<em>In Vivo</em> Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Adekunle T. Bademosi; Elsa Lauwers; Rumelo Amor; Patrik Verstreken; Bruno van Swinderen; Fr&#233;d&#233;ric A. Meunier

doi:10.3791/56952

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

JoVE Journal
Neuroscience
Author Produced

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Full Text

8,983 Views

06:45 min

January 14, 2018

DOI: 10.3791/56952-v

Adekunle T. Bademosi¹, Elsa Lauwers², Rumelo Amor³, Patrik Verstreken², Bruno van Swinderen³, Frédéric A. Meunier¹

¹Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute,The University of Queensland, ²VIB Centre for Brain and Disease Research, KU Leuven Department of Neurosciences,Leuven Institute for Neurodegenerative Disease (LIND), ³Queensland Brain Institute,The University of Queensland

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study demonstrates in vivo single-molecule tracking using photo-activated localization microscopy (PALM) at the motor nerve terminal of third-instar Drosophila melanogaster larvae. The technique allows high-resolution imaging and tracking of individual synaptic proteins, crucial for understanding neuronal communication.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Live Imaging
Synaptic Physiology

Background

The complexity of synaptic proteins' movement is crucial for neuronal function.
Understanding protein dynamics at neuromuscular junctions can reveal critical aspects of synaptic transmission.
Previous methods lacked the resolution needed for tracking individual molecules.
Single-molecule techniques could provide insights into synaptic organization and dynamics.

Purpose of Study

To illustrate how single proteins can be tracked and imaged in vivo.
To investigate the mobility and localization of synaptic proteins using PALM.
To provide a detailed methodology for future applications in neuronal studies.

Methods Used

Photo-activated localization microscopy (PALM) was employed