Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Bu protokolün genel amacı, CRISPR/Cas9 transgenlerini hızlı ve verimli gen düzenleme için in vivo ve in vitro ortamdaki hücrelere aktarabilen, optimize edilmiş integraz eksik lentiviral vektörlerin üretimini ve potansiyel uygulamalarını tanımlamaktır. CRISPR/Cas, gen düzenleme ve manipülasyonu için oldukça verimli bir platformdur. Burada, CRISPR/Cas gen düzenleme araçlarının verimli bir şekilde aktarılması için yüksek konsantrasyonlu, optimize edilmiş integraz eksik lentiviral vektörlerin üretimine yönelik bir protokol taslağı sunulmaktadır.

Bu tekniğin, kültüre edilmiş hücrelerde ve post-mitotik nöronlarda oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. Konfluensleliğin ertesi gün %70 ile %80 arasına ulaşması için HEK-293T hücrelerini transfeksiyondan bir gün önce ekini yapın. Transfeksiyondan önce, kültür plaklarındaki eski medyumu aspire edin ve yeni hazırlanmış serumsuz medyum ekleyin.

15 santimetrelik bir kabı transfekte etmek için bir plazmit karışımı hazırlamak üzere, 15 mililitrelik konik bir tüpe dört plazmitin tamamını ekleyin. Ardından, plazmit karışımına 312.5 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ekleyin ve hacmi steril çift distile su ile 1.25 mililitreye tamamlayın. Vorteksleme yaparken, 2X BES tamponlu çözeltiden kademeli olarak damlalar eklemeye devam edin.

Ardından, karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Her bir 15 santimetrelik plağa damla damla 2,5 mililitre plazmit karışımı ekleyin. Sonra, plakları nazikçe çalkalayın ve %5 karbon dioksit içeren 37 derece Celsius sıcaklıkta iki ila üç saat boyunca inkübe edin.

Üç saat sonra, her plağa 2,5 mililitre %10 serum ekleyin ve gece boyunca inkübasyona devam edin. Her kültür kabına ekilen transfekte hücrelerden süpernatanı dikkatlice aspire etmek için 10 mililitrelik bir doku kültürü pipeti kullanın. Ardından, tüm süpernatanı 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde birleştirin.

Tüpü masaüstü santrifüje yerleştirin ve santrifüjleme işlemini başlatın. Ardından, süpernatantı 0,45 mikrometrelik bir vakum filtre ünitesinden süzün. Sükroz gradyanı ile katmanlar oluşturmak için konik ultrasantrifüj tüplerini farklı sükroz konsantrasyonlarıyla doldurun.

Virüs içeren süpernatantı sükroz gradyanına dikkatlice ekleyin. 100 mililitrelik viral süpernatant hacminin tamamını işlemek için her çevrimde altı ultrasentrifüj tüpü kullanın. Ardından, ultrasentrifüj tüplerini 1X PBS tamponu ile dengeleyin ve örnekleri 17 °C'de iki saat boyunca 70,000 g hızda santrifüjleyin.

Temiz tüplere %30 ve %60 sukroz fraksiyonlarını toplayın ve hacmi 100 mililitreye tamamlamak için soğuk 1X PBS tamponu ekleyin. Örnekleri pipetle birkaç kez çekip bırakarak karıştırın. Ardından, sukroz yastığını hazırlamak için 1X PBS çözeltisindeki 4 mililitre %20 sukrozun üzerine 20 ila 25 mililitre viral çözelti ekleyin.

Tüpler 3/4'ünden daha az doluysa, hacmi steril 1X PBS tamponu ile ayarlayın ve dengeleyin. Ardından, örnekleri 17 °C'de iki saat boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı dökün ve kalan sıvıyı tüpleri kağıt havlu üzerine ters çevirerek süzün.

Kalan son damlacıklar aspire edildikten sonra, virüsü içeren pelet yarı saydam bir nokta şeklinde hafifçe görünür hale gelir. Ardından, süspansiyonu pipetleme yöntemiyle iyice karıştırarak peleti 70 µL 1X PBS içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu tekrar başka bir tüpe aktarın ve peletin tamamen çözünmesi için iyice karıştırın.

Ardından, tüpü 50 µL soğuk 1X PBS tamponu ile tekrar durulayın ve karıştırın. Örnekleri bir masaüstü mikrosantrifüje yerleştirin ve 10,000 g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatanttan 10 µL'lik alikotları her bir taze mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve bunları -80 °C'de saklayın.

