Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Bu epifloresan intravital video mikroskobunun veya kan damarlarının IVM protokolünün genel amacı, farelerde Anjiyotensin II'nin neden olduğu hipertansiyonda aşınmış arterlerde lökosit yuvarlanmasını ve yapışmasını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntem, vasküler disfonksiyon ve arteriyel hipertansiyon patolojisinde, lökositler ve özellikle lizozomlar ve pozitif hücreler arasındaki etkileşim mekanizması ve damar çalışması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dolaşımdaki kan hücreleri ile vasküler anlayış arasındaki in vivo etkileşimleri görebilmemizdir.

Metin protolüne göre, yedi günlük anjiyotensin iki tedavisinden sonra osmatik bir pompa ile ameliyat için bir erkek fare hazırlayın. İşlem sırasında onları korumak için gözlerin üzerine oftalmik merhem sürün. Anestezi uygulanmış hayvanı 39 santigrat derecelik bir cerrahi plaka üzerine sırt yaslanma pozisyonuna yerleştirin ve sıcaklığı korumak için bir rektal prob yerleştirin.

Tüyler dökülmeye başlayana kadar tüy dökücü kremi boynunuza yaymak ve ovalamak için pamuklu çubuk kullanın. Ardından, 2 dakika daha sonra, tüyleri ve kremayı çıkarmak için bir spatula kullanın. Ardından, alkollü bir cilt antiseptiği kullanarak cildi dezenfekte edin.

Daha sonra, bir stereo mikroskop altında, boynun derisinde, trakeadan 1 cm uzakta, 1 ila 1.5 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Ardından, ilk insizyonun her iki ucunda 2 dikey kesi yapın. Derinin hemen altındaki dokuyu dikkatlice çıkarın ve sol juguler ven ve soluk borusunu kaplayan deri parçasını çıkarın.

Daha sonra, dil altı ve submaksiller aşınmış bezleri ilgilenilen bölgeden dikkatlice izole etmek için iki kavisli forseps kullanın. Bezleri kesmemeye veya zarar vermemeye özen gösterirken, bunları şah damarına ve kordonlara en iyi şekilde erişecek şekilde konumlandırın. Daha sonra, juguler veni izole etmek için, damar ile çevresindeki doku arasına ince forseps yerleştirin ve damarı dokudan nazikçe serbest bırakmak için aleti yavaşça açıp kapatın.

Şah damarı tamamen temizlendikten sonra, forsepsleri damarın altına yerleştirin ve altına iki adet 10 cm uzunluğunda 7-0 dikiş yerleştirin. Dikişi başın proksimalini kapatmak için iki düğüm atın ve ikinci dikişle bir düğüm hazırlayın, ancak kapatmayın. Şimdi, bir elinizde forseps ile, 37 santigrat derece steril salin ile doldurulmuş kateteri tutun, ardından diğer elinizle damar içine küçük bir kesi yapmak için makas veya kavisli 26 gauge iğne kullanın.

Kateteri juguler ven içine yerleştirin ve düğümü iki kez kapatın. Ardından, tam immobilizasyonu sağlamak için sütürü kateterin üzerinden başa yakın bir yere kapatın. Korozyona uğramış arterleri izole etmek ve hazırlamak için, trakeayı kaplayan alanı incelemek için ince kavisli forseps kullanın.

Daha sonra, aşınmışlar çevre dokulardan serbest kaldığında, siniri nazikçe harekete geçirmek için gerekirse ince forsepsleri yavaşça kapatıp açarak vegas sinirini kesmeden damardan çıkarın. Her iki arter de tamamen temizlendikten sonra, forsepsleri ilk aşınmış arterin altına yerleştirin ve damarı aşırı germemeye dikkat ederken, damarın altına küçük, siyah, 3 mm x 2,5 cm plastik bir damar tutucu yerleştirin. Damar tutucu yerine oturduktan sonra kan akışının mevcut olduğundan emin olun.

Damarın gerilmesini önlemek için, operatörün eli, aşınmış arteri izole etmek için birinci forsepsin tek bir hareketi ve damarın altında bir delik açmak için ikinci forsepsin yardımıyla mümkün olduğunca az hareket etmelidir. Damar tutucu doğru şekilde yerleştirildiğinde, ikinci arteri cihazın üzerine yerleştirin. Fare doğrudan mikroskobun altına yerleştirilmezse, bezleri trakeanın üzerine geri yerleştirin ve bölgenin kurumasını önlemek için 37 santigrat derece steril salin uygulayın.

1 mL'lik bir şırıngada, steril salin içinde 1-4 seyreltme, mL çözülmüş akridin portakal stok çözeltisi başına 2 mg hazırlayın. Şırıngayı ışıktan koruyun. Ölçümleri yapmak için, fareyi uzun mesafeli bir kondansatör ve bir monokromatör, bir ışın ayırıcı ve bir CCD kamera ile 10x suya daldırma objektifi kullanarak yüksek hızlı, geniş alanlı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin.

Hedefi endotel yüzeyindeki aşınmış arterin ortasına odaklayarak gerçek zamanlı olarak görüntüler elde edin. Yavaşça 50 mL akridin portakalı enjekte edin. Ardından, yazılımı, resim başına 120 milisaniye pozlama süresiyle 100 görüntü kaydedecek şekilde ayarlayın.

Her video için arter üzerinde farklı yerlerde aşınmış arter başına dört video kaydedin. Floresan sinyali azalırsa, 50 mL daha akridin portakalı enjekte edin. Farklı koşulları test etmek için, bir juguler kateter yerleştirilmemişse, akridin portakalını doğrudan lateral kuyruk venine enjekte edin ve aynı görüntü alımını gerçekleştirin.

Kontrol olarak, enjekte edilmemiş lys-Mcre-pozitif, IRG-pozitif farelerden floresan ölçümlerini kaydedin. Saniyede 10 görüntü hızında görüntülenen her video için kabın ortasına yerleştirilmiş 200 mikron x 250 mikron dikdörtgen görünümde yuvarlanma ve yapışma hücrelerini ölçün. Yuvarlanma ve yapışma hücrelerini sayın.

Yapışıklık hücreleri, 10 saniyelik video içinde endotelden hareket etmeyen veya ayrılmayan hücreler olarak tanımlanır. Kantitasyonu basitleştirmek için, kırmızı floresan içeren kanalı çıkarın ve yuvarlanan ve yapışan hücreleri saymak için yalnızca yeşil floresansı kullanın. Bu çalışmada, anjiyotensin 2 ile infüze edilen lys-mCre pozitif, IRG pozitif farelerin aşınmış halleri IVM kullanılarak gözlendi.

Burada başlangıçta görüldüğü gibi, bir juguler kateterin varlığı, lys-M-pozitif floresan hücrelerin yapışması ile sonuçlandı. Akridin portakal enjeksiyonundan sonra, endotel hücreleri de floresan idi. Daha sonra, endotel ile ilişkili floresansı sınırlamak için arka planın azaltılması, tüm çekirdekli yapışan hücrelerin lys-M pozitif olduğunu ortaya çıkardı.

Bu deneyde, bir haftalık anjiyotensin 2 infüzyonundan sonra, lys-M Cre pozitif IRG pozitif farelerin aşınmış arterlerindeki lökosit endotel etkileşimleri, akridin portakal enjeksiyonu olsun veya olmasın, juguler kateter yoluyla veya kuyruk damarı yoluyla IVM ile görüntülendi ve görselleştirildi. Herhangi bir kateter veya enjeksiyon olmadan, lys-M pozitif hücrelerin yuvarlanması, anjiyotensin 2 infüzyonundan sonra, tedavi edilmeyen farelere kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Ve yapışma da arttı.

Juguler kateter ile akridin portakal enjeksiyonu, anjiyotensin 2 ile tedavi edilen farelerde, kateteri olmayan farelere kıyasla daha büyük ölçüde yapışmayı ve yuvarlanmayı arttırdı. Son olarak, bu panellerde görüldüğü gibi, kuyruk damarına akridin portakalı enjeksiyonu, akridin portakal enjeksiyonu yapılmayan farelere kıyasla benzer yapışma ve yuvarlanmaya yol açar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa otuz dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, damarları çevreleyen dokulara zarar vermemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kardiyovasküler ve hemostatik alanlardaki araştırmacıların in vivo olarak lökositleri ve trombositlerin vasküler duvara yapışmasını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, IVM'de boya enjeksiyonu ve ameliyatın etkisini nasıl sınırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Enterkalasyon yapan floresan boyalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven gibi uygun malzemelerle boya ile cilt temasından kaçınılması gerektiğini unutmayın.