçtan uca tüp döndürücüler kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>protein yükleme ipuçları</td><td>VWR</td><td>37001-150</td><td></td></tr><tr><td>spin sütunları</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>SPN22</td><td></td></tr><tr><td>ısı bloğu 95 &�; C</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>SDS-PAGE/Transfer/Batı analizi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x numune tamponu</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>tarifi: Bromofenol mavisi, ditiyotreitol (DTT), Gliserol, SDS, Tris-HCl</td></tr><tr><td>novex kama kuyusu %4-20 Tris-gly jeller</td><td>Invitrogen</td><td>XP04200BOX</td> Büyük <td>kama kuyuları, büyük hacimleri</td></tr> <tr>yüklemek için mükemmeldir<td>1x Çalışan tampon</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>tarifi: Tris-HCl, Glisin, SDS</td></tr><tr><td>seeblue protein merdiveni</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>elektroforez hücresi</td><td>Invitrogen</td><td>Xcell surelock elektroforez hücresi</td><td>Diğer elektroforez hücreleri kullanılabilir, ancak bunlar novex wedgewell jelleri ile uyumludur;</td></tr><tr><td>güç kaynağı</td><td>Biorad</td><td>PowerPac HC</td><td>Diğer güç kaynakları kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Transfer tamponu</td><td>ortak tampon</td><td></td><td>tarifi: Tris-HCl, glisin, metanol</td></tr><tr><td>Transfer hücresi</td><td>Biorad</td><td>mini trans-blot hücresi</td><td>Diğer transfer hücreleri kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Immobilon-P membranları (PVDF)</td> <td>millipore</td><td>IPVH 304F0</td><td></td></tr><tr><td>yağsız süt</td><td></td><td></td>, ara (TBST) ile Tris tamponlu salin 813503015095 <td></td>gelişirortak</tr> <tr><td></td><td>tampon</td><td></td><td>tarifi: Tris-HCl, NaCl, Tween 20</td></tr><tr><td>Kemilüminesan Tespit Reaktifi</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>CLRA/CLRB</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hücre büyümesi ve tedavisi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ATLAS</td><td>&nbsp; F-0500-A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü</td><td>Hücre İskeleti A.Ş.</td><td>CN02-A</td><td></td></tr><tr><td>150 mm hücre kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr></tbody></table>

bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Şimdi iyi takdir translasyonel modifikasyonlar (PTMs) protein yapısı ve fonksiyonu, hem fizyolojik ve patolojik olarak verilen protein rol için gerekli olabilir düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak. Zenginlik PTMs kez gerekli olduğunu ne zaman bir hedef protein PTM durumunu araştıran, çünkü PTMs çoğu kez geçici ve bolluk içinde nispeten düşük. Birçok tuzaklar bir hedef protein PTM için zenginleştirici zaman karşılaşılan arabellek uyumsuzluk gibi hedef protein antikoru değil IP uyumlu, PTM sinyal kaybı ve diğerleri. Zorluk derecesi asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon belirli hedef protein gibi birden çok PTMs soruşturma zaman büyütülmüş olduğunu. Bu PTMs bir arada eğitim-ebilmek var olmak gerekli, crosstalk PTMs arasında yaygın ve protein düzenlemesine yönelik kritik olduğu gibi. Çoğu zaman, bu PTMs farklı lizis arabelleklerindeki ve benzersiz inhibitörü besteleri ile devam etti. Basitleştirmek için benzersiz bir denaturing lizis sistemi bu etkili bir şekilde geliştirilmiştir yalıtır ve bu dört PTMs; korur Böylece, potansiyel crosstalk incelenmesi bir tek lizis sistemde etkinleştirme. Bir benzersiz filtre sistemi arabellekleri denaturing, sorunlu bir yan ürün olan genomik DNA'sı lysate, kirletici kaldırmak için geliştirilmiş. Her dört PTMs bir hedefleme sağlam benzeşme matrisler zenginleştirme ve algılama bu dört PTMs endojen durumlarında en üst düzeye çıkarmak için tampon sistemi ile uyum içinde geliştirilmiştir. Bu kapsamlı PTM algılama araç grubu bir protein bir veya daha fazla bu PTMs tarafından değiştirilir hakkında kritik bilgi alma işlemi basitleştirir.

Bu 4 PTMs etkili bir şekilde tespit ederek PTM crosstalk araştırmak için bu araçların kısmen benzersiz lizis tampon sistemi üzerinde bağımlı yeteneğidir. BlastR denaturing arabellek benzer şekilde diğer denaturing arabellekleri, protein tüm hücresel kompartmanlarda üzerinden tam protein profil (şekil 2A) sağlayan etkin bir şekilde izole ediyor. Ayrıca, son derece değişken PTM sinyalleri SUMO 2/3, hangi hızla radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) (şekil 2B) gibi sigara denaturing arabelleklerindeki azalır gibi korur. Önemlisi, ne zaman uygun şekilde seyreltilmiş, bu diğer denaturing arabellekleri (Örneğin, Laemmli arabellek) gibi benzeşme reaktifler bütünlüğünü etkilemez.
Denaturing arabellek ile çalışırken önemli bir engel etkili genomik DNA kirlenme kaldırmak için yeteneğidir. Viskozite azaltmak için geleneksel yöntemler kullanarak bir şırınga iğnesi veya örnek sonicating DNA kesme etmektir. Şekil 3A genomik DNA kirlenme A431 hücreye lysate tedaviden sonra BlastR filtre, şırınga iğne veya sonication gösterir. İşte durum böyle değil BlastR filtresini kullanarak genomik DNA'ın neredeyse tamamen kaldırılması bir geleneksel şırınga iğne veya sonication kullanarak. Genomik DNA kirlenme protein geçiş bir SDS-Akrilamid jel ile önemli ölçüde etkiler; Bununla birlikte, BlastR filtre ile tedavi uygun protein geçiş (şekil 3B) kaynaklanan genomik DNA kaldırır. Değiştirilmiş geçiş genomik DNA kirlenme tarafından neden Batı lekesi yorumlanması önemli ölçüde etkileyebilir; Örneğin, filtre uygulanmamış görülen lekeli EGFR desen lysate yanlış filtre uygulanmış örnek (şekil 3 c) göre artan ifadesi olarak yorumlanmalıdır.
Bu en iyi duruma getirilmiş PTM zenginleştirme ve algılama sistemi kullanarak, kimse hızla bir hedef protein bir tarafından değiştirilir ya da daha fazla soruşturma PTMs. PD-L1 PTM profil son zamanlarda bu tekniği kullanarak gerçekleştirilmiş ve sonuçları PD-L1 olduğunu gösterdi belirleyebilirsiniz ubiquitinated, acetylated ve tirozin fosforile yanıt olarak EGF (şekil 4). Önemlisi, bu veriler toplam PD-L1 tespit küçük bir yüzdesini temsil endojen PD-L1 PTM değişiklikleri bildirdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig1.jpg"> Şekil 1: lysate hücreden genomik DNA BlastR filtre ile filtre. (A) BlastR görüntü filtresi. (B) Lysate bir 15 mL toplama tüp yerleştirildi filtre yüklenir. (C) dalgıç şırınga yerleştirilir ve lysate sıkıştırma tarafından filtreden geçirilir. (D) herhangi bir kabarcık tam sıkıştırma yoluyla dahil olmak üzere lysate toplayın. (E) filtre lysate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig2.jpg"> Şekil 2: alternatif lizis arabellekleri BlastR lizis arabelleğe karşılaştırılması. Horita ve ark. adapte şekil 2A 2017. Biosci. Rep. 31 (A) A431 hücre lysed BlastR, RIPA, mPER, IP lizis, (% 1 SDS), Denaturing ve Laemmli lizis arabellekleri. Tüm denaturing lysates BlastR filtre kullanarak kaldırıldı genomik DNA vardı. Yalıtım membran, sitoplazmik, mitokondri, ve nükleer işaretleri proteinlerin kendi bölme işareti proteinler karşı antikor kullanarak tespit. (B) A431 hücre BlastR, RIPA ve % 1 SDS denaturing arabellek ile lysed. Lysates immunoprecipitated SUMO 2/3 veya kontrol IgG benzeşme boncuk ile vardı. Örnekleri SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve bir SUMO 2/3-horseradish peroksidaz (HRP) antikor kullanarak western blot tarafından analiz. Temsilcisi bağımsız deneyler gösterilir N≥3 engelliyor. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig3.jpg"> Şekil 3: BlastR lizis filtredir genomik DNA etkin. (A) A431 hücreleri ile denaturing lizis tampon lysed. Genomik DNA kaldırılır veya BlastR filtre, şırınga iğne veya sonication için 5, 10, 20 veya 30 saniye ile sheared. lysate % 2 etidyum bromür, özel Jel Elektroforez tarafından analiz edildi. (B) Lysate A431 hücrelerden lysed ile denaturing bir tampon ya filtresiz veya filtre BlastR filtre ile. Örnekleri SDS-sayfa ile ayrıldık ve Coomassie leke kullanarak görüntülenir. (C) yinelenen örnekleri b SDS-sayfa, PVDF için transfer ayrılmış ve EGFR protein bir EGFR antikor kullanılarak incelenmiştir. N ≥3 bağımsız deneyler üzerinden temsilcisi lekesi gösterilir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig4.jpg"> Şekil 4: PD-L1 translasyonel modifikasyonlar EGF kaynaklı olarak algılanmasını. Horita ve ark. adapte şekil 2017. neoplazi30(A). Serum sınırlı A431 hücreleri ya da unstimulated (UT) ya da bir saat önce BlastR lizis arabelleği ile lizis EGF ile uyarılmış. WCL PD-L1 düzeyleri (şerit 1,2) analiz edildi. Ubikuitin bağlama boncuk (UBA01) IP ubiquitinated proteinler (şerit 3,4) kullanılmıştır. Phosphotyrosine bağlama boncuk (APY03) IP tirozin fosforile proteinlerin (şerit 5,6) kullanılmıştır. SUMO 2/3 bağlama boncuk (ASM24) IP SUMOylated 2/3 proteinler (şerit 7,8) kullanılmıştır. Asetil lizin bağlaması boncuk (AAC01) acetylated IP proteinler (şerit 9,10) kullanılmıştır. Bağlama denetimi boncuk IgG IP non-spesifik proteinler için (şerit 11,12) kullanılmıştır. Örnekleri SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve PD-L1 antikor kullanarak western blot tarafından analiz. Temsil edici bir leke N ≥3 bağımsız deneyler üzerinden gösterilir. Beyaz Yıldız PD-L1 pY ve Ac protein bantlar vurgulamak için kullanılmıştır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">BlastR lizis arabellek için hesaplamaları</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>5.0 mL</td>
			<td>10.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BlastR lizis arabellek</td>
			<td>965 ΜL</td>
			<td>1930 ΜL</td>
			<td>4.825 mL</td>
			<td>9.650 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tirozin fosfataz inhibitörü</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>de-ubiquitinase/de-sumoylase inhibitörü</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HDAC inhibitörü</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteaz inhibitörü kokteyl</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">BlastR seyreltme arabellek için hesaplamaları</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>4.0 mL</td>
			<td>8.0 mL</td>
			<td>20.0 mL</td>
			<td>40.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BlastR lizis arabellek</td>
			<td>3,86 mL</td>
			<td>7,72 mL</td>
			<td>19.3 mL</td>
			<td>38,6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tirozin fosfataz inhibitörü</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>de-ubiquitinase/de-sumoylase inhibitörü</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HDAC inhibitörü</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteaz inhibitörü kokteyl</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Lizis ve seyreltme tampon hazırlama grafik. Hazırlarken bir verilen lizis ve seyreltme arabellek birim hücre lizis için arabelleği için eklemek için inhibitörleri konsantrasyonları sağlayan grafik.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plaka Protein içeriği</td>
			<td>Önerilen BlastR lizis arabellek birim</td>
			<td>Önerilen BlastR seyreltme arabellek birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; 1 mg</td>
			<td>Birden çok tabak protein birleştirmek</td>
			<td>1.5 mL son hacim yapmak</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-2 mg</td>
			<td>300 ΜL</td>
			<td>1.5 mL son hacim yapmak</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-4 mg</td>
			<td>600 ΜL</td>
			<td>3 mL son hacim yapmak</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-6 mg</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>4.5 mL son hacim yapmak</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: BlastR lizis/seyreltme arabellek grafik. Grafik sağlayan lizis ve seyreltme arabellek birimleri lysate edinirken önerilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre lysate hacmi 1 ml hassas kırmızı Protein tahlil reaktif (µL) eklendi</td>
			<td>OD600 okuma örnek ile kullanmak için çarpanı</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Mg/mL Spektrofotometre okuma dönüştürmek çarpanları Lysate. Grafik dönüştürme numaraları protein konsantrasyonu hesaplama ile Yardımcısı sağlamak.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>benzeşme boncuk</td>
			<td>boncuk Bulamaç/IP (mL) hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ubiquitination</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphotyrosine</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>SUMOylation 2/3</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asetilasyon</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denetim boncuk</td>
			<td>boncuk Bulamaç/IP (mL) hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ubiquitination denetim boncuk</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphotyrsoine denetim boncuk</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>SUMOylation 2/3 kontrol boncuk</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asetilasyon denetim boncuk</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Boncuk/IP grafik hacmi önerilir. Grafik sağlayan IP tepki kullanmak için benzeşme boncuk miktarda önerilir.

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Bu deneysel protokolün genel amacı, deneyimsiz PTM araştırmacılarının, hedef proteinlerinin tek bir kapsamlı sistem kullanarak bir veya daha fazla PTM tarafından endojen olarak modifiye edilip edilmediğini etkili bir şekilde belirlemelerini sağlamaktır. Bu yöntem, tek, basitleştirilmiş bir sistem kullanarak herhangi bir hedef protein için anahtar PTM'lerin ve potansiyel karışmanın tespit edilmesini sağlayarak translasyon sonrası modifikasyon alanına yönelik araştırmayı geliştirecektir. Bu tekniğin temel avantajı, PTM uzmanı olmayanların, bir proteinin model sistemlerinde bir veya daha fazla PTM tarafından endojen olarak modifiye edilip edilmediğini tespit edebilmesidir.Bu yöntem için ilk olarak birkaç hücre sinyal yolu için düzenleyici mekanizmaları incelerken fikrimiz vardı ve kullanıcı dostu kitlerimizin veya sistemlerimizin fosfo olmayan PTM'leri incelemek için gerçekten mevcut olmadığını keşfettik. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi A431 hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın. Ayrıca, inhibitörlerle seyreltme tamponlarında blaster lizisi hazırlayın.Kültür ortamını dökün ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra hücreleri 10 mililitre 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın. Hücre lizizini en üst düzeye çıkarmak için blaster lizis tamponu eklemeden önce mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.Her 150 milimetrelik plakaya 600 mikrolitre blaster lizis tamponu ekleyin. Tampon miktarı, beklenen protein verimine dayanmaktadır. Ardından, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri parçalayın.Lizat, nükleer lizis nedeniyle viskoz hale gelecektir. Ham lizatı 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir blaster filtresine aktarmak için kesilmiş bir milimetre pipet ucu kullanın. Blaster filtresini tamamen sıkıştırmak için verilen filtre pistonunu kullanın ve kabarcıklar da dahil olmak üzere lizat akışını 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.Basit, verimli blaster filtresi, diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerde görüldüğü gibi kesmek yerine genomik DNA'yı çıkarır. Arıtılmış lizatı blaster seyreltme tamponu ile her 150 milimetrelik plaka için üç mililitrelik bir nihai hacme seyreltin. Nihai hacim, beklenen protein verimine dayanmaktadır.Bu adım önemlidir, çünkü son tampon bileşimi amino çökeltme reaksiyonunun sıkılığını etkileyecektir. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi protein kantitasyon testini hazırlayın. Lizat numunesinin absorbansını 600 nanometrede ölçün ve protein konsantrasyonunu hesaplayın.Boncukların tüpte tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için stok reaktif tüpünü birkaç kez ters çevirin. Her IP tahlili için, boncuk süspansiyonunu buz üzerinde ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ayırın. Burada, tek tek mikro santrifüj tüplerine 20 mikrolitre ubikitin afinite boncuğu, 30 mikrolitre fosfotirozin afinite boncuğu, 40 mikrolitre SUMOilasyon 2/3 afinite boncuğu veya 50 mikrolitre asetilasyon afinite boncuğu ekleyin.Boncukların tüpte tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için ubikitinasyon IP kontrol boncukları ve IGG kontrol boncukları içeren stok reaktif tüplerini birkaç kez ters çevirin. Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için kontrol reaksiyonu başına kontrol boncuklarını alikotlayın. Burada, buz üzerindeki 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine 20 mikrolitre ubikitin kontrol boncuğu, 30 mikro litre fosfotirozin kontrol boncuğu, 40 mikrolitre SUMOilasyon 2/3 kontrol boncuğu veya 50 mikrolitre asetilasyon kontrol boncuğu ekleyin.Western blot giriş lizat kontrolü olarak çalıştırmak için 20 mikrolitre lizat kaydedin. Ayrılmış lizata beş mikrolitre 5x numune tamponu ekleyin ve 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Ardından, her bir IP tüpüne lizat ekleyin ve IP tüpünü kontrol edin.Burada, IP ve kontrol reaksiyonu başına bir miligram lizat kullanıldı ve toplam sekiz IP reaksiyonu ile sonuçlandı. tüpleri iki saat boyunca dört santigrat derecede bir uçta ve dönen platformda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boncukları dört santigrat derecede bir dakika boyunca üç ila 5.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.Boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğu kadar çok süpernatan aspire edin, ardından boncukları dört santigrat derece dönen bir platformda beş dakika boyunca bir mililitre blaster yıkama tamponunda yıkayın ve boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra, boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin ve yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Son yıkama ve santrifüjlemeden sonra, tampon süpernatantındaki çoğunluğu aspire edin, ardından ince delikli bir protein yükleme ucu kullanarak kalan süpernatanı çıkarın.Boncuk peletinin minimum düzeyde bozulması kabul edilebilir. PTM proteinlerinizin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için vuruş peletindeki bozulmayı en aza indirirken tüm yıkama tamponunun çıkarıldığından emin olun. Ardından, 30 mikrolitre boncuk elüsyon tamponu ekleyin ve tüpün kenarına hafifçe vurarak veya hafifçe vurarak boncukları yeniden süspanse edin.Bu aşamada pipet kullanmayın. Yeniden askıya alınan boncukları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Transfer pipeti ucunun ucunu kesin ve her bir boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj döndürme kolonuna nazikçe aktarın.IP örneğini toplamak için numuneyi oda sıcaklığında bir dakikadan dokuz ila 10.000 kez G arasında santrifüjleyin, ardından her numuneye iki mikrolitre 2-merkaptoetanol ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat derece su banyosuna koyun. İnkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi SDS PAGE, transfer ve western blot analizini çalıştırmaya devam edin. İşlenmemiş ve EGF ile muamele edilmiş A431 hücre lizatı, ubikitin, fosfotirozin, SUMO 2/3 ve asetil lizin afinite boncuklarına eklendi. PD-L1 proteininin EGF stimülasyonuna yanıt olarak bu dört PTM tarafından modifiye edilip edilmediğini belirlemek için western immunoblot analizi için bir PD-L1 antikoru kullanıldı.Burada gösterilen temsili sonuçlar, bu yöntemin PD-L1'in endojen PTM modifikasyonlarını etkili bir şekilde tanımladığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört ila 4 1/2 saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu kapsamlı PTM algılama sistemini kullanarak hedef proteininiz veya sinyal yolunuz için enojen PTM veya karışmayı nasıl tespit edeceğinizi iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.

utilizing-comprehensive-immunoprecipitation-enrichment-system-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Öğrenin, A431 hücreleri kullanarak hedef proteinlerdeki endojen translasyonel modifikasyonları tespit etmek için kapsamlı bir immunoprecipitation yöntemi. Bu teknik, deneyimsiz araştırmacıların da protein modifikasyonlarını kolayca incelemesini sağlar.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan (Video) | JoVE Journal

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Daha fazla video keşfet