Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Bu deneysel protokolün genel amacı, deneyimsiz PTM araştırmacılarının, hedef proteinlerinin tek bir kapsamlı sistem kullanarak bir veya daha fazla PTM tarafından endojen olarak modifiye edilip edilmediğini etkili bir şekilde belirlemelerini sağlamaktır. Bu yöntem, tek, basitleştirilmiş bir sistem kullanarak herhangi bir hedef protein için anahtar PTM'lerin ve potansiyel karışmanın tespit edilmesini sağlayarak translasyon sonrası modifikasyon alanına yönelik araştırmayı geliştirecektir. Bu tekniğin temel avantajı, PTM uzmanı olmayanların, bir proteinin model sistemlerinde bir veya daha fazla PTM tarafından endojen olarak modifiye edilip edilmediğini tespit edebilmesidir.

Bu yöntem için ilk olarak birkaç hücre sinyal yolu için düzenleyici mekanizmaları incelerken fikrimiz vardı ve kullanıcı dostu kitlerimizin veya sistemlerimizin fosfo olmayan PTM'leri incelemek için gerçekten mevcut olmadığını keşfettik. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi A431 hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın. Ayrıca, inhibitörlerle seyreltme tamponlarında blaster lizisi hazırlayın.

Kültür ortamını dökün ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra hücreleri 10 mililitre 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın. Hücre lizizini en üst düzeye çıkarmak için blaster lizis tamponu eklemeden önce mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.

Her 150 milimetrelik plakaya 600 mikrolitre blaster lizis tamponu ekleyin. Tampon miktarı, beklenen protein verimine dayanmaktadır. Ardından, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri parçalayın.

Lizat, nükleer lizis nedeniyle viskoz hale gelecektir. Ham lizatı 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir blaster filtresine aktarmak için kesilmiş bir milimetre pipet ucu kullanın. Blaster filtresini tamamen sıkıştırmak için verilen filtre pistonunu kullanın ve kabarcıklar da dahil olmak üzere lizat akışını 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Basit, verimli blaster filtresi, diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerde görüldüğü gibi kesmek yerine genomik DNA'yı çıkarır. Arıtılmış lizatı blaster seyreltme tamponu ile her 150 milimetrelik plaka için üç mililitrelik bir nihai hacme seyreltin. Nihai hacim, beklenen protein verimine dayanmaktadır.

Bu adım önemlidir, çünkü son tampon bileşimi amino çökeltme reaksiyonunun sıkılığını etkileyecektir. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi protein kantitasyon testini hazırlayın. Lizat numunesinin absorbansını 600 nanometrede ölçün ve protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Boncukların tüpte tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için stok reaktif tüpünü birkaç kez ters çevirin. Her IP tahlili için, boncuk süspansiyonunu buz üzerinde ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ayırın. Burada, tek tek mikro santrifüj tüplerine 20 mikrolitre ubikitin afinite boncuğu, 30 mikrolitre fosfotirozin afinite boncuğu, 40 mikrolitre SUMOilasyon 2/3 afinite boncuğu veya 50 mikrolitre asetilasyon afinite boncuğu ekleyin.

Boncukların tüpte tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için ubikitinasyon IP kontrol boncukları ve IGG kontrol boncukları içeren stok reaktif tüplerini birkaç kez ters çevirin. Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için kontrol reaksiyonu başına kontrol boncuklarını alikotlayın. Burada, buz üzerindeki 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine 20 mikrolitre ubikitin kontrol boncuğu, 30 mikro litre fosfotirozin kontrol boncuğu, 40 mikrolitre SUMOilasyon 2/3 kontrol boncuğu veya 50 mikrolitre asetilasyon kontrol boncuğu ekleyin.

Western blot giriş lizat kontrolü olarak çalıştırmak için 20 mikrolitre lizat kaydedin. Ayrılmış lizata beş mikrolitre 5x numune tamponu ekleyin ve 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Ardından, her bir IP tüpüne lizat ekleyin ve IP tüpünü kontrol edin.

Burada, IP ve kontrol reaksiyonu başına bir miligram lizat kullanıldı ve toplam sekiz IP reaksiyonu ile sonuçlandı. tüpleri iki saat boyunca dört santigrat derecede bir uçta ve dönen platformda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boncukları dört santigrat derecede bir dakika boyunca üç ila 5.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.

Boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğu kadar çok süpernatan aspire edin, ardından boncukları dört santigrat derece dönen bir platformda beş dakika boyunca bir mililitre blaster yıkama tamponunda yıkayın ve boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra, boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin ve yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Son yıkama ve santrifüjlemeden sonra, tampon süpernatantındaki çoğunluğu aspire edin, ardından ince delikli bir protein yükleme ucu kullanarak kalan süpernatanı çıkarın.

Boncuk peletinin minimum düzeyde bozulması kabul edilebilir. PTM proteinlerinizin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için vuruş peletindeki bozulmayı en aza indirirken tüm yıkama tamponunun çıkarıldığından emin olun. Ardından, 30 mikrolitre boncuk elüsyon tamponu ekleyin ve tüpün kenarına hafifçe vurarak veya hafifçe vurarak boncukları yeniden süspanse edin.

Bu aşamada pipet kullanmayın. Yeniden askıya alınan boncukları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Transfer pipeti ucunun ucunu kesin ve her bir boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj döndürme kolonuna nazikçe aktarın.

IP örneğini toplamak için numuneyi oda sıcaklığında bir dakikadan dokuz ila 10.000 kez G arasında santrifüjleyin, ardından her numuneye iki mikrolitre 2-merkaptoetanol ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat derece su banyosuna koyun. İnkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi SDS PAGE, transfer ve western blot analizini çalıştırmaya devam edin. İşlenmemiş ve EGF ile muamele edilmiş A431 hücre lizatı, ubikitin, fosfotirozin, SUMO 2/3 ve asetil lizin afinite boncuklarına eklendi. PD-L1 proteininin EGF stimülasyonuna yanıt olarak bu dört PTM tarafından modifiye edilip edilmediğini belirlemek için western immunoblot analizi için bir PD-L1 antikoru kullanıldı.

Burada gösterilen temsili sonuçlar, bu yöntemin PD-L1'in endojen PTM modifikasyonlarını etkili bir şekilde tanımladığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört ila 4 1/2 saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu kapsamlı PTM algılama sistemini kullanarak hedef proteininiz veya sinyal yolunuz için enojen PTM veya karışmayı nasıl tespit edeceğinizi iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.