Name: Anne sütü artırır büyüme Enteroids: hücre çoğalması bir Ex Vivo modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin, anne sütünün intestinal hücre proliferasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için neonatal fare veya insan bağırsağından enteroid kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, gastrointestinal hastalıkları araştırmak için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MG hibe K08DK101608 ve R03DK111473 Ulusal Sağlık enstitüleri, Mart, Dimes Vakfı Hibe No 5-FY17-79, çocuk Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi ve Anabilim Dalı tarafından desteklenmektedir Pediatri Washington Üniversitesi School of tıp, St. Louis. CJL R01DK104946 tarafından desteklenmektedir (PI: Silverman), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi.

Bu çalışmada tüm hayvan yordamları St. Louis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (iletişim kuralı 20160187) veya Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (iletişim kuralı 14103918) Washington üniversite tarafından kabul edildi. İnsan cenin ince bağırsak daha az 24 haftalık gebelik, Pittsburgh Üniversitesi anatomik doku tedarik kılavuzlarınıza uygun olarak kurumsal inceleme kurulu onayı (protokol PRO14100537) Üniversitesi'nden sonra elde edildi Pittsburgh Sağlık Bilimleri doku Bankası bir dürüst komisyoncu sistemi aracılığıyla. De-tanımlanan insan anne sütü veya pastörize donör anne sütü rıza Üniversitesi Pittsburgh Kurumsal değerlendirme Komitesi'nden feragat ile elde edildi.
1. crypt yalıtım ve Neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak Enteroids kurulması
<ol><li>Medyası hazırlama Not: Medya crypt yalıtım önceki gün mahallede hazırlanmalıdır.<ol>
<li>1.11 L kültür ortamı hazırlamak. 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 1 L ile başlayan ve 110 mL Fetal sığır Serum (FBS) (son konsantrasyonu % 10), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL steril insülin (final Ekle konsantrasyon %0.1).</li>
		<li>500 mL PBS-antibiyotik karışımı hazırlayın. İle % 10 500 mL 1 x Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile başlayan FBS ve 5 mL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 1 mL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), ekleyin ve 5 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1).</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #1 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #2 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 300 µL 0,5 M EDTA ekleyin (son konsantrasyonu 5 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).</li>
		<li>50 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri olmadan hazırlayın. Ölçmek 33.4 mL 1 x gelişmiş DMEM/F-12 ve 10 mL FBS (son konsantrasyonu % 20) ekleyin.<ol>
<li>500 µL eklemek penisilin-(son konsantrasyonu % 1), streptomisin 500 µL L-glutamin (son konsantrasyonu % 1), 500 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 100 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) (son konsantrasyonu 0.05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 500 µL 100 x N-2 ek, A vitamini eksi serum ücretsiz ek (örneğin, B-27) x 1 mL 50 ve 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile hazırlayın. İlk 1 mL, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri hazırlamak. 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a ekleyin (son toplama 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL kafa (son toplama 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (son konsantrasyonu 500 ng/mL) ve 0.5 µL 100 µg/mL EGF (son konsantrasyonu 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Crypt yalıtım
	<ol>
<li>Yer çözündürüldükten membran özü ( Tablo malzemelerigörmek) başlamadan önce çözülme buzda. Not: Devam membran buz veya polimerize.</li>
		<li>Ötenazi ile ikinci iki yöntemi ile fare fareler Yaş 14 günden daha büyük için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi protokolü ile uyumlu, ötenazi ölüm emin olmak için fiziksel bir yordamı olmak. Not: fareler için 14 gün altında yaş, işten çıkarma makas kullanarak standart bir uygulamadır.</li>
		<li>Makas ve forseps kullanarak, cilt ve Periton, karın tüm uzunluğu için karın orta hat aşağı dikey bir kesi yapmak. İnce bağırsak mide çekum için makas ile tüketim ve Forseps ile bıçaklanmasından kaldırın. Not: İki-hafta-yaşlı erkek ve dişi C57BL/6J fare pups, her tartı 5,5-7 g crypt yalıtım için kullanılmıştır. Herhangi bir yaş veya boyutu fare crypt yalıtım için kullanılabilir.</li>
		<li>Taze hasat ince bağırsak crypt yalıtım için hazırlamak için bağırsak düz getirin ve bağırsak boyuna makas kullanarak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş. Not: Fare ve insan bağırsak benzer şekilde hazırlanabilir.</li>
		<li>Temiz dışkı bağırsak sallayarak yavaşça bağırsak ve geriye bir PBS-antibiyotik karışım dolu forseps kullanarak kabında dışında.</li>
		<li>Hücre bozulma medya #1 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin. Bağırsak 0,5 cm uzunlukta parçalara doğrudan tüp içine kesti. Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.</li>
		<li>Dokular üzerinde shaker olmakla birlikte, enteroids RNA, DNA veya protein yalıtım için kullanılacak ise kriptalarının büyümeye 24 veya 48 iyi tabaklar elde etmek. Eğer enteroids tamamı için kullanılmak üzere kriptalarının büyümeye kullanım 8-şey odası slaytlar confocal görüntüleme bağlayın.</li>
		<li>Başlık, membran 15 µL her şey 24 veya 48 iyi plaka altýna ekleyin. Odası slaytlar kullanıyorsanız, membran 9 µL her odası altýna ekleyin. Not: gerekirse plaka boyutuna göre membran seviyesini ayarlamak.</li>
		<li>Membran kuyunun üzerine ince bir tabaka oluşturur böylece membran pipet ucu hızla yayıldı. Kuluçka membran polimerize izin vermek 30 dk 37 ° C'de plaka yerleştirin. Not: Kriptalarının membran ince bir tabaka değilse veya membran hava kabarcıkları içeriyorsa eklemek.</li>
		<li>Bir shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Aracılığıyla akış atmak.</li>
		<li>30 mL hücre bozulma medya #2 yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin.</li>
		<li>Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.</li>
		<li>Shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Akış'sonraki adımlarında verim düşüktür Bu adımda tutun. Not: Tüpler ile tüm akışı buz üstünde tutulmalıdır.</li>
		<li>15 mL DMEM 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin. Şiddetle tüp el ile 10 s. filtre için 100 µm süzgeç aracılığıyla sallamak. ve akış toplamak. Akışı aracılığıyla hiçbir partiküller içeren kadar yineleyin.</li>
		<li>Mahallede aracılığıyla akış fare doku veya insan dokusu için 100 µm süzgeçler için 70 µm Süzgeçler kullanarak yeni 50 mL konik tüp içine önceki adımdaki filtre. Not: ilave süzgeçler çagirabilirim ve süzgeçler ile enkaz zarar gibi yavaş yavaş dökün.</li>
		<li>Tüp 4 ° C ve doğrudan yerinde bir buz kovası başlıklı 8 min için 200 x g de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından Pelet bozmadan kaldırın. Pelet toplam istediğiniz miktarı, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile resuspend. Not: Zenginleştirilmiş kriptalarının Pelet 'kum' katmandır. Her 250 µL olan Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri de gerektirir.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids kurulması
	<ol>
<li>Crypt medya karışımı membran üzerinde doğrudan plaka.</li>
		<li>Kriptalarının mikroskopla yalıtım işlemi başarılı oldu emin olmak için denetleyin. Not: Hücreleri ve hücre topları istenen. Yaklaşık 100 bireysel kriptalarının iyi kaplama.</li>
		<li>Plaka kriptalarının membran için bağlı kalmak izin vermek 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Bu kuluçka Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile değil.</li>
		<li>Yavaş yavaş medya ve P-200 pipet kullanarak iliştirmek başarısız fazlalık kriptalarının kaldırın. Not: ekteki kriptalarının yerinden olmak gibi membran rahatsız etmeyin.</li>
		<li>Yavaş yavaş 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri her şey için ekleyin. Not: 24-için 48-şey plakaları veya odası slaytlar, 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri yeterlidir.</li>
		<li>Ortamı 2 günde 5 gün kala en uygun ek ve büyüme için izin vermek için Tedaviler için taze Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri ile değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. fare meme süt toplama
<ol><li>C57BL/6J emzikli Barajı onun pups sağım öncesinde 6 h için doğum sonrası 7-12 gün ayırmak.</li>
	<li>Burun konisi üzerinden isoflurane ile emzikli Barajı anestezi ve oksitosin 0.15 IU/kg vücut ağırlığı, subkutan enjeksiyon yönetmek. Sağım yordamı denemeden önce 3 dakika bekleyin.</li>
	<li>Emzikleri yordamı sağım öncesinde % 70 etanol ile temiz ve kurumaya bırakın.</li>
	<li>Süt emzikleri bir fare emzikleri 5 mL toplama tüp içine sığacak şekilde boyutlandırılmış silikon tüp ile bir elektrik insan göğüs pompası kullanarak bir defada ayıklayın. Not: En iyi göğüs pompaları iki ayar, bir hız ve emme için var. Her birinin en düşük ayarlarla başlatın ve her ikisi de yavaş yavaş süt elde edilir kadar artırmak en iyisidir. İdeal olarak, toplam verim olacaktır ~ 500 µL - fare anne sütü emzikli dam başına 1 mL.</li>
	<li>Hemen aliquot anne sütü ve mağaza-80 ° C'de Not: önlemek donma/çözülme döngüsü.</li>
	<li>37 ° C'de 24 h için fare anne sütü mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile başına 50 µL/mL 5 gün enteroids tedavi</li>
</ol>3. bütün Enteroids boyama Mount
<ol><li>
Reaktifler hazırlanması
	<ol>
<li>16 mL 1 x PBS 8 kuyu başına hazırlayın.</li>
		<li>2 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) 8 kuyu başına 1 x PBS hazırlayın.</li>
		<li>2 mL % 0,1 hazırlamak 8 kuyu başına 1 x PBS Triton X-100.</li>
		<li>24 mL hazırlamak PBS ara (PBST ise % 0.1 ara 20 içinde 1 x PBS) 8 kuyu başına.</li>
		<li>%0,1 2 mL % 10 normal eşek serum (NDS) hazırlamak PBST (% 10 NDS/PBST) 8 kuyu başına.</li>
		<li>4 mL % 1'i hazırlayın NDS % 0,1 PBST (% 1 NDS/PBST) 8 kuyu başına.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1. gün boyama
	<ol>
<li>Tedaviler Aspire edin ve enteroids PBS ile yıkayın. 250 µL % 4 eklemek PFA ücret iyi. Rotator için 1-2 h 4 ° C'de yerleştirin %4 kaldırmak PFA pipet ile.</li>
		<li>Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator (RT) oda sıcaklığında 10 dakika yerleştirin. Not: Bu plaka gerekirse 1-2 gün 4 ° C'de depolamak mümkündür.</li>
		<li>250 µL/iyi 0,1 Ekle % Triton X-100. RT Kaldır, 1 h için kuluçkaya % 0,1 Triton X-100 pipet ile.</li>
		<li>Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator RT. itibariyle 15 dakika yerleştirin</li>
		<li>250 µL/iyi %10 eklemek NDS/PBST. RT Kaldır, 45 dk için kuluçkaya % 10 NDS/PBST pipet ile.</li>
		<li>250 µL/iyi birincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/250 NDS/PBST, eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Optimum antikor seyreltme üreticisine göre değişir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2. gün boyama
	<ol>
<li>4-5 h ile 250 µL/iyi PBST için en az 5 kez yıkayın. 4 ° C arasında her yıkama rotator yerleştirin.</li>
		<li>250 µL/iyi ikincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/1.000 NDS/PBST ekleyin. Plaka folyo sarın ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3. gün boyama
	<ol>
<li>250 µL/iyi nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15dk için leke ekleyin. Not: plaka karanlıkta bırakın.</li>
		<li>6 kez 250 µL ile/iyi PBST yıkayın. Rotator her yıkama arasında 4 ° C'de 10 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Mount coverslip odası üzerinde slayt ortam takma ile.</li>
		<li>40 X objektif confocal mikroskop ile fotoğraf çekmek ve eşit bir raster grafik editörü render ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+prebiotics%2C+probiotics%2C+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%3A+what+is+the+current+evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li>
<li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li>
<li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li>
<li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17027734">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li>
<li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li>
<li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States%3A+a+pediatric+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li>
<li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li>
<li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis%2C+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Wieku+Rozwoj%22%5BJournal%5D)">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+2%27-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li>
<li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li>
<li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li>
<li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li>
<li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+collecting+milk+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek hiçbir şey ve hiçbir çıkar çatışması var.

Bağırsak epitel konak savunma bağırsak bariyer bütünlüğünü korumak patojenlere karşı sorumluluğunuz vardır ve çeşitli hastalıkların patogenezinde çiğnenebilmektedir birçok hücresel türlerinden oluşur. Hayvan modelleri hastalık bazı yönleriyle özetlemek, fareler ve insanlar bağırsağın türetilmiş enteroids ex vivo modelinin çeşitli tedaviler etkilerini test etmek için bir platform sağlar. Enteroid modeli önemini araştırmacılar kültür ve bağırsak kök hücre saf ya da hastalıklı hayvanlar ve varolan yöntemleri ile me...

Enterokolit Nekroze edici (NEC) gastrointestinal hastalığı etkileyen yaklaşık 28 hafta gebelik1,2,3önce tarihi 1 10 bebeklerde prematüre bebeklerde ölüm önde gelen nedenidir. Yarısı, bebeklerin hayatta kalma sadece % 10-304,5nerede en ağır formu için NEC ilerleme ile. Amerika Birleşik Devletleri'nde bir tahmini 2-3 milyar YTL/yıl harcanan bebekler NEC6,7ile tedavi henüz ne sağkalım oranı ne de terapi son 30 yıl içinde değişti. NEC patogenezinde bağırsak yaralanma ile karakterizedir ve Mukozal iyileşme8,9,10,11, ancak, bir yaygınlaşacak önde gelen sinyal yolları Engelli inflamatuar yanıt ve inflamasyonu tersine çevirmek için mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
İnsan anne sütü yönetim prematüre bebekler için NEC karşı strateji sadece koruyucu olduğu tespit edilmiştir. Biz daha önce anne sütü NEC geliştirme yolu ile yolu11sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) bağırsak epitel içinde doğuştan gelen bağışıklık reseptör toll benzeri reseptör 4 (TLR4) inhibisyonu yoluyla karşı korur göstermiştir. Anne sütü deneysel bir NEC Formula takviyesi Enterocytes apoptosis inhibisyonu ve restorasyon epidermal büyüme üzerinde bağımlı bir şekilde Enterocytes yayılması tarafından gösterildiği gibi NEC görüldüğü inflamatuar yanıt zayıflatılmış faktör (EGF) ve EGFR11. Başka bir çalışmada, o göstermek bu nitrat, başka bir bileşeni olan anne sütü, koruyucu doğası ile karşılaştırıldığında hangi NEC yüksek frekans için katkıda bulunabilir ve nitrat eksik bebek formülü, bağırsak perfüzyon oransal tarafından katkıda bulunur formülü bebeklerin12,13beslenir. İnsan sütü oligosakkaritler, L-Arginin, glutamin ve Laktoferrin14,15,16, anne sütü mevcut NEC karşı koruma dahil olmak için gösterilen diğer bileşikler içeren 17,18,19. Anne sütü yararlı bu unsurları NEC önlenmesinde kullanımı gerekliliği ortaya, ama aynı zamanda yollar ve hücresel etkileri anne sütü NEC karşı koruma arabuluculuk nasıl içinde ilgili sinyal mekanizmaları, eğitim önemini vurgulamak .
İleri çalışmalar amacıyla anne sütü, NEC, fare modeli koruyucu özelliklerini biz hangi fare tarafından anne sütü bir elektrik insan meme pompası11,12 kullanarak bir imzalat Barajı elde edilebilir bir roman, kullanımı kolay tekniği gelişmiş . Fare anne sütü edinme Bu strateji değil bu yöntem species-specific meme süt analizleri için verdiğinden yalnızca insan göğüs pompaları ama aynı zamanda hazır ve anne sütü, tedarik verimli olduğundan avantajlıdır. Sonuç olarak, biz fare anne sütü etkileri bu insan sütünü ile karşılaştırabilirsiniz yanı sıra species-specific modelleri süt bankada insan donör süt pastörize. Meme süt bileşenleri ile ilgili olarak yaptıkları katkı NEC önleme yolunda çalışması için bu teknik sağlar. Diğer araştırmacılar meme süt çıkarma yöntemleri geliştirdik, ancak, bu teknikleri el ile ve genellikle birden fazla laboratuvar üye20,21,22gerektirir. Burada bir fareden süt toplamak için bir insan elektrikli göğüs pompası değiştirerek kullanılabilir bir basit tekniği sunulur. Bu teknik diğer türler için de uygulanabilir.
Yeterli sinyal yolları NEC ile ilgili sorguya çekmek için model sistemleri tüm hastalık sürecinde etkilendiği bilinen farklı hücre türleri değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Burada, bir tür modeli sistemi - enteroids - ve kendi kuruluş fare ve insan ince bağırsak tartışmak. Gastrointestinal sistem gerçekleşecek patofizyolojik süreçlerin çalışmada yardım etmek için bir yenilikçi, genetik olarak farklı ex vivo insan modeli sundukları çünkü insan bağırsak enteroids (HIEs) özellikle önemli söz, sağlamak 23. Enteroids uzun vadeli kültürlü tespit edilmiştir ve daha sonra kullanım23için dondurulmuş ve insan bağırsak olan kültürler indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden gelişmiştir, Organoids farklı olarak (HIOs), kök hücrelerden enteroids oluşturulur izole bağırsak kriptalarının24içinde. Enteroids daha az bakım gerektiren, olabilir hızlı bir şekilde25enfekte ve bağırsak kriptalarının daha HIOs23farklılaşmış beri kolayca kurulabilir. Bu nedenle, insan gastrointestinal epitel23bölgeye özel kompozisyon ve fonksiyonel özellikleri sergilemek geliştirilebilir çünkü HIEs mevcut teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Enteroids kullanımı ihtiyacı olan bir insan modeli bağlılık bölgeye özgü sınırlamalar ve kullanım kolaylığı ile bağırsak ne zaman son derece etkili bir seçimdir. Burada izole edip birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids fareler ve prematüre insan bebeklerin bakımını yapma tekniği göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun 4.5 g / L Glikoz ve L-Glutamin ile Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (İnsülin)</td> <td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin ( DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Gelişmiş DMEM / F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hidroksietilpiperazin-N-2-Etan Sülfonik Asit (HEPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetilsistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Takviyesi Eksi A Vitamini</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK İnhibitörü Y-27632, Dihidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare Wnt3a Protein R</td><td>& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış Bazal Membran</td><td>Matrisi Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Hücre Kültürü Petri Kabı</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48 Kuyulu Hücre Kültür Plakası</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8 Kuyulu Nunc Lab-Tek II Hazneli Kızak Sistemi</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüp</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; M Steril Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Steril Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serum (NDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür (DAPI)</td><td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Cam</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 İnç İğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oksitosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Çift Elektrikli Göğüs Pompası</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Yuvarlak Alt Test Tüpü</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Tıpalar</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Antikoru Abkam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Mki67 primeri F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Entegre</td> <td>DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

anne sütü artırır büyüme enteroids: hücre çoğalması bir ex vivo modeli

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

İnsan küçük bağırsak enteroids kriptalarının türetilmiştir ve kök hücre niş içinde yetiştirilen epitel hücre türlerinin tümünü içerir. İnsan enteroid ex vivo kültür sistemleri kurmak için yetenek modeli bağırsak patofizyolojisi ve belirli hücresel yanıt dahil çalışma gerekir. Son yıllarda, enteroids fareler ve insanlar, pasajlı ve banked uzakta birkaç laboratuarlarında ileride kullanmak için dünya çapında kültürlü. Bu enteroid platformu çeşitli tedaviler ve ilaçlar etkilerini ve farklı hücre tipleri bağırsak üzerinde ne gibi etkileri sarf test etmek için kullanılabilir. Burada, birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids kurmak için bir protokol yenidoğan fareler türetilen ve erken insan bağırsak sağlanır. Ayrıca, bu enteroid kültür sistemi species-specific anne sütü etkilerini test etmek için kullanılmıştır. Fare anne sütü verimli bir şekilde değiştirilmiş insan göğüs pompası kullanılarak elde edilebilir ve ifade fare süt o zaman daha fazla araştırma deneyler için kullanılabilir. Biz şimdi ifade fare, insan, etkileri göstermek ve neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak donör anne sütü büyüme ve enteroids yayılması türetilmiş.

İlk insan anne sütü ifade olup olmadığını araştırmak aranan veya pastörize donör anne sütü küçük bağırsak enteroids üzerinde bir etkisi vardı. Nitekim, insan anne sütü ve donör anne sütü yenidoğan fare (şekil 1A) ve erken insan türetilmiş enteroids (şekil 1B) büyüme arttı.
Bu yana insan anne sütü küçük bağırsak enteroids büyüme arttı, anne sütü erken insan enteroids yay...

Bu iletişim kuralı, Yenidoğan fare veya erken insan bağırsak yanı sıra fareler süt toplamak için verimli bir yöntem bir enteroid kültür sistemi kurmak açıklar.

Anne sütü artırır büyüme Enteroids: hücre çoğalması bir Ex Vivo modeli

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvarda enteroid adı verilen minyatür bağırsakları kültürlemektir. Enteroidler, anne sütünün in vitro proliferasyon üzerindeki etkilerini aydınlatmak için laboratuvarda ekstrakte edilen fare anne sütü ile tedavi edilir. Bu yöntem, prematüre bebekleri etkileyen nekrotizan enterokolit gibi çeşitli gastrointestinal hastalıklarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, enteroidlerin çok az bakım gerektirmesi, hızlı bir şekilde kurulabilmesi ve gastrointestinal epitelin fonksiyonel özelliklerinin çoğunu sergilemesidir. Enteroidlerin kurulması için bu teknik, insan ince bağırsağının oldukça etkili bir modelidir. Bu yöntem ince bağırsak hakkında bilgi verebilse de, GI yolunun diğer bölgelerindeki diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.Başlamak için, çözünmüş bazal membran ekstraktını buz üzerinde çözün. Ardından, ötenazi uygulanmış bir farenin tüm karın orta hattında dikey bir kesi yapmak için makas ve forseps kullanın. Forseps kullanarak ince bağırsağı eksize edin ve mezenteri çıkarın.İnce bağırsağı kript izolasyonu ve enteroid oluşumu için hazırlamak için, bağırsağı düz bir şekilde konumlandırın ve tüm uzunluğu boyunca uzunlamasına kesmek için makas kullanın. PBS antibiyotik karışımı ile doldurulmuş bir Petri kabında bağırsağı forseps ile hafifçe sallayarak herhangi bir dışkıyı çıkarın. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 30 mililitre hücre bozulma ortamı ekleyin.Yarım santimetrelik bağırsak segmentlerini tüpe yerleştirin ve tüpü bir çalkalayıcı üzerindeki bir buz kovasına yerleştirin. Bir davlumbazda, sekiz kuyulu bir oda slaytında her bir kuyunun dibine 9 mikrolitre bodrum membranı ekleyin. Membranı bir pipet ucuyla hızlı bir şekilde yayın ve bazal membranın bir inkübatörde polimerize olmasına izin verin.Bodrum membranının, kuyu dibinde ince bir tabaka oluşturacak şekilde hızlı bir şekilde yayılması önemlidir. Hava kabarcıkları varsa veya bazal membran çok kalınsa kriptler yapışmaz. Konik boruyu çalkaladıktan sonra, membran dokusunu filtrelemek ve akışı atmak için 100 mikrometrelik bir süzgeç kullanın.Yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe iki numaralı 30 mililitre hücre bozulma ortamı ekleyin ve ardından bağırsak dokusunu tüpe ekleyin. Tüpü 15 dakika çalkaladıktan sonra, dokuyu 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Akışı bu adımdan itibaren tutun.Yeni bir konik tüpe litre başına 4.5 gram glikoz ve L-glutamin içeren 15 mililitre TMEM ekleyin. 100 mikrometre süzgecinden dokuyu çıkarın ve yeni konik tüpe ekleyin. Ardından, tüpü 10 saniye boyunca manuel olarak çalkalayın ve 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün.Başlıkta, dokuyu yeni bir konik tüpe filtrelemek için 70 mikrometrelik bir süzgeç kullanın. Tüpü 8 dakika santrifüjledikten sonra, davlumbazdaki bir buz kovasına yerleştirin. Oluşan peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.Peletleri, büyüme faktörleri olmadan uygun miktarda kript kültürü ortamı ile yeniden süspanse edin. Hazne slaytını 30 dakika inkübe ettikten sonra, kript ortam karışımını doğrudan bazal membranın üzerine yerleştirin ve kriptler yapışana kadar 37 santigrat derecede 3 saat inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, herhangi bir ortamı ve bağlı olmayan kriptoları dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın.Bir diğer kritik adım, bir P200 pipeti kullanılarak takılamayan ortamı ve fazla kriptleri yavaşça çıkardığınızdan emin olmaktır. Bağlı kriptler yerinden çıkabileceğinden bazal membranı rahatsız etmeyin. Her oyuğa yavaşça büyüme faktörleri içeren 250 mikrolitre kript kültürü ortamı ekleyin.Burun konisi yoluyla verilen izofluran ile emziren bir barajı uyuşturun ve uygun dozda deri altı oksitosin uygulayın. Emzikleri %70 etanol ile temizleyin ve sağım işlemine başlamadan önce kurumasını bekleyin. Farelere uyacak şekilde boyutlandırılmış silikon boru ve 5 mililitrelik bir tüp ile donatılmış bir elektrikli insan göğsü pompası kullanarak, meme başlarından birer birer süt alın.Son olarak sütü hemen kesin ve eksi 80 derecede saklayın. Enteroidleri beşinci günde 37 santigrat derecede 24 saat boyunca depolanmış fare anne sütü ile tedavi edin. Boyamanın ilk gününde, deneysel tedavileri çıkarmak ve enteroidleri yıkamak için PBS kullanın.Her bir oyuğa 250 mikrolitre% 4 PFA ekleyin ve slaytı 4 santigrat derecede 1 ila 2 saat boyunca bir döndürücüye yerleştirin. PFA'yı çıkarmak için bir pipet kullanın ve ardından her bir kuyuyu 250 mikrolitre PBS ile dört kez nazikçe yıkayın. Hazne sürgüsünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirin.Her oyuğa 250 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, Triton X-100'ü bir pipetle çıkarın ve her kuyucukta 250 mikrolitre PBS ile dört kez yıkayın. Slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin.Her kuyucuğa 250 mikrolitre %10 NDS/PBST ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra NDS/PBST'yi bir pipetle çıkarın. Son olarak, her oyuğa 250 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.Boyamanın ikinci gününde, her bir kuyuyu en az beş kez 250 mikrolitre PBST ile yıkayın ve slaytı her yıkama arasında 4 santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin. Her oyuğa %1 NDS / PBST'de 250 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Slaytı folyoya sarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.Boyamanın son gününde, her bir oyuğa 250 mikrolitre nükleer lekeli DAPI ekleyin ve 15 dakika bekletin. Ardından, her bir kuyuyu altı kez 250 mikrolitre PBST ile yıkayın. Slaytı, her yıkama arasında 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin.Son olarak, montaj ortamı ile hazne sürgüsüne bir kapak sürgüsü monte ederek ve 24 saat kurumasını bekleyerek sürgüyü mikroskobik görüntüleme için hazırlayın. Bu çalışmada, yenidoğan farelerden türetilen ince bağırsak enteroidleri, emziren farelerden toplanan anne sütü ile tedavi edildi. Bu şekilde gösterildiği gibi, fare anne sütü, fare enteroidlerinde proliferasyonu arttırdı.Anne sütünün türe özgü etkilerini araştırmak için, anne sütü ve pastörize donör anne sütü de fare enteroidlerine uygulandı. Bu şekilde gösterildiği gibi, insan ve pastörize donör anne sütü, fare enteroidlerinin proliferasyonunu arttırmıştır. Bu prosedürü denerken, izolasyon adımları sırasında kriptleri buz üzerinde tutmak önemlidir.Enteroidler kültüre girdikten sonra tüm yöntemleri yavaş ve nazikçe uygulayın. Bu prosedürü takiben, bağırsağın mikro ortamını daha iyi özetlemek için ek soruları yanıtlamak için bağışıklık hücreleri, mikrobiyota veya çeşitli ilaçlarla tedaviler gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, enteroidler üzerinde nasıl kültürleneceğini, tedavi edileceğini ve immünofloresan uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.Ek olarak, emziren bir fareden anne sütünü verimli bir şekilde çıkarabilmelisiniz. İnsan dokusu ve vücut sıvıları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın.

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Sunulan protokol, kültürlü fare enteroidlerinde çoğalan ve ölü hücrelerin sayısını ölçmek için akış sitometrisini kullanır. Bu yöntem, ilaç tedavisinin organoid proliferasyon ve sağkalım üzerindeki etkilerini değerlendirmek için yararlıdır.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, anne sütünün intestinal hücre proliferasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için neonatal fare veya insan bağırsağından enteroid kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, gastrointestinal hastalıkları araştırmak için değerli bir model sunar.

Anne sütü artırır büyüme Enteroids: hücre çoğalması bir Ex Vivo modeli

Daha fazla video keşfet