Name: Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin Drosophila Notch reseptörünün trans-ligandlara bağlanmasını ve cis-ligandlar tarafından inhibisyonunu değerlendirmek için hücre toplama deneylerini. Bu yöntem genetik ve farmakolojik faktörlerin etkisini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar NIH/NIGMS destek kabul (HJN R01GM084135) ve Glycoscience (hibe #110071 HJN) ve are minnettar Tom V. Lee için tartışma ve öneriler deneyleri, Mizutani Vakfı ve Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine ve Plazmidler ve hücre hatları için Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC).

1. Şems nakavt için çift telli RNA (dsRNA) hazırlanması
<ol>
	<li>PCR güçlendirme ürünleri
	<ol>
		<li>Vahşi tipi sarı beyaz (y w) genomik DNA ve pAc5.1-EGFP dsRNA sentezinde kullanılan DNA parçalarının yükseltmek için şablon ve aşağıdaki astar çiftleri kullanın. Aşağıdaki PCR termal profili kullan: denatürasyon (95 ° C, 30 s), tavlama (58 ° C, 30 s) ve uzantı (72 ° C, 1 dk.). 
		Yeşil flüoresan Protein gelişmiş (EGFP) dsRNA astar (5' - 3')- İleri astar-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG Astar GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG ters 
		Şems dsRNA astar (5' - 3')- İleri astar-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT Astar TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA ters Not: EGFP dsRNA negatif kontrol kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jel-arındırmak Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri üreticisinin protokolüne göre ticari jel arıtma seti kullanarak.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon ticari bir ürün üreticisinin protokolüne göre T7 organizatörü dan transkripsiyonu yetenekli kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir RNA arıtma seti üreticisinin protokolüne göre kullanarak dsRNA arındırmak ve-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>Şems nakavt verimliliğini (1.5.1-1.5.5) aşağıdaki adımları kullanarak değerlendirmek.
	<ol>
		<li>Fetal sığır Serum (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin plaka 1 mL/Schneider'ın ortamının iyi hemasitometre ve plaka 5 x 105 S2 hücreleri de 6 her kuyuya kullanarak el ile hücrelerin % 10 ile desteklenmiş sayısı.</li>
		<li>Her şey için EGFP- veya Şems dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Hasat (EGFP dsRNA tedavi) denetim ve Şems dsRNA tedavi S2 hücreleri nazik Santrifüjü 1000 x g için 25 ° c 5 min ve bir RNA ekstraksiyon kiti göre kullanarak RNA izolasyonu için işlem tarafından aşağı peletleme tarafından takip pipetting tarafından üreticinin iletişim kuralı.</li>
		<li>Spektrofotometre ve işlemi 100 kullanarak RNA ölçmek için 1-adım qRT-PCR ticari qPCR reaktifler ve astar/sonda ve aşağıdaki PCR termal profili kullanarak RNA'ın ng: denatürasyon (95 ° C, 15 s) ve TAV/uzantısı (60 ° C, 1 dk). Not: Lütfen astar/sonda setleri ve bu çalışmalarda shams , denetim qRT-PCR deneyleri için kullanılan alet Malzemeler tablo bilgi için bakınız.</li>
		<li>2-ΔΔCT yöntemi16kullanarak göreli shams mRNA düzeyleri hesaplayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. değerlendirme arasındaki çentik reseptörü ve Trans-ligandlar
<ol>
	<li>Sinyal alma hücreleri (çentik reseptör ifade S2) hazırlayın.
	<ol>
		<li>El ile bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve plaka 5 x 105 S2 ve her şey bir 6-şey plaka 1 ml/Schneider'ın ortamının de istikrarlı S2-çentik hücrelerde FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin % 10 ile desteklenmiştir. Not: Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) üzerinden kullanılabilir olan S2-çentik hücreler için 200 nM metotreksat medya ekleyin. 0,5 mM metotreksat hisse senedi çözüm hazırlamak için ilk 20 mM metotreksat çözümde 250 µL 1 M NaOH hazırlamak. Ardından, bu çözüm için 1 M fosfat tampon serum ve store-20 ° C'de 0,5 mM sulandırmak S2-çentik hücrelerde, çentik protein Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör kontrolü altında ifadesidir.</li>
		<li>Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>0.7 mM çentik ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO4 ekleyin. Not: CuSO4 metallothionein düzenleyici tarafından kontrollü proteinlerin ifade ikna etmek için kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sinyal gönderme hücreleri (Delta veya Serrate ligandlar ifade S2 hücre) hazırlayın.
	<ol>
		<li>El ile bir hemasitometre ve plaka ~ 5 x 106 istikrarlı S2-Delta veya S2 SerrateTom hücrelerde her şey 1 ml 6-şey plaka kullanarak hücreleri saymak/FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin iyi Schneider'ın orta % 10 ile desteklenmiştir. Not: S2-Delta hücreler için 200 nM metotreksat ve 100 µg/mL hygromycin S2 SerrateTom hücreler için medya ekleyin. Delta ve SerrateTomifadesi — Serrate12domates öğesini, işlevsel sürümü — Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör altındadır.</li>
		<li>0.7 mM ligandlar ifade teşvik ve 25 ° c 3 h için kuluçkaya CuSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama gerçekleştirmek.
	<ol>
		<li>DsRNA tedavi edilen S2 hasat (kontrol) ve S2-çentik hücreleri tarafından yumuşak pipetting ve hemasitometre tarafından elle sayım sonra hücreler/iyi bir 24-şey plaka plaka 2.5 x 105 .</li>
		<li>5 x 105 istikrarlı S2-Delta veya S2 SerrateTom hücre Schneider'ın orta 200 µL toplam bir birim içinde eklemek (% 10 ile desteklenmiş FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin). Not: tüm S2 hücreleri (kaplama, indüksiyon ve dsRNA tedavisi de dahil olmak üzere) işleme altında bir biyogüvenlik kabini yapıldı.</li>
		<li>Plaka bir orbital Çalkalayıcı 150 RPM (942.48 rad/dak) yerleştirin.</li>
		<li>1 dk sonra her şey içeriğini karıştırmak ve toplamları sayılması için 20 µL çıkar.<ol>
			<li>Aynı anda ters bileşik 10 x büyütme (PLL 10/0,25 amaç) kullanma mikroskop altında temsilcisi bir görüntü çekmek.</li>
			<li>El ile agrega saymak (&#62; 6 hücreler) bir hemasitometre kullanarak.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bir shaker tabakta bir yer.</li>
		<li>Resim alma ve 5 dk sonra ve 15 dak toplama sayma yineleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmiktar gerçekleştirmek-bağlama.
	<ol>
		<li>S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 SerrateTom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.</li>
		<li>S2-çentik ve S2-Delta veya S2 SerrateTom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını hesaplamak ( transbüyüklüğü-bağlama).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.Çentik ve Transarasında bağ inhibisyonu değerlendirilmesi- CIStarafından ligandlar-ligandlar
<ol>
	<li>Sinyal alma hücreleri hazırlayın.
	<ol>
		<li>Her şey bir 6-şey plaka 1 ml/de Schneider'ın orta plaka 5 x 105 S2 hücrelerde % 10 ile FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin desteklenmiştir.</li>
		<li>Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.</li>
		<li>DsRNA tedavi edilen hücreleri pBluescript ve Devresel ödeme-çentikile11 (DGRC) tek başına veya DEVRESEL_ÖDEME-çentik ve Devresel ödeme-Delta11 ile birlikte transfect (DGRC) veya DEVRESEL_ÖDEME Serrate17 toplam DNA toplama µg/iyi bir ticari transfection reaktif üreticisinin protokolüne göre kullanarak 2. Not: pBluescript bir denetim olarak kullanılır. Co transfected hücreleri S2-çentik adı verilecek &#38; Deltageçici veya S2-çentik &#38; Serrategeçici hücreleri bundan sonra.</li>
		<li>25 ° c 24 h için geçici transfected S2 hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>0.7 mM çentik ve ligandlar ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücreleri sinyal gönderme 2.2 içinde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama 2.3 bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirmek.</li>
	<li>Transinhibisyonu ölçmek- CIStarafından bağlama-ligandlar.
	<ol>
		<li>S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 Serrate hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.</li>
		<li>CIStarafından inhibisyon büyüklüğü ölçmek-ligandlar gibidir.<ol>
			<li>A toplamları S2-çentikgeçici ve S2-Delta hücreler arasındaki sayısını tanımlamak için kullanılır.</li>
			<li>Toplamları S2 hücreler arasında sayıda geçici çentik ve Delta ile birlikte transfected gibi B tanımlayın (S2-çentik &#38; Deltageçici) ve S2-Delta hücreleri.</li>
			<li>Göreli toplama C hesaplamak = (B x 100) /A</li>
			<li>BDT- ligand (Delta veya Serrate) 100-tarafından inhibisyon büyüklüğünü hesaplamak C. Not: göreli toplama ise % 45, o zaman CISbir örnek olarak-ligandlar transetkisizleştirmek için kabul edilir-55 oranında bağlama.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li>
<li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li>
<li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li>
<li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li>
<li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Notch+signaling+pathway%3A+unfolding+the+activation+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li>
<li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li>
<li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).</li>
<li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).</li>
<li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li>
<li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta%2C+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li>
<li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li>
<li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li>
<li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li>
<li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li>
<li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate%2FJagged+and+Delta+family+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Kurallı sinyal çentik çentik reseptör ve onun ligandlar5arasındaki etkileşimler bağlıdır. Çentik yolu en çalışmaları, öncelikle çentik ve ligandlar komşu hücrelere (trans) bağlama dikkate rağmen çentik ve aynı hücre ligandlar etkileşim ve bu sözde CIS-etkileşimleri çentik bir inhibitör rol oynayabilir 3,4sinyal. Buna göre kurallı çentik sinyal üzerinde bir değiştirici etkileri altında yatan mekanizmaları deşifre etmek içi...

Kurallı sinyal çentik çentik reseptörleri ve onların ligandlar1arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hücreler komşu fiziksel temas gerektiren bir kısa menzilli hücre-hücre iletişim mekanizmasıdır. Çentik reseptör (sinyal alma hücrelerinin yüzeyinde mevcut) etkileşim ligandlar (sinyal gönderme yüzeyinde mevcut hücreleri) çentik sinyal başlatır ve transbilinen-harekete geçirmek2. Öte yandan, çentik ve onun ligandlar aynı hücrede arasındaki etkileşimi çentik yolu inhibisyonu yol açar ve CISbilinmektedir-inhibisyon3. Trans- ve BDTarasındaki denge-etkileşimleri optimum ligand-bağımlı çentik4sinyal sağlamak için gereklidir. Drosophila vardır bir çentik reseptörü ve iki ligandlar (Delta ve Serrate) dört çentik reseptörleri ve beş ligandlar var memeliler aksine [1 (JAG1), JAG2, pürüzlü delta benzeri 1 (DLL1), DLL3 ve DLL4]5. Bu basitlik sahip, Drosophila model çentik-ligand etkileşimleri ve daha sonra üzerinde çentik sinyal yolu değiştirici etkilerini incelemek/çalışma için kolaylığı sağlar. (Kanat geliştirme Drosophiladahil olmak üzere), hayvan gelişimi sırasında belirli bağlamlarda CIS- ve trans-etkileşimleri çentik uygun sinyal elde etmek ve kader1,6 hücre için söz konusu . BDT- transkarşı çentik yolu değiştiriciler Bu içeriklerde etkilerini ayırt etmek önemlidir-çentik etkileşimleri ile onun ligandlar.
Bizim grup daha önce ksiloz Drosophila çentik için olumsuz olarak adlandırılan bir karbonhidrat kalıntı ilavesi çentik kanat geliştirme7de dahil olmak üzere belirli bağlamlarda sinyal düzenleyen bildirdi. Şems kaybı (enzim o xylosylates çentik) için bir "kayıp kanat damarın" fenotip7açar. Daha yakın zamanlarda, gen dozaj deneyler ve klonal analiz shams kaybı Delta-aracılı çentik singling geliştirir göstermek için kullanılmıştır. Gelişmiş çentik shams mutantlar sinyal azalmış CISbir sonucu olup ayırt etmek için-inhibisyon veya artmış trans-harekete geçirmek, içinde larva kanat Imaginal diskler ligandlar çentik Ektopik overexpression çalışmaları dpp-GAL4 sürücüyü kullanarak uygulandı. Bu deneyler Shams transdüzenleyen kanıt düşündüren sağlanan-harekete geçirmek-in Delta tarafından çentik çentik CISetkilemeden-inhibisyon ligandlar8tarafından. Ancak, düzenlemeler geri besleme ve endojen ligandlar etkileri Ektopik overexpression çalışmalar1,6,9yorumu karmaşık.
Drosophila S2 hücreleri10 kullanıldı, bu sorunu gidermek için hangi çentik-ligand etkileşim çalışmaları11,12için basit vitro sistem sağlamak. S2 hücreleri değil endojen çentik reseptör ve Delta ligand11 hızlı ve çentik-ligand toplama deneyler8etkilemez Serrate13, düşük düzeyde ifade eder. Bu nedenle, S2 hücreleri stabil veya geçici çentik ve/veya bireysel ligandlar (Delta veya Serrate) sadece çentik reseptör veya onun ligandlar biri hızlı hücre oluşturmak için veya bunların bir kombinasyon tarafından transfected. Çentik ifade S2 hücrelerinin ligand ifade S2 hücreleri sonuçlarında heterotypic toplamları Reseptör-ligand bağlayıcı11,12,14tarafından aracılı oluşumu ile karıştırma. Miktar toplam oluşumu sağlar bir ölçüsü trans-çentik ve onun ligandlar15 (şekil 1) bağlama. Benzer şekilde, S2 hücreler çentik ve Delta veya Serrate ligandlar ile ortak transfected olabilir (Yani CIS-ligandlar). BDT-bu çentik ifade S2 hücrelerde ligandlar iptal etmek çentik bağlama ile trans-ligandlar ve sonucu azalmıştır toplama oluşumu8,12,14. Toplama oluşumu CIStarafından neden göreli düşüş-ligandlar CISinhibitör etkisini ölçüsü sağlar-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-ligandlar (Şekil 2). Buna göre hücre toplama deneyleri xylosylation kaybı trans- ve BDTüzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır-çentik ve onun ligandlar arasındaki etkileşimler.
Burada, çentik bağlama ile transdeğerlendirmek için hücre toplama deneyleri amaçlayan için detaylı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar Drosophila S2 hücreleri kullanarak. Örnek olarak, biz bize çentik ve transarasında bağ çentik xylosylation etkisini belirlemek izin verilen veri sağlar-Delta8. Bu basit deneyleri çentik-ligand etkileşimleri vitro yarı nicel bir değerlendirme sağlar ve çentik yolu değiştiriciler vivo içinde etkileri altında yatan moleküler mekanizmalar belirlemek.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium, Modifiye</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penisilin-Streptomisin 100X çözümü</td><td>GE Sağlık yaşam bilimleri&nbsp;</td><td></td><td></td>SV30010</tr><tr><td>CELLSTAR 6 kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini çalkalayıcı</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA saflaştırma Kiti)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Ters mikroskop</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Mikroskop Dijital Kamera + Gelişmiş Yazılım</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>ToupView yazılımı kullanılarak görüntü alma</td></tr><tr><td>PureLink Hızlı Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Metotreksat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>İnvitrojen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Bakır sülfat</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2 hücreleri</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-TırtıklıTom cells</td><td></td><td></td><td>R. Fleming'den Hediye (Fleming ve diğerleri, Geliştirme, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta hücreleri</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Çentik hücreleri</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vektör</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>S. Artavanis-Tsakonas'tan Hediye</td></tr><tr>Ken Irvine'den <td>pMT-Serrate vektör</td><td></td><td></td><td>Hediyesi (Okajima ve diğerleri, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vektör</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>S. Artavanis-Tsakonas'tan Hediye</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Hugo Bellen'den Hediye</td></tr><tr><td>TaqMan RNA'dan Ct'ye 1-Step Kiti</td><td></td><td></td> CG9996 (Shams) için TaqMan Gen Ekspresyon Testi 1611091 <td></td>Uygulanan Biyosistem</tr><tr><td></td><td>Uygulamalı Biyosistem</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>FAM-MGB boyası ile</td></tr><tr><td>CG7939 için TaqMan Gen Ekspresyon Testi (RpL32)</td><td>FAM-MGB boyası ile</td> <td>Uygulanan Biyosistem</td><td>Dm02151827_g1</td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistem</td><td></td><td>4351405 96 kuyulu Blok modülü</td></tr></tbody></table>

hücre toplama trans drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon cistarafından-ligandlar

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Çentik sinyal geniş hayvan geliştirme ve yetişkin bakım ve kullanılan bir evrimsel korunmuş hücre-hücre iletişim sistemidir. Çentik reseptör hücreleri komşu gelen ligandlar ile etkileşimi sinyal aktivasyonu neden olmaktadır (trans-harekete geçirmek), sinyal ligandlar aynı hücreden ile etkileşim inhibe ederken (CIS-inhibisyon). Transarasındaki uygun dengeyi-harekete geçirmek ve BDT-inhibisyon yardımcı olur çentik bazı bağlamlarda hayvan geliştirme sırasında sinyal en uygun belirlemektedir. Üst üste gelen ifade etki alanları çentik ve birçok hücre tipleri içinde onun ligandlar ve geri bildirim mekanizmaları varlığı nedeniyle verilen translasyonel modifikasyon trans- CISkarşı üzerinde etkileri eğitimi-çentik etkileşimleri ve onun ligandlar vivo içinde zordur. Burada, Drosophila S2 hücrelerde hücre toplama deneyleri çentik bağlama trans ve CISher ligand için üzerinde bir çentik yol değiştirici aşağı vurma etkilerini değerlendirmek amacıyla kullanmak için bir iletişim kuralı açıklar. Stabil veya geçici bir çentik ifade vektör ile transfected S2 hücreleri her çentik ligand (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade hücreleri ile karıştırılır. Trans-reseptör ligandlar arasındaki bağı heterotypic hücre toplamları oluşumuna neden olur ve oluşan mL başına toplamları sayısı açısından ölçülür &#62; 6 hücreler. CISinhibitör etkisini incelemek için-ligandlar, çentik ve her ligand ortak ifade S2 hücreleri S2-Delta veya S2 Serrate hücreleri ile karıştırılır ve toplamları sayısı yukarıda açıklandığı gibi sayılabilir. CISvarlığı nedeniyle toplamları sayısı göreli düşüş-ligandlar CISölçüsü sağlar-ligand- transinhibisyonu aracılı-bağlama. Bu basit deneyleri genetik veya farmakolojik işlemler bağlama üzerinde çentik için onun ligandlar etkileri üzerinde yarı Nicel veri sağlayabilir ve in vivo etkileri altında yatan moleküler mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir Çentik sinyal üzerinde böyle manipülasyonlar.

Vivo gözlemlerimiz xylosyltransferase gen shams sonuçlarında çentik nedeniyle sinyal kazanç kaybı Delta-aracılı transartış önerdi- CISetkilemeden çentik aktivasyonu-inhibisyonu Çentik ligandlar8tarafından. Bu kavramı sınamak için vitro hücre toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, S2 hücre deyimde Şems Şems dsRNA kullanarak yere düştü. EGFP<strong c...

Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans- ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Bu agregasyon testinin genel amacı, Notch reseptörünün trans-ligandlarla bağlanmasını ve cis-ligandlar tarafından inhibisyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir: Genetik veya farmakolojik faktör, Notch reseptörünün ligandına bağlanmasını nasıl etkileyecek ve sinyalizasyonu nasıl değiştirecektir? Bu tekniğin temel avantajı, Notch reseptörünün ligandı ile trans ve cis bağlanmasını değerlendirmeye izin vermesidir.İlginç bir şekilde, endojen ligandın örtüşen etkisini içermeden. Değerlendirmeye, sinyal alıcı hücreleri döndürerek ve bunları Schneider's Medium'da yeniden askıya alarak başlayın. Bir hematitometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda beş kez 10 ila beşinci S2 ve stabil S2-Çentik hücreleri, Schneider Ortamının oyuğu başına bir mililitre içinde. Daha sonra, her bir oyuğa 7.5 mikrogram çift sarmallı RNA ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Notch ekspresyonunu indüklemek için 0.7 milimolar bakır sülfat ekleyin ve hücreleri üç gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyondan sonra, sinyal gönderen hücreleri bir hematitometre kullanarak manuel o

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Bu video, Yakınlık Ligasyon Testi (PLA) kullanılarak Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini göstermektedir. Vücut duvarlarını izole ettikten sonra, etkileşen proteinler birincil antikorlar ve PLA ile konjuge ikincil antikorlar ile incelenir. Etkileşen proteinlerin yakınlığı, probların konektör oligonükleotidleri ile bağlanmasını kolaylaştırır, dairesel DNA oluşturur ve bu daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile amplifiye edilir.

Drosophila Larvalarında Protein-Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testi Kullanılarak Saptanması

Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz.  Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır.  Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Kendi kendine organizasyon, simetri kırılması ve eksenel gelişime paralel uzama gösteren fare embriyonik kök hücrelerinin agregalarını oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Bu teknik, eksenel gelişimsel süreçlerin incelenmesine ve tek katmanlı kültürde gerçekleştirilmesi zor olan hücre tiplerinin üretilmesine izin verir.

Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o<em&gt; İn Vitro</em

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Burada bir contractility tahlil Drosophila S2R + hücreler kullanarak açıklar. Eksojen bir ligand katlanmış gastrulasyon (sis), uygulama yolu ve hücresel contractility sinyalizasyon sis harekete geçirmek yol açar. Bu tahlil hücresel contractility proteinler yol sinyalizasyon sis Yönetmeliği araştırmak için kullanılabilir.

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Öğrenin Drosophila Notch reseptörünün trans-ligandlara bağlanmasını ve cis-ligandlar tarafından inhibisyonunu değerlendirmek için hücre toplama deneylerini. Bu yöntem genetik ve farmakolojik faktörlerin etkisini incelemeye yardımcı olur.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar (Video) | JoVE Journal

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Daha fazla video keşfet