NIH AIDS aşı programı HIV-1 p24 antijen yakalama assay kiti talimatlarına göre, yüksek bağlama kapasiteli 96 kuyucuklu bir plakayı 1:1.500 dilüsyonda 100 µL monoklonal anti-p24 antikoru ile kaplayın. Plakayı 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakayı soğuk PBS içindeki %0,05 TWEEN-20 ile 200 µL miktarında üç kez yıkayın.

Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 µL %1 sığır serum albümini ile bloke edin. Ardından, plakayı soğuk PBS içinde 200 µL %0,05 TWEEN-20 ile üç kez yıkayın. Sonrasında, vektörü çift distile su ve Triton X-100 ile seyrelterek konsantre ve konsantre edilmemiş vektör örneklerini %10 nihai konsantrasyonda hazırlayın.

Ardından, mililitre başına beş nanogramdan başlayarak iki katlı seri dilüsyon kullanarak HIV-1 standartlarını hazırlayın. Konsantre ve konsantre edilmemiş vektör örneklerini dilüye ettikten sonra, bunları plakaya üç tekrarlı olarak pipetleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün plağı yıkayın, ardından her plağa 100 µL poliklonal tavşan anti-p24 antikoru ekleyin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.

Altı yıkama işleminden sonra, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca keçi anti-tavşan horseradish peroksidaz ile inkübe edin. Çoklu yıkama sonrası, plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca TMB peroksidaz substratı ile inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için normal hidroklorik asit ekleyin. Ve absorbansı, bir absorbans plaka okuyucu ile 450 nm'de okuyun.

Hücreleri altı kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Ertesi gün, hücreler %90 konfluense ulaştığında, bir ile 10 arasında belirlenmiş bir enfeksiyon multiplisitesi ile saflaştırılmış virüsle transduksiyon yapın.

Ardından, plakayı 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Bir ila yedi gün boyunca düzenli aralıklarla GFP sinyallerindeki farklılıkları kaydetmek için plakaları izleyin. Floresan mikroskobunda, uyarılma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 470 ve 525 nanometre olan GFP filtre seti ile GFP pozitif hücreleri arayın.

GFP pozitif ve negatif hücre popülasyonlarını ayırt etmek için transduksiyon uygulanmamış hücreleri kullanın. Pozitif mutasyona uğramış integraz klonunu gösteren temsili agaroz jel. Kırmızı kesikli kutu içindeki EcoRV ve SPH1 restriksiyon enzimleri ile çift sindirilmiş klon, mutasyona uğramış integraz klonunu temsil eder.

Klon, 64. pozisyondaki aspartik asidin glutamik aside mutasyonu kontrol edilmek üzere daha ileri düzeyde sekanslandı. p24 ELISA analizi için, siyah çubukla gösterilen SP1-integraz-eksik lentiviral vektör CRISPR/Cas9 ve beyaz çubukla gösterilen SP1-integrasyon-yetkin lentiviral vektörler CRISPR/Cas9'un viral titrelerini betimleyen temsili bir sütun grafiği sunulmuştur. Sütun grafiği, integraz-eksik ve yetkin viral titrelerin 1 × 10 aralığında olduğunu göstermektedir. Sütun grafikleri, mililitre başına düşen viral partikül kopya sayısını temsil etmektedir.

Viral işlem altındaki GFP pozitif hücrelerin ortalama floresan yoğunluğunu gösteren temsili floresan görüntüler. Hücreler, entegrasyon yeteneğine sahip lentiviral vektör CRISPR veya integraz eksik lentiviral vektör CRISPR viral bileşenleri ile transduce edilmiştir.

İntegraz yetkin veya yetersiz lentiviral bileşenlerin transdüksiyonundan sonra, transdüksiyon yapılmamış kontrol hücrelerine kıyasla, sırasıyla bir ve beş enfeksiyon kat sayısında GFP sinyalinde keskin bir azalma gözlemlenmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, integraz yetersiz lentiviral vektörlerin bir genom düzenleme aracını geçici olarak iletebilme yeteneğinden kaynaklanmakta olup, bu durum özgüllüğü ve güvenliği önemli ölçüde artırmaktadır. Doğru şekilde yürütüldüğünde, protokollerin tamamlanması bir hafta sürmelidir.

Bu protokol uygulandığında, mL başına 10⁹ ile 10¹⁰ viral genom aralığında, yüksek konsantrasyona sahip lentiviral vektörler elde edilmesi beklenmelidir.