Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Bu agregasyon testinin genel amacı, Notch reseptörünün trans-ligandlarla bağlanmasını ve cis-ligandlar tarafından inhibisyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir: Genetik veya farmakolojik faktör, Notch reseptörünün ligandına bağlanmasını nasıl etkileyecek ve sinyalizasyonu nasıl değiştirecektir? Bu tekniğin temel avantajı, Notch reseptörünün ligandı ile trans ve cis bağlanmasını değerlendirmeye izin vermesidir.

İlginç bir şekilde, endojen ligandın örtüşen etkisini içermeden. Değerlendirmeye, sinyal alıcı hücreleri döndürerek ve bunları Schneider's Medium'da yeniden askıya alarak başlayın. Bir hematitometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.

Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda beş kez 10 ila beşinci S2 ve stabil S2-Çentik hücreleri, Schneider Ortamının oyuğu başına bir mililitre içinde. Daha sonra, her bir oyuğa 7.5 mikrogram çift sarmallı RNA ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Notch ekspresyonunu indüklemek için 0.7 milimolar bakır sülfat ekleyin ve hücreleri üç gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, sinyal gönderen hücreleri bir hematitometre kullanarak manuel olarak sayın. Ve altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 10 ila altıncı kararlı hücrelere, takviye edilmiş Schneider Medium'un oyuğu başına bir mililitre olarak beş kez plaka. Daha sonra ligandların ekspresyonunu indüklemek için 0.7 milimolar bakır sülfat ekleyin ve hücreleri üç saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Çift sarmallı RNA ile muamele edilmiş S2 kontrol ve S2 Çentik hücrelerini nazik pipetleme ile hasat edin. Ve 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 10 ila beşinci hücreye 2,5 kez plaka. Beşinci kararlı S2-Delta veya S2-Serrate Domates hücrelerine beş kez 10 ekleyin, toplam 200 mikrolitre takviye edilmiş Schneider Ortamı hacmine ekleyin.

Plakayı 150 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra, her bir kuyucuğun içeriğini karıştırın ve agrega sayısını saymak için 20 mikrolitre çıkarın. Eşzamanlı olarak, 10x büyütme kullanarak ters çevrilmiş bir bileşik mikroskop altında temsili bir görüntü alın.

Hücreleri görselleştirmek için kamerayı mikroskoba yerleştirin ve görüntüyü elde etmek için yazılıma bağlanın. Bir hematitometre kullanarak agregaları manuel olarak sayın. Plakayı çalkalayıcının üzerine yerleştirin.

Beş dakika ve 15 dakikalık toplamadan sonra görüntü alma ve sayma işlemini tekrarlayın. Arka plan kontrolü olarak S2 hücreleri ile S2-Delta veya S2-Tırtıklı Domates hücreleri arasındaki mililitre başına agrega sayısını ve S2-Çentik ile S2-Delta veya S2-Tırtıklı Domates hücreleri arasında mililitre başına agrega sayısını hesaplayarak trans-bağlama miktar tayini gerçekleştirin. Sinyal alıcı hücreleri, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda beş kez 10 ila beşinci S2 hücresini, takviye edilmiş Schneider Ortamının oyuğu başına bir mililitre olarak kaplayarak hazırlayın.

Her oyuğa 7.5 mikrogram çift sarmallı RNA ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, çift sarmallı RNA ile muamele edilmiş hücreleri, ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanarak oyuk başına toplam iki mikrogramlık bir DNA konsantrasyonu için birlikte transfekte edin. Geçici olarak transfekte edilmiş S2 hücrelerini 24 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, Notch ve ligandların ekspresyonunu indüklemek için 0.7 milimolar bakır sülfat ekleyin ve üç gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Sinyal gönderen hücreleri önceki bölümde açıklandığı gibi hazırlayın. Ve son olarak, daha önce açıklandığı gibi sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasında toplama gerçekleştirin.

Agrega sayısında bir ila beş dakika arasında keskin bir artış gözlendi. Daha sonra agrega sayısı daha yavaş bir oranda 30 dakikaya kadar artmaya devam etti. Üç zaman noktasında agregasyonu gösteren görüntüler, EGFP çift sarmallı RNA ile muamele edilmiş S2-Notch hücrelerinin, zamanla sayıları artan S2-Delta hücreleri ile agregalar oluşturduğunu göstermektedir.

Buna karşılık, shamlar ve çift sarmallı RNA ile muamele edilmiş S2-Notch hücreleri, agregaları daha hızlı oluşturdu ve agregalar daha büyük ve sayıca daha fazlaydı. Azalan sahte seviyelerin Notch'un Delta ile trans-bağlanmasını arttırdığını gösteriyor. Eşit miktarda Notch ve Delta ekspresyon yapılarının S2 hücrelerine dönüştürülmesi, bu hücreler ve S2-Delta hücreleri arasında oluşan agregaların sayısını önemli ölçüde azaltır.

Ayrıca, cis-Delta miktarının azalması, agrega sayısında bir artışa neden olur. Bu tahlillerde kullanılan Notch/cis-Delta oranları aralığında, cis-Delta'nın Notch ve trans-Delta arasındaki bağlanmayı doza bağlı bir şekilde inhibe edebileceğini gösterir. Bağıl agregasyonun nicelleştirilmesi, EGFP ve shams çift sarmallı RNA tedavisi üzerine karşılaştırılabilir bir agregasyon inhibisyonu gösterdi.

Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, bu test basittir ve birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir.