Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri

Bu deneyin genel amacı, pupa dönemlerini evrelemek ve Drosophila guttifera'nın kanat pigmentasyonunu ölçmektir. Bu yöntem, Drosophila'da pigmentasyon modellerinin nasıl geliştirildiği gibi evrimsel gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, morfolojik gelişim ve pigmentasyon süreci hakkında detaylı bilgi edinebilmemizdir.

Bu yöntem, Drosophila guttifera'nın morfolojik gelişimi ve pigmentasyon süreci hakkında fikir verebilse de, diğer Drosophila türlerine de uygulanabilir. Puparium çıkarmaya başlamak için, kağıt havlu parçasına bir parça çift taraflı bant yapıştırın. Çift taraflı bandın üzerine ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir pupa yerleştirin.

Pupariumun ön tarafı ile iç pupa arasındaki boşluğu bulun. Forseps kullanarak bu boşluğun etrafındaki pupariumu kavrayın ve çıkarın. Ve pupa başının ön tarafını ortaya çıkarın.

Bir forsepsin ucunu ön-arka eksene paralel hareket ettirerek yerleştirin. Puparium'u yerel olarak kırmak için forsepsin ucunu kaldırın. Kırılma pupariumun arka kısmına ulaşana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Puparium ve pupa bacaklar arasında bir boşluk oluştuğundan emin olun. Ve iç pupaya verilen zararı en aza indirirken puparyumun ventral tarafını kırın. Puparium'u mümkün olduğunca kırdıktan sonra ince bir boya fırçası kullanarak pupayı çıkarın.

Pupayı ddH2O ile nemlendirilmiş ve plastik bir Petri kabına yerleştirilmiş bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Açıkta kalan pupa savunmasız olduğundan ve kolayca kuruduğundan hemen fotoğraf çekin. Görüntü hazırlamaya devam edin ve pupariumun ön kısmını forseps ile çıkarın.

Pupa'yı çıkarın ve plastik bir Petri kabında fosfat tamponlu tuzlu su içine veya PBS'ye yerleştirin. Ardından, bir kanadın bazal eklemini kesin. Kanat katlanırken, ozmotik basınçla uzatmak için ddH2O ile doldurulmuş plastik bir Petri kabına yerleştirin.

Yeni kapatılan yetişkinleri bir stok dosyasından her 10 dakikada bir toplayın. Bir CO2 anestezi pedi kullanarak bir sineği uyuşturun. Hareketsizlik ile anesteziyi onaylayın ve bir kanadın bazal eklemini kesin.

Bir cam slayta 10 mikrolitre PBS bırakın. Kanadı damlanın içine yerleştirin. Ve damlayı bir kapak fişi ile örtün.

Ardından, stereo mikroskobun ışığını açın ve maksimuma ayarlayın. Objektif lensi 11.5x'e ayarlayın ve diyaframı en açık duruma ayarlayın. Ardından kamerayı açın ve kamerayı ayarlayın.

Mikroskobun odak düğmesini hareket ettirerek örneğe odaklanın. Görüntü çekmek için uzaktan kumanda ünitesinin deklanşör düğmesine basın. Kanadın distal kısmını sol tarafa ve kanadın iç kısmını üst tarafa yerleştirerek, bir kampaniform sensillum ortalanmış kanadın bir görüntüsünü alın.

Ortasında campaniform sensillum noktası olan bir görüntü açın. Görüntüyü 8 bitlik görüntüye dönüştürmek için Görüntü'yü tıklatın, 1, 8 bit yazın. Alan seçim araçlarında dikdörtgeni tıklatın ve bir dikdörtgen çizin.

Dikdörtgenin sağ tarafını, kampaniform sensillum noktasının sağında yer alacak şekilde ayarlayın. Düzenle'yi, Seçim'i, Yöneticiye Ekle'yi tıklayın, ardından Tümünü Göster sütununu kontrol edin. Ardından, çizgi seçim araçlarında açı aracını tıklayın.

Üçüncü uzunlamasına venin arka çizgisine ilk çizgiyi çizin. Çizginin sol uç noktalarını önceden çizilmiş dikdörtgenin tepe noktasına getirin. Dikdörtgenin üst tarafına ikinci çizgiyi çizin.

Bu adımda çizilen iki çizgi arasındaki açıyı ölçmek için M tuşuna basın. Bilgisayarın ekranındaki görüntünün penceresine tıklayın. Düzenle, Seç, Yöneticiye Ekle'ye tıklayın.

Alan seçim araçlarında dikdörtgeni tıklatın ve görüntü penceresinin boyutunun yaklaşık 1/9'u kadar bir dikdörtgen çizin. Düzenle, Seç, Döndür'e tıklayın. Daha önce ölçülen açının eksi derecelerini Açı sütununa yazın ve bu adımda çizilen dikdörtgeni döndürmek için Tamam'ı tıklatın.

Ok tuşlarını kullanarak çizilen dikdörtgeni hareket ettirin ve dikdörtgenin sol tarafındaki ikinci uzunlamasına damarın arka çizgisinin uç noktasını ayarlayın. Ve dikdörtgenin alt tarafı, üçüncü uzunlamasına damarın arka çizgisine tutturulur. İkinci uzunlamasına venin uç noktasından üçüncü longitudinal venin arka çizgisine kadar dik bir çizgi çizildiğini onaylayın.

Dik çizginin ayağını A noktası olarak tanımlayın.İmleci A noktasına getirirken alan seçim araçlarının altında belirtilen A noktasının X koordinatını ve Y koordinatını kaydedin.Görüntüyü, A noktası merkezde olacak şekilde açın. Görüntüyü 8 bitlik görüntüye dönüştürmek için Görüntü, Tür, 8 bit'i tıklatın. Alan seçimi araçlarında dikdörtgeni tıklatın ve görüntü penceresinin boyutunun yaklaşık 1/9'u boyutunda bir dikdörtgen çizin.

Düzenle, Seç, Belirt'i tıklayın. Oval ve Ortalanmış sütunu kontrol edin. Genişlik ve yükseklik sütunlarına 100 piksel yazın.

X koordinat sütununa A noktasının X koordinatlarını yazın ve Y koordinatı sütununa A noktasının Y koordinatlarını yazın ve ardından Tamam'a tıklayın. Ardından, Analiz Et ve Ölç'ü tıklayın. Kalibrasyon zaten bitmişse, OD'ler Ortalama sütununda gösterilir. Birden fazla aşamanın verileri karşılaştırıldığında, evre P12'nin pigmentasyonun başlama zamanı olduğu ve pigmentasyonun eklosiyondan 12 saat sonra tamamlandığı ortaya çıktı.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, evrimsel gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların Drosophila türleri arasındaki pupa gelişimi ve pigmentasyon sürecindeki farklılıkları keşfetmelerinin yolunu açar.