Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Bu prosedürün genel amacı, nöronal büyümede ima edilen dinamik yapılardaki nöritlerin analizi için gerekli olan submikrometrik eksenel çözünürlük ile in vitro nöronal hacmin tam alan ölçümüne izin vermektir. Bu yöntem, hücresel sinirbilim alanında, büyümeme veya akson dejenerasyonu sırasında subsidial ölçekteki hacim değişikliklerinin dinamikleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tam uyum gözlemi ve saat veya günlere kadar zaman ölçeği ile birlikte submikrometrik eksenel çözünürlük sağlamasıdır.

Prosedüre başlamak için, üzerine izopropanol dökerek PDMS bloğunu kimyasal bir başlık altında kalıptan çıkarın. Ardından, davlumbazın paslanmaz çelik tezgahına yerleştirin. Silikon gofretin etrafını kesin ve PDMS kopyasını kalıptan çıkarın.

Ardından, çipin etrafını kesin ve bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak iki milimetrelik bir kenar boşluğu bırakın. 1.5 milimetre çapındaki zımbaya sıkıca bastırarak girişi delin ve girişin deliğini kesmek ve oymak için çalıştırın. Sıvının enjekte edileceği çipin dört özel bölgesinde de aynısını yapın.

Daha sonra, mikro yapılı taraftaki yapışkan bandı yapıştırarak ve soyarak çipi temizleyin. Her iki tarafa izopropanol serpin. Ardından, bir hava üfleme tabancası kullanarak çipi basınçlı nitrojen ile kurutun.

Bu prosedürde, her bir lameli temiz oda ortamında bulunan bir döner kaplayıcı üzerine yerleştirin. 0,45 mikrometrelik bir nihai kalınlığa ulaşmak için lamel ve spin-coat 4000 rpm'de 30 saniye boyunca yaklaşık% 75'ini kaplayacak şekilde pozitif fotorezistten bir damla uygulayın. Lamelleri bir dakika boyunca 115 santigrat derece yüzey sıcaklığına sahip bir ocak gözüne yerleştirin.

Bir maske hizalayıcı kullanarak, her bir lamel 435 nanometre dalga boyunda, fabrikasyon parametrelerine göre özel maske aracılığıyla maruz bırakın. Daha sonra, biri seyreltilmeden geliştiriciyi içeren, diğeri deiyonize su içeren iki cam kristalleştirici kap hazırlayın. Kristalleşme kabını sürekli ve nazikçe karıştırırken lamelleri birer birer geliştiriciye bir dakika batırın.

Ardından, gofreti yaklaşık beş saniye deiyonize suya batırın. Gofret'i emici bir kağıda aktarın ve bir hava üfleme tabancası kullanarak basınçlı nitrojen ile kurutun. Hem PDMS çipini hem de üzerine yapıştırılacağı cam kabı, yüzey aktivasyonu için plazma odasına yerleştirin.

Daha sonra, dikdörtgen kalın bir mikroskop cam lam üzerine bir damla su bırakın ve lamel kılcallık ile cam lam üzerine yapıştırın. Mikroskop altında, cam sürgünün arkasındaki fotorezist şeritlerinin yerini işaretleyin. Desenli cam lamel maske hizalayıcının maske tutucusuna yerleştirin.

Fotorezist referans nesnelerini ortalamak için yapılan işarete güvenin. Optik kontrastı artırmak için PDMS çipinin altına bir silikon gofret yerleştirin. Silikon gofret, hizalama işlemi sırasında aynaya sıkıca bağlı kalmalıdır.

Ardından, PDMS çipini maske hizalayıcının mobil alt tabaka tutucusuna yerleştirin. Daha sonra, mekanik kontağın arkasında kalırken hem çipi hem de lamel üzerinde bulunan fotorezist şeritler dizisini görselleştirmek için aynayı yeterince kaldırın. PDMS direklerinin yüzeyi cam lamele temas edene kadar aynayı kaldırarak hizalama yapın ve talaş ile lamel arasında mekanik temas sağlayın.

Bundan sonra, aynayı indirin. Çipe yapıştırılmış lameli maske tutucusundan çıkarın. Ardından, cihazı 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve yapışma gücünü artırmak için her şeyi beş ila on dakika fırına aktarın.

Yapıştırmadan otuz dakika sonra, girişe PLO çözeltisi ile doldurulmuş on mikrolitrelik bir pipet ucu yerleştirin. Ardından, üstte bir damla oluşana kadar sıvıyı yükleyin. Aynı işlemi çıkış ve rezervuarlarda tekrarlayın.

Daha sonra, çipin her tarafına Petri kabına PBS ekleyin. Petri kabını bir parafin filmi ile kapatın ve oda sıcaklığında en az beş saat inkübe edin. Ardından, on mikrolitrelik bir uç konisini her bir enjeksiyon deliğine hafifçe bastırın ve fazla sıvıyı emdirin.

Ardından, PLO'yu ve çipi çevreleyen PBS'yi kültür ortamı ile değiştirin. Daha sonra, çipi en az beş saatlik kuluçka süresi ile nöronlar tohumlanana kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak düzenlenmiş inkübatöre yerleştirin. Bu prosedürde, kültür ortamını çipten yukarı çekin.

Taze süspanse hücre çözeltisinden iki ila üç mikrolitre toplayın ve girişe enjekte edin. Aynı işlemi hemen prizde tekrarlayın. Her rezervuara yaklaşık aynı hacimde kültür ortamı enjekte edin.

Hücrelerin yoğunluğunu kontrol etmek için çipi mikroskop altında hızlı bir şekilde gözlemleyin. Optimal hücre yoğunluğunun büyüklük sırası, dört sütunla sınırlandırılmış kare yüzey içinde yaklaşık beş ila on hücreye karşılık gelir. Hedeflenen hücre yoğunluğuna ulaşmak için 0.5 ila 1 mikrolitre hücre süspansiyonu enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın.

Görüntüleme için, kültür ortamını görüntüleme ortamıyla değiştirin. Ardından, çipi bir epifloresan mikroskobu altına yerleştirin. Hızlandırılmış deneyler durumunda tek ila birden çok ardışık görüntüden hücrelerin görüntülerini elde edin.

Burada gösterilen, bir kalibrasyon fotorezist şeridi ve nöronların temsili gözlemleridir. Bu nesnelerin daha yüksek büyütmeli görüntüleri ve kesitleri sağda görüntülenir. Temsili nöritler ve üç mikrometre yüksekliğinde bir merkezi oda burada gösterilmiştir.

Nörit diliminin hacmi, nörit genişliğinin bir fonksiyonu olarak hesaplanabilir. Ve burada temsili büyüme konileri ve üç mikrometre yüksekliğinde bir merkezi oda var. Alt yapıları, yaklaşık 20 nanometrelik bir optik arka plan gürültüsünden net bir şekilde ortaya çıkar.

Yaşamın hızlandırılmış gözlemleri, birkaç on dakikalık bir zaman ölçeği içinde büyüme konisinin küçülme ve yeniden aktivasyon döngüsünü takip etmek için 12 mikrometre yüksekliğindeki bir odaya ekilen nöronları hareket ettirir. Bu prosedürü denerken, silikon çamurunu imal etmek için derin iyon aşındırma ekipmanına erişiminizin olması önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yapılandırılmış bir cam lamel bir PDMS çipi ile nasıl hizalanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, nörolojinin 3 boyutlu olarak ölçülmesine tekrarlanabilir bir şekilde uygulanabilir. Bu teknik, farmakoloji alanındaki araştırmacıların, tümü kapalı koni şeklinde olan gerçek kalibreli çeşitli ilaçların etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Birincil nöronlarla çalışmanın, kontaminasyonu ve kırılmaları önlemek için çok fazla özen gerektirdiğini unutmayın.

Kuluçka makinesinin dışında geçirdikleri zamanı sınırlamak için medyayı değiştirirken her zaman nazik ve hızlı olun.