Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Bu prosedürün genel amacı, organik sentez için Kiral yardımcı maddelerden farmasötik tedaviye kadar geniş bir uygulama yelpazesine sahip bileşikler olan Kiral Amino Alkolleri sentezlemek ve saflaştırmaktır. Bu, doğal amino asitten, lizinden türetilen kiral amino alkole, tek parçalı bir prosedürde iki veya üç enzimatik adımda erişim sağlamak için tüm verimli bir ölçüm cihazıdır. Bu prosedürün temel avantajları, protokolün basitliği ve saflaştırma adımlarının verimliliğidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki teknisyen Aurelie Fossey-Jouenne olacak. Di-hidroksilatılmış lizin türevini sentezlemek için, 250 ml'lik bir erlenmyer şişesine hepes tamponu, l-lizin, alpaquita glutarik asit, sodyum askorbat ve daha fazla tuz ekleyin. Daha sonra, eklenecek enzim çözeltisinin hacmini dikkate alarak 10 ml'lik son bir hacme su ekleyin.

Deoksijenaz KD-01'i ml başına 0.075 mg'lık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Reaksiyon karışımını uygun süre boyunca oda sıcaklığında 300 rpm'de çalkalayın. Karıştırdıktan sonra, reaksiyon karışımının 10mcl'sini 1.5 ml'lik bir ependorf tüpüne aktarın.

Daha sonra, etanol içinde aquias sodyum bikarbonat çözeltisi, etanol ve ml başına 2.5 mg DNFB çözeltisi ekleyin. Mikrotüpü kapatın ve çözeltiyi 1000 rpm'de ve 65 santigrat derecede 1 saat çalkalayın. Bitirdiğinizde, çözeltiyi çökeltmek için mini bir santrifüj kullanın.

Reaksiyon karışımını 10mcl 1M hidrokloroik asit ile söndürün. Çözeltiyi girdaplayın ve ardından yerleştirmek için mini bir santrifüj kullanın. 1 ml'lik bir yem şırıngası kullanarak, karışımı 0,22 mcm dökme boyutunda hidrofilik poliviniliden florür membranı ile 4 mm çapında steril olmayan bir şırınga filtresi üzerinde süzün.

Bunu takiben, türetilmiş reaksiyon karışımı numunesini bir HPLC cihazına yerleştirin. Ürünü analiz etmek için 400 nanometrede bir UV algılama kullanarak C-18 kolonuna 10mcl enjekte edin. Reaksiyon izleme tamamlanmış bir reaksiyonu gösterdiğinde, şişeye alfakita glutarik asit, sodyum askorbat ve daha fazla tuz ekleyin.

Deoksijenaz KD-02'yi ml başına 0.5 mg'lık uygun bir nihai konsantrasyona ekleyin. İlk reaksiyon hacmi kullanılarak hesaplanır. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 300 rpm'de 18 saat çalkalayın.

Reaksiyon izleme tamamlanmış bir reaksiyonu gösterdiğinde, reaksiyon karışımına 100mcl 100 milimolar DTT ekleyin. Artı 100mcl 100 milimolar PLP. Saflaştırılmış dekarboksilaz Dccpin'i ml başına yaklaşık 0.5 mg'lık bir nihai konsantrasyonda ekleyin.

İlk reaksiyon hacmi kullanılarak hesaplanır. Daha sonra reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 300 rpm'de 18 saat çalkalayın. Reaksiyon tamamlandığında, şişeyi bir buz banyosuna yerleştirerek karışımı soğutun.

Dikkatlice 0.25 ml 6 molar hcl ekleyin ve ekleme sırasında soğuk reaksiyon karışımını hafifçe çalkalayın. Şimdi, acdic karışımını bir cam mera pipeti kullanarak 50 ml'lik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Karışımı 1.680 kez yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemenin ardından, süpernatanı 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarın. Ardından, peleti içeren santrifüj tüpüne 10 ml Deiyonize su ekleyin. Peleti yeniden askıya almak için girdap.

Numuneyi santrifüjledikten sonra, süpernatanı ilk süpernatanı içeren yuvarlak tabanlı şişeye aktarın. Toplanan süpernatantları, şişenin sürekli el döndürme ile sıvı nitrojene çıkmasıyla dondurun. Malzemenin çözülmesini önlemek için şişeyi hemen tezgah üstü manifoldlu dondurarak kurutucuya aktarın.

Dondurarak kurutma işlemi tamamlandıktan sonra, şişeyi dondurarak kurutucudan çıkarın ve saflaştırma adımlarını gerçekleştirin. Mono-hidroksil L-lizinlerin biyokatalitik dekarboksilasyonu için S Rhumerentium'dan DC, tüm mono-hidroksi lizinlere karşı aktivite sergiledi. Karşılık gelen kiral hidroksi-diaminlerin üç ve beş türevi için en iyi dönüşümün gözlemlendiği yer.

Beklendiği gibi, Dccpin'in 4R-hidroksi-L-lizin 2'nin dekarboksilasyonu için en uygun olduğu ortaya çıktı. Standart reaksiyon koşulları altında, 3S-hidroksi-L-lizin 1'in DCcpin ile dekarboksilatlı muadili 5'e dönüşümü düşüktü. Ve 5R-hidroksi-L-lizine doğru herhangi bir aktivite gözlenmedi.

Dehidroksi-L-lizinlerin biyokatalitik dekarboksilasyonu için, sadece 3R, 4R, dihidroksi-L-lizin 3, standart reaksiyon koşulları altında kantitatif olarak karşılık gelen dihidroksi-diamin 7'ye dönüştürüldü. 45-dihidroksi-L-lizin 8'in dönüşümü orta düzeydeydi, ancak enzim yüklemesinin arttırılmasıyla iyileştirildi. Her iki PLP-DC de 35-dihidroksi-L-Lizin 9'a karşı aktif değildi.

HPLC izleme ile belirlendiği gibi kantitatif dönüşüm sergileyen Enzimatik kaskad reaksiyonları başarıyla ölçeklendirildi. Amino alkoller, karmaşık enzimatik reaksiyon karışımlarından ve mükemmel yeildlerden saflaştırıldı ve NMR ile karakterize edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu enzimatik kaskad sentezi ve müteakip saflaştırma, uygun şekilde önceden oluşturulmuşsa 48 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, dioksijenli reaksiyonlar için reaksiyon majörünün iyi oksijenlenmesinin gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir. Dikarboksidaz eklenmeden önce lizinin tamamının tüketildiğinden emin olmak için dikkatli bir izlemenin yanı sıra. Bu protokolün ana dezavantajı, dioksijenaz ve dekarboksilaz enziminin sınırlı sübvansiyonlu aralıklarıdır.

Bununla birlikte, amino asitlerden çeşitli amino alkollerin biyokatalitik sentezi, farklı bir enzim seti kullanılarak araştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, enzimatik bir kaskad reaksiyonunun nasıl önceden oluşturulacağını ve amino alkollerin karmaşık reaksiyon karışımlarından nasıl saflaştırılacağını iyi anlamalısınız. DNFB ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve aksi takdirde kişisel koruyucu ekipman giymek ve reaksiyonu bir davlumbazda oluşturmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.