Name: Nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler Neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin nöron-makrofaj ortak kültürlerinde cAMP ile makrofajları etkinleştirerek nörit uzamasını destekleyen moleküler faktörlerin salgılanmasını. Bu yöntem sinir rejenerasyonu mekanizmalarını araştırmak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu iletişim kuralı bir hibe NMG-2015R1A2A1A01003410 Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama, Kore Cumhuriyeti tarafından desteklenmektedir.

Tüm deneylerin hayvanlar içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ajou Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. Kültür Disosiye yetişkin DRG nöron hazırlanması
<ol><li>Kültürünü ayarlamadan önce Poli-D-lizin ve laminin ile 6-şey plaka önceden kat. Gecede 6-şey plaka ile % 0,01 Poli-D-lizin için 2 h 37 ° C'de veya 4 ° C'de kuluçkaya. Sonra kalenin iki kez distile su ile yıkayın.</li>
	<li>Laminin çözüm için oda sıcaklığında 2 h 3 µg/mL bir konsantrasyon ile plaka kuluçkaya ve sonra plaka iki kez distile su ile yıkayın. Plaka, oda sıcaklığında en az 1 h için kuru.</li>
	<li>Bir fare odasında sıkıştırılmış CO2 gaz silindir için bağlı bir şeffaf CO2 ötenazi. Vertebral sütunun cerrahi bir bıçakla örten cilt deşmek ve çift taraflı vertebral kemikleri ortaya çıkarmak için paravertebral kasları incelemek. DRGs tamamen maruz kadar titizlikle dar uçlu cerrahi rongeur kullanarak vertebra kemik kaldırın. Not: Yetişkin DRGs nöronlar arasında 8 hafta 12 hafta yaşlı yaşlı yetişkin C57BL6 erkek fareler elde edilir.</li>
	<li>DRGs çift taraflı S1 ta iridectomy makas ve ince uçlu forseps diseksiyon mikroskop altında kullanarak C1 düzeyine kadar kaldırın. Schwann hücreleri veya fibroblastlar kirlenme en aza indirmek için tamamen DRGs kökleri tutmaya çalıştı.</li>
	<li>Disseke DRGs 60 mm Petri kabına 5 mL, soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) buz üzerinde tüm kadar DRGs toplanan içeren saklayın. Not: DRGs en kısa zamanda incelemek için önemlidir. Bir fareden tüm DRGs toplanması gerektiğini sonra ötenazi 30 dk. 30 dk uzun sürer, DRGs toplamayı durdurmak ve orada hala kalan DRGs bile sonraki adıma geçin.</li>
	<li>DRGs 1.5 mL mavi pipet ucu (1000 µL) kesme uç ile kullanarak Eppendorf tüp aktarın. DMEM birkaç saniye mini santrifüj kullanarak hızlı bir tur sonra kaldırın. 125 U/mL türü XI collagenase içeren DMEM 1 mL ekleyin ve bir kasırga shaker 37 ° C kuluçka kullanarak tüp nazik döndürme (35-40 d/d) 90 dk için kuluçkaya. Bant kullanarak shaker katta tüp hareketsiz.</li>
	<li>Collagenase-DMEM içeren atın ve 1 mL taze DMEM ekleyin. Kayan DRGs tamamen altına lavabo ve sonra DMEM ile doku enkaz kaldırmak kadar bekleyin. Bu çamaşır en az altı kez tekrarlayın. Not: tamamen süpernatant atmak çalışmayın. Herhangi bir DRGs süpernatant DMEM ile değil çıkarmak için dikkatli olun.</li>
	<li>DRGs 15 mL konik tüp kesme son ile mavi pipet ucu (1000 µL) kullanarak aktarın. Sonra yukarı ve aşağı yavaşça pipet homojen hücre süspansiyon yapmak için mavi ucu (1000 µL) en az 15 kere kullanarak. Kabarcıklar yapmaktan kaçınmak ve alt kısmında bir pipet ucu konik boru dokunmak deneyin.</li>
	<li>Tüp vasıl 239 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde enkaz yüzen ile süpernatant atın. 1 mL Neurobasal orta B27 ile desteklenmiş ekleyin (%2.0 v/v) ve hücre Pelet yavaşça yukarı ve aşağı 5-10 kez pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp üstüne overlaid bir 70 µm hücre süzgeç geçişi. İçin 2 dk bekleyin ve sonra Neurobasal/B-27 orta bir pipet denetleyicisi kullanarak süzgeç üzerine dökün.</li>
	<li>Tüm toplanan DRG (yaklaşık 2 x 106 DRG neurons bir fare toplam) iki kuyu 6-şey plaka üzerine nöronlar plaka. Bir yetişkin fare neurons DRG iki kuyu bir 6-şey plaka kapak. Makrofaj ortak kültürlerin kadar 37 ° C'de CO2 kuluçka sonra plaka koyun.</li>
</ol>2. ortak kültür P birincil Periton makrofajlar A hücre kültür Ekle-Tarih
Not: ortak kültürler 4 h sonra Disosiye DRG nöronların kaplama ilk kurmak.
<ol><li>Birincil Periton makrofajlar yetişkin C57BL6 erkek fareler 12 haftalık 8 hafta arasında yaş üzerinden hazırlanır. Bir hayvan CO2 odasında ötenazi. Karın deri ince deşmek, karın zarını açığa ve Periton lavaj sıvı kaçağı önlemek için kesme önlemek.</li>
	<li>22 G iğne ile kullanarak karın zarını ponksiyon ve Periton boşluğuna buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mL enjekte. Yavaşça karın zarını 1-2 min için masaj. Daha sonra iğne çekin ve PBS iğne ponksiyon sitesi aracılığıyla dışarı sıkmak ve 50 mL konik tüp lavaj sıvı toplamak. Not: kullanmadan önce şırınga PBS soğuğunu korumak için buza koy.</li>
	<li>Lavaj sıvı vasıl 239 x g 4 ° C'de hücresel bileşenleri cips için 10 dk santrifüj kapasitesi. Pelet kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek 3 dk 3 mL ile oda sıcaklığında resuspend. Hücre süspansiyon tekrar vasıl 239 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Pelet PBS 3 mL ile resuspend ve tekrar kalan herhangi bir RBC lizis arabellek kaldırmak için hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Not: RBC lizis arabellek tamamen çıkarıldığından emin olun. Aksi takdirde geri kalan RBC lizis arabellek kültürlü makrofajlar toksik olabilir.</li>
	<li>Neurobasal/B-27 orta 1 mL pelleted hücrelerde resuspend. Plaka tüm toplanan makrofajlar (3 × 106 6 x 106 hücrelere toplam) bir hücre kültürü üzerinde yarısı olan 4.2 cm2Disosiye DRG kuyunun üzerine yerleştirilir, etkili alan ekleyin. Not: ortak kültür döneminde makrofajlar Neurobasal/B-27 nöron kültür ortamında yetiştirilmektedir. Yeterli makrofajlar bu koşul altında yaşama doğrulandı.</li>
</ol>3. tedavi Db-kamp ve makrofaj CM topluluğu
Not: db-kampı tedaviye 4 h nöron-makrofaj ortak kültürler sonra başlayın.
<ol><li>100 µM db-kampı çözüm 2 µL nöron-makrofaj ortak kültürler için ekleyin. PBS aynı birim denetim deney için ekleyin.</li>
	<li>24 saat sonra boş bir şey aynı 6-şey plaka makrofaj kültür ortamının 1 mL ile doldurun. Nöron-makrofaj ortak kültürler hücre kültür INSERT boş kuyunun makrofaj kültür orta ile aktarın. 72 h için aynı koşul altında hücreler orta değiştirmeden tutmak. Not: Sadece 1 mL makrofaj kültür orta yapmak için CM toplama sırasında CM konsantre ekleyin. CM toplama sırasında gerekirse, biz tamamen makrofajlar eklemek içinde karşılamak için daha fazla ekledi.</li>
	<li>72 saat sonra santrifüj kapasitesi vasıl 239 x g hücresel bileşenleri kaldırmak 5 min için makrofaj CM. Süpernatant kalan herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak için 0.2 µm filtreden geçmek. -70 ° C'de toplanan CM kullanmak kadar saklamak.</li>
</ol>4. Neurite yapılan tahlil ile toplanan CM
<ol><li>Bir ayrı yetişkin DRG nöron kültürünü ayarlamadan önce 1.1 ve 1.2 açıklanan yordamın aynısını takip bir 8-şey odası slayt önceden kat.</li>
	<li>Neurobasal orta B27 ile desteklenmiş Disosiye yetişkin DRG nöronlarda elde 1.3 1,10 için açıklanan aynı yöntemleri kullanarak. Peki önceden kaplanmış 8-şey odası slayda başına 5 x 104 hücre plaka.</li>
	<li>Yer altına eklemek hücre izin için 2 h, 37 ° C kuluçka odası slayt. O zaman, 37 ° C'de ısıtılmış çözdürülen CM kültür orta yerine Not: 8-şey odası slayt alt kültür orta kaldırırken dokunmak dikkatli olun ve toplanan CM ekleme.</li>
	<li>ilk kaplama sonra 15 h orta kaldırmak ve PBS hücrelerle bir kez yıkayın. Daha sonra buz gibi %4 paraformaldehyde çözüm 200 µL wells için ekleyin ve 4 ° C'de 20 dk paraformaldehyde üçün hücrelerle kuluçkaya Not: DRG nöron kültürü neurite yapılan tahlil için 15 h ile tam olarak verilmelidir. Bu durum altında hiçbir kayda değer neurite çıkıntı vardır.</li>
	<li>Buz gibi PBS ile üç kez yıkayın ve % 10 ile engelleme gerçekleştirin normal keçi serum (NGS) % 0.1 ile Triton-X 30 dakika süreyle kuluçkaya sabit hücrelerin % 10 ile seyreltilmiş birincil antikoru (anti-Tuj-1) çözüm ile (adlı bir konsantrasyon 1 µg/ml) NGS Oda 4 h için Sıcaklık veya gecede 4 ° C'de</li>
	<li>Üç kez PBS ile yıkama ve oda sıcaklığında 2 h için ikincil antikor (keçi-anti fare) çözüm hücrelerle kuluçkaya. Sonra iki kez PBS ile yıkama ve kültür slayt montaj çözümü kullanarak bir coverslip (24 × 50 mm) ile monte.</li>
	<li>Neurite çıkıntı görselleştirmek için bir floresan mikroskop kullanarak görüntü alabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu ortak kültür sistemi oluşturmak için çeşitli kritik adımlar vardır. Fare DRG neurons ve Periton makrofajlar taze hazır sağlamak önemli ve sağlıklı. Tüm DRGs diseksiyon daha--dan 30 dk aldığında azalmış neurite yapılan etkinlik cm yaşadım. Buna ek olarak, Periton makrofajlar bileşenlerinde kan kirlenme de CM neurite çıkıntı etkinliği azalmaya yol açtı. Sağlam nöron-makrofaj etkileşim db-kamp tarafından temin için kapsamlı yıkama Ayrıca doku enkaz tümüyle kaldırılmasını ve sitotoksik kalan potansiyel olarak eleme emin o...

Çalışmalar çeşitli beyin ve omurilik yaralanmaları sonra CNS axon rejenerasyon geliştirmeye çalışmışlardır. İnflamatuar reaksiyonları, kaçınılmaz olarak sinir sisteminde yaralanmalar eşlik eden geleneksel olarak ikincil patolojik süreçler için zararlı sonuçlar1,2önde gelen katılmak için tahmin edilmektedir. Nitekim, inflamatuar reaksiyonları önleyebilirsiniz Metilprednizolon tek onaylı tedavisi akut omurilik yaralanması3için olduğunu. Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar makrofajlar, temsilcisi inflamatuar hücre tipi, rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sistemi4,5,6katılabilir kanıt sağlamış. Örneğin, retina ganglion sinir hücreleri7,8rejenerasyon tanıtmak için bir lens yaralanma üretmek pro rejeneratif molekülleri takip makrofajlar sızmak. Buna ek olarak, transplante DRG nöronlar tarafından zymosan9makrofajlar etkinleştirdiğiniz yere bölge axon büyümesini arttı. Ayrıca, lezyon sitesinde makrofajlar yaralı periferik sinirler10büyüme izin veren bir ortam oluşturabilirsiniz.
Çalışmalarımız da makrofajlar bitişik nöronlar axon yenilenme kapasitesi katkıda bulunabilir güçlü kanıtlar sağlanan. Dorsal kök gangliyon (DRG) makrofajlar aktivasyonu olduğunu göstermiştir DRG gelişmiş yeniden üretim kapasitesini önemli bir periferik Önkoşullanma takip duyusal sinir hücreleri yaralanma11sinir. Benzer araştırma bağımsız olarak başka bir laboratuvar12den bildirildi. Biz de intraganglionic enjeksiyon dibutyryl siklik AMP (db-kampı), akson rejenerasyon13kapasitesini artırmak için iyi bilinen bir molekül olan makrofajlar Etkinleştirme indüklenen gösterdi. Makrofajlar, etkinliğini db-cAMP etkisi neurite çıkıntı etkinliği kaldırıldı. Sonraki eserler yaralanma kaynaklı ifade CCL2 içinde sinir hücreleri makrofajlar pro rejeneratif fenotip14,15ile uyarmak için bir sinyal olarak tespit edilmiştir.
Yukarıdaki deneysel sonuçlarına göre biz bir preconditioning yaralanma modeli11,14takip DRGs oluşan moleküler olaylarını benzeyen bir vitro modeli kurduk. Bu modelde, db-kampı makrofajlar pro rejeneratif fenotip ile aktivasyonu yol açar sinyal hücreler arası alabilme nöron-makrofaj ortak kültürler uygulanır. Burada, biz hangi tarafından biz moleküler faktörler neurite çıkıntı (şekil 1) teşvik salgılar makrofajlar oluşturabilirsiniz detaylı iletişim kuralları açıklar. Bu deneysel model makrofajlar uyarılmış veya yaralanmalar sinir sistemi için aşağıdaki axon rejenerasyon desteklemek için indüklenen bir kavram gösterilmektedir. Modelimiz da pro rejeneratif makrofajlar harekete geçirmek yol açar hücreler arası sinyal içinde mekanizmaları okumak yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Hücre kültürü eki şeffaf PET membran 0.4&mu; m gözenek boyutu</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>0.4-&mu ile şeffaf PET membran; m gözenek boyutu, 6 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>70-&mu için; m naylon hücre süzgeci</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8 oyuklu kültür slaytı</td><td></td> Poli-D-Lizin Kırmızı kan <td></td> hücresi lizis tamponu Qiagen 158904 Kollajenaz <<td></td></tr><tr><td>em>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr> Nörobazal ortam Thermo Fisher'dan düzgün bir şekilde Poli-D-Lizin Kırmızı <tr><td>kan hücresi lizis tamponu</td><td>ile 354632</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Bilimsel, Gibco</td><td>21103-049</td><td>%1 glutamax ve %1 penicilin-streptomisin</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi içeren, serum içermeyen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>hücre dışı solüsyon</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin Hidrobromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 3 ', 5'-siklik monofosfat, N6, O2'-dibutiril-, sodyum tuzu</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr>% <tr><td>10 Normal Keçi Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Kimyasal ve Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti ve beta; III tübülin (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Fare monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) ikincil antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü CO2 inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon stereomikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Büküm çalkalayıcı</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Güzel Bilim Araçları)</td><td>16021-14</td><td>Paslanmaz çelik, 14cm, kavisli, tek eklem hareketli</td></tr><tr><td>İnce Makas - Tungsten Karbür & ToughCut</td><td>FST (Güzel Bilim Aletleri)</td><td>14558-11</td><td>keskin, tırtıklı</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forseps</td><td>FST (Güzel Bilim Aletleri)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, kavisli</td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas</td><td>FST (Güzel Bilim Aletleri)</td><td>15000-00</td><td>düz, 3 mm son teknoloji, keskin</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 Mikro Santrifüj</td><td>Esnaf Teknoloji Grubu</td><td>DW-41</td><td>Giriş Voltajı: 115VAC</td></tr></tbody></table>

nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Makrofajlar rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sisteminin katılabilir güçlü kanıtlar var. Burada, bir protokol makrofajlar neurite çıkıntı teşvik şartına üretim ortamına (CM) indüklenir açıklayın. Yetişkin dorsal kök gangliyon (DRG) neurons Akut ayrışmış ve kaplama. Nöronlar stabil ilişik sonra Periton makrofajlar ortak bir hücre kültür eklemek de aynı overlaid kültürlenir. Siklik AMP (db-kampı) için 24 saat, hangi sonra hücre kültürü eklemek makrofajlar içeren ortak kültürler uygulanır Dibutyryl için başka bir şey için 72 h CM toplamak için taşınır. Db-kampıyla ayrı yetişkin DRG nöron kültürü için uygulanan tedavi co kültürlerden CM sağlam neurite yapılan etkinlik sergiler. Tek hücre türü yalnız oluşan db kampı tedavi kültürler elde edilen CM, DRG nöron ya da Periton makrofaj, değil sergi neurite yapılan etkinlik. Bu sinir hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimi makrofajlar moleküler faktörler ile neurite yapılan faaliyet CM içine salgılayan aktivasyonu için vazgeçilmez olduğunu gösterir. Böylece, bizim ortak kültür paradigma da hücreler arası nöron-makrofaj etkileşiminde pro rejeneratif fenotip ile donatılmış makrofajlar uyarmak için sinyal eğitim yararlı olacaktır.

Biz makrofajlar neurite çıkıntı aktivitesiyle moleküler faktörler salgılayan yeteneğine sahip-ebilmek oluşturmak bir protokol tanımlamak. Makrofaj CM db-kamp ile tedavi ortak kültürler elde edilen ayrı bir DRG nöron kültürü (şekil 2A) uygulandığında sağlam neurite çıkıntı sonuçlandı. Buna karşılık, PBS tedavi ortak kültürler elde CM neurite çıkıntı bizim 15-h kültür süresi (şekil 2B) neden değil. DB-kampı kültürüne makrofaj yalnı...

Geçerli protokol neurite çıkıntı teşvik moleküler faktörler serbest bırakmak için kapasite ile donatılmış için kültürlü makrofajlar uyarmak için deneysel yordamları sunar. Nöron-makrofaj ortak kültürler kampa tedavisinde makrofajlar güçlü neurite çıkıntı faaliyet sahip klimalı orta üretmek için neden olmaktadır.

Nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler Neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Bu prosedürün genel amacı, nörit büyümesini destekleyen moleküler faktörleri salgılayabilen makrofajlar üretmektir. Bu yöntem, mükemmel rejenerasyonu teşvik etmek için pro-rejeneratif makrofajik fenotipi aktive etmek için nöronların ve makrofajların birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, pro-rejeneratif fenotipe sahip makrofajları uyarmak için önceki çalışmalarda kullanılan çok daha fizyolojik enzimler olan bir adenosin serum molekülü olan Cyclic AMP'yi kullanmamızdır.Bu yöntem için ilk olarak, makrofaj aktivasyonunun axion büyüme kapasitesinin arttırılmasında gerekli olduğunu ve bunların kalıcı lob hasarında önlem alındıktan sonra mükemmel nöronlar üretebileceğini bulduğumuzda aklımıza geldi. Kültürü kurmadan önce, poli-D Lycine ve laminin ile altı oyuklu bir plakayı önceden kodlayın. Daha sonra, altı oyuklu plakayı 0.01 poli-D Likin ile 37 santigrat derecede iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Bundan sonra, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra plakayı, oda sıcaklığında iki saat boyunca mililitre başına üç mikrogram konsantrasyonda laminin çözeltisi ile inkübe edin. Bunu takiben, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın ve plakayı oda sıcaklığında en az bir saat kurutun.Şimdi, ötenazi uygulanmış bir farenin vertebral kolonunun üzerindeki cildi cerrahi bir bıçakla kesin ve vertebral kemikleri ortaya çıkarmak için vertebral kas çiftini iki taraflı olarak inceleyin. DRG tamamen açığa çıkana kadar dar uçlu bir cerrahi rongeur kullanarak omur kemiklerini titizlikle çıkarın. Diseksiyon mikroskobu altında, iridektomi makası ve ince uçlu forseps kullanarak DRG'yi S1'den C1 seviyesine kadar bilateral olarak çıkarın.DRG'yi, ucu kesilmiş mavi bir pipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın. Ardından, bir mini santrifüj kullanarak birkaç saniye hızlı bir dönüşten sonra DMEM'i çıkarın. Mililitre tip 11 kollajen başına 125 birim içeren bir mililitre DMEM ekleyin ve tüpü 37 santigrat derecede bir twister çalkalayıcı kullanarak hafif bir döndürme ile 90 dakika inkübe edin.Daha sonra, DMEM içeren kollajenazı atın ve bir mililitre taze DMEM ekleyin. DRG'yi, ucu kesilmiş mavi bir pipet ucu kullanarak 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Daha sonra homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için en az 15 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Tüpü 239 G'de üç dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yüzen kalıntılarla dikkatlice atın. B27 ile takviye edilmiş bir mililitre nörofesleğen ortamı ekleyin ve beş ila on kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir konik tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.Daha sonra toplanan tüm DRG nöronlarını altı kuyucuklu plakanın iki kuyusuna yerleştirin. Yetişkin bir fareden primer peritoneal makrofajları hazırlamak için, peritonu açığa çıkarmak için karın derisini hassas bir şekilde kesin ve lavaj sıvısının sızmasını önlemek için peritonu kesmekten kaçının. Daha sonra, 22 gauge iğneli bir şırınga kullanarak peritonu delin ve periton boşluğuna 10 mililitre buz gibi soğuk PBS enjekte edin.Peritona bir ila iki dakika hafifçe masaj yapın. Daha sonra iğneyi dışarı çekin ve PBS'yi iğne delme bölgesinden sıkın ve lavaj sıvısını 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Daha sonra, hücresel bileşenleri peletlemek için lavaj sıvısını 239 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Daha sonra, peleti üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile oda sıcaklığında üç dakika boyunca yeniden askıya alın. Daha sonra hücre süspansiyonunu tekrar 239 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri bir mililitre nörofesleğen B27 ortamında yeniden süspanse edin.Toplanan tüm makrofajların yarısını, ayrışmış DRG kuyusunun üzerine yerleştirilen, etkili alanı 4.2 santimetre kare olan bir hücre kültürü eki üzerine yerleştirin. Nöron makrofajı birlikte kültürlendikten dört saat sonra, nöron makrofaj ko-kültürlerine iki mikrolitre 100 mikromolar DB siklik amp çözeltisi ekleyin. 24 saat sonra, aynı altı kuyucuklu plakada boş bir kuyuyu bir mililitre makrofaj kültür ortamı ile doldurun.Nöron makrofaj ko-kültüründeki hücre kültürü ekini, makrofaj kültür ortamı ile boş kuyuya aktarın. 72 saat sonra, hücresel bileşenleri çıkarmak için makrofaj şartlandırılmış ortamı beş dakika boyunca 239 kez g'de santrifüjleyin. Kalan hücresel kalıntıları temizlemek için süpernatanı 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.Bu prosedürde, sekiz kuyulu odacıklı bir slaytı poli-D lizin ve laminin ile önceden kaplayın. Daha sonra, daha önce tarif edilenle aynı yöntemleri kullanarak B27 ile desteklenmiş, ayrışmış yetişkin DRG nöronlarını ve nörobazil ortamını elde edin. Önceden kaplanmış sekiz kuyucuklu bir hazne kızağı üzerine kuyucuk başına dört hücreye beş kez 10 plaka koyun.Daha sonra, oda slaytını iki saat boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin tabana yapışmasına izin verin. Daha sonra kültür ortamını, 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış çözülmüş, şartlandırılmış ortamla değiştirin. İlk kaplamadan 15 saat sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, daha sonra kuyucuklara 200 mikrolitre buz gibi,% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve hücreleri paraformaldehit çözeltisi ile dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.Daha sonra, sabit hücreleri% 10 normal keçi serumu ile seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, nörit büyümesini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüler çekin. DB siklik AMP ile muamele edilen ko-kültürlerden elde edilen makrofaj şartlandırılmış ortam, ayrı bir DRG nöron kültürüne uygulandığında sağlam nörit büyümesi ile sonuçlandı.Buna karşılık, PBS ile muamele edilen ko-kültürlerden elde edilen şartlandırılmış ortam, nörit büyümesine neden olmamıştır. DB siklik AMP kültüre sadece makrofaj ile muamele edildiğinde, şartlandırılmış besiyeri nörit büyümesini desteklemede etkili değildi. Bu, nöron makrofaj etkileşiminin, makrofajları pro-rejeneratif bir kapasiteye sahip olacak şekilde uyarmak için vazgeçilmez olduğunu göstermektedir.Ayrıca, DB siklik AMP ile tedavi edilmiş nöron kültüründen elde edilen şartlandırılmış ortamı da test ettik ve nörit büyümesi bulamadık. Nöronların ve mikroplakaların taze ve sağlıklı bir şekilde hazırlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Diseksiyon çok uzun sürdüğünde veya periton makrofajları kan bileşenleri ile kontamine olduğunda sabit ortamın nörit büyüme aktivitesinde azalma yaşadık.Bu protokolde, ayrışmış DRG nöronları, hücre kültürü eki üzerindeki makrofajlardan mali olarak ayrıldı. Bu nedenle, ko-kültür sistemimiz, tamamen rejeneratif makrofajların aktivasyonuna aracılık eden hücreler arası sinyalleşmeden sorumlu hücresel faktörlerin tanımlanmasına izin verecektir.

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu video, murin dorsal kök ganglion nöronlarının ve makrofajların birlikte kültürlenmesini göstermektedir. Nöronlar kaplanmış bir plaka üzerine ekilirken, makrofajlar ötenazi yapılmış bir fareden toplanır, tedavi edilir ve kültür ekine eklenir. db-cAMP ile tedavi, nöronları aktive eder ve makrofajları nöronal büyümeyi desteklemek için pro-rejeneratif bir fenotip benimsemeye teşvik eder.

İn Vitro Nöron ve Makrofaj Kokültürü Geliştirme

Bu video, makrofaj koşullu ortamı kullanarak nörit büyümesi olarak bilinen nöron projeksiyonlarının büyümesini teşvik etmek için bir testi göstermektedir. Nöronları ve makrofajları cAMP ile birlikte kültürleyin ve makrofajdan türetilmiş şartlandırılmış ortamı hasat edin. Nöronların şartlandırılmış ortamla büyütülmesi, nörit büyümelerini teşvik eder. Bu çıkıntılar floresan olarak etiketlenir ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Nöron uzantılarını teşvik etmek için makrofaj şartlandırılmış bir ortam kullanma

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Insert ko-kültür sistemleri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için basit bir yol sunar.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Öğrenin nöron-makrofaj ortak kültürlerinde cAMP ile makrofajları etkinleştirerek nörit uzamasını destekleyen moleküler faktörlerin salgılanmasını. Bu yöntem sinir rejenerasyonu mekanizmalarını araştırmak için değerli bir araç sunar.

Nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler Neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için

Daha fazla video keşfet