Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Bu ikili etiketleme metodolojisinin genel amacı, bitki dokularının aktif olarak odunlaştırıcı bölgelerini gözlemlemektir. Bu iş akışında, kimyasal raporlayıcı stratejisi, biyo-ortogonal tıklama kimyası reaksiyonlarının sıralı bir kombinasyonunda iki farklı kimyasal raporlayıcı kullanılarak uygulanır. Bu yöntem, bitkiler ve duvarlar içindeki ligninin mekansal veya zamansal oluşumunu hangi faktörlerin düzenlediğini belirlemek gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların deşifre edilmesine yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, yalnızca metabolik Birleştirme sırasında üretilen lignini hedef almasıdır. Onu, numunede önceden var olan herhangi bir ligninden ayırır. Başlangıçta bu yöntemi odunlaşma bayraklarını incelemek için geliştirmiş olsak da, arabidopsis, kavak veya lignin üreten diğer herhangi bir bitki gibi diğer türlerle birlikte kullanılabilir.

Bu tekniği sunmak için, kimya ve biyoloji arasındaki arayüzde çalışan ve bu tekniği odunlaşma dinamiklerini incelemek için kullanan bir doktora öğrencisi olan Clemence Simon'a sahibiz. İlk olarak, on mikromüller alkin etiketli G raportör içeren 300 mikrolitrelik bir kimyasal raportör solüsyonu hazırlayın. Ve on mikromüller azid etiketli H raportör ve sıvı steril 1/2 MS ortam.

Çözeltiyi vorteksleyin ve bir transfer pipeti ile 48 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. On mikromüller G ve on mikromüller H ve sıvı steril 1/2 MS ortam içeren 300 mikrolitrelik bir negatif kontrol çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi girdaplayın ve aynı 48 oyuklu plakanın ikinci bir kuyusuna aktarın.

Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak, iki aylık bir keten bitkisinin sapını toprak seviyesinden on santimetre yükseklikte kesin. Tıraş bıçağını kullanarak sapın 50 serbest el enine kesitini özenle hazırlayın ve bunları hemen 1/2 MS'lik bir ortama yerleştirin. Daha sonra, sağlam, tüm kesitleri seçin ve dokuya zarar vermemeye dikkat ederek kimyasal raportör solüsyonu ile doldurulmuş kuyuya rastgele on tane dağıtın.

Kesitler sağlam ve temiz bir şekilde kesilmeli ve kesit düz olmalıdır. Dokuları sağlam tutmak için sabit bir elinize ve keskin bir tıraş bıçağına ihtiyacınız var. Önceden pratik yapmanız tavsiye edilir.

Negatif kontrol çözeltisinde on sağlam kesit dağıttıktan sonra, plakayı 20 saat boyunca 20 santigrat derecede bir büyüme odasında sürekli ışıkta inkübe edin. Ertesi gün, her bir kuyucuktaki monolignal çözeltiyi bir mikropipet ile çıkarın. Her kuyucuğa 500 mikrolitre 1/2 MS orta ekleyin ve on dakika boyunca hafifçe karıştırın.

Ardından, durulama solüsyonunu bir mikropipet ile çıkarın. Bir mililitre suş destekli azid-alkin siklo ekleme çözeltisi hazırlayın. Beş mikromüller siklookten etiketli floresan boya ve sıvı steril 1/2 MS ortam içerir.

Ardından, çözeltiyi girdaplayın. Metabolik birleştirme protokolünün son yıkama adımlarından sonra, 1/2 MS ortamını çıkarın ve bir mikropipet ile her bir oyuğa 300 mikrolitre SPAAC çözeltisi ekleyin. 48 oyuklu plakayı bir kutuya yerleştirerek ışıktan koruyun.

Ardından, plakayı ortam sıcaklığında karanlıkta bir saat boyunca mekanik bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe karıştırın. Bunu takiben, plakayı karanlıkta tutarken, daha önce tarif edildiği gibi her bir kuyuyu 1/2 MS ortamı ile dört kez yıkayın. Sodyum askorbat, bakır sülfat ve azid etiketli floresan boya ve sıvı steril 1/2 MS ortamı içeren bir mililitre bakır katalizli azid alkin siklo ekleme çözeltisi hazırlayın.

Sonra çözeltiyi girdaplayın. 1/2 MS ortamını çıkardıktan sonra, plakayı bir kutuya yerleştirin ve bir mikropipet ile her bir oyuğa 300 mikrolitre CuAAC çözeltisi ekleyin. Plakayı, ortam sıcaklığında karanlıkta bir saat boyunca mekanik bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe karıştırın.

Plakayı mekanik çalkalayıcıdan çıkarın ve CuAAC çözeltisini bir mikropipet ile her bir kuyucuktan çıkarın. Ardından, 500 mikrolitre 1/2 MS ortam ekleyin ve plakayı karanlıkta on dakika boyunca mekanik çalkalayıcı üzerinde karıştırın. 1/2 MS ortam ile iki kez daha yıkadıktan sonra, her kuyucuğa 500 mikrolitre 7: 3 metanol ve su çözeltisi ekleyin.

Plakayı karanlıkta bir saat boyunca mekanik çalkalayıcı üzerinde karıştırın. Ardından, çözeltiyi kuyulardan çıkarın. Daha sonra, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre 1/2 MS orta ekleyin ve karanlıkta on dakika karıştırın.

Bu yıkamayı dört kez tekrarladıktan sonra, kesitleri 1/2 MS ortamında, ışıktan korunarak saklayın. Bir cam mikroskop lamı üzerine beş damla montaj ortamı yerleştirin. Ardından, kimyasal raportör etiketli her bir kesiti slayta dikkatlice yerleştirin.

Slaytın iki zıt tarafına oje sürün. Hava kabarcıklarını önlemek için sürgünü bir kapak kaymasıyla, örtün. Ardından, bir kağıt havlu kullanarak fazla montaj ortamını çıkarın.

Bunu takiben, numuneyi dört taraftan da oje ile kapatın. Tırnak cilası kuruduktan sonra, slaytları konfokal mikroskop altında gözlemlenene kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Bitki bölümleri kuruduğunda gevrekleşme eğilimindedir.

Bunları her zaman solüsyon içinde tuttuğunuzdan ve kapak fişlerini her taraftan oje ile kapattığınızdan emin olun. Montajı yapılan kızakların raf ömrünü arttırır. Numune slaytını objektif merceğin altındaki mikroskop sahnesine yerleştirin.

Bitki dokusunun istenen bölgesini belirlemek için numuneyi gözlemleyin ve döndürün. Ardından, Z eksenindeki en floresan düzlemi seçin. Her kanal için tüm gri seviye aralığı boyunca optimum sinyal dağılımını elde etmek için kazancı, ofseti ve lazer gücünü ayarlayın.

Son olarak, yüksek kaliteli konfokal görüntüler elde edin. BLISS, bitki hücre duvarları içindeki ligninin üç renkli lokalizasyon haritasını sağlar, yalnızca metabolik dahil etme sırasında in novo'da üretilen lignini hedefler ve bunu numunede önceden var olan ligninden ayırır. Bir organın farklı dokuları içinde, bir dokunun farklı hücre tipleri içinde veya bir hücrenin farklı duvar katmanları veya alt yapıları içindeki aktif lignifikasyon bölgelerini vurgular.

Alkin etiketli G ve azid etiketli H raportör birleştirme profilleri, kambiyumdan keten ikincil ksilem içindeki öze kadar olan birleşme profilleri, gelişim sırasında lif tracheidlerinde maksimum lignifikasyona hızla ulaşıldığını, ırk hücrelerinin ise yaşamlarının çok daha sonraki aşamalarında lignin içermeye devam ettiğini göstermektedir. Kimyasal raportör oranının değiştirilmesi, ikincil ksilem dokularındaki lignin bileşiminin doğrudan hücre duvarları içindeki monolignal mevcudiyetine bağlı olduğunu göstermektedir. Lignin polimerizasyonu sırasında peroksidaz veya lakkaz özgüllüğü yerine.

Kimyasal raportör katılımı, bazılarının hücre köşeleri ve orta lamel birincil hücre duvarı ile sınırlıdır, ancak tüm sak lifleri ile sınırlı değildir. Keten köklerinde, kimyasal raportörler, kaspariyen bandın bulunmadığı endodermal hücrelerin duvarlarına dahil edilir. Doku mimarisinin daha iyi görselleştirilmesi için 3D Z yığını rekonstrüksiyonları da oluşturulabilir.

Bu görseli takiben kapsamlı bir veri işleme de gerçekleştirilebilir. Tüm önlemler alındığında, farklı numuneler arasında bir numune okuyarak nispi karşılaştırma yaparak sabit sonuçlar elde etmek mümkündür. Farklı alanların aktif liderliğinin lokalizasyonuna ek olarak da yapılabilir.

Bu yöntem, hücre duvarını inceleyen benim gibi bitki biyologları için harika bir araçtır. Ustalaştıktan sonra, birkaç saat içinde yapılabilir. Çok hassastır ve bir dizi farklı in vitro in vivo deneysel model sistemine uygulanabilir.

Kimyasal raportör stratejisini lignine uygulamak, kimyasal biyologların lignifikasyon dinamiklerini keşfetmesinin ve birçok açıdan hala keşfedilmemiş bir bölge oluşturan bu polimerizasyon sürecini neyin kontrol ettiğini bulmasının yolunu açar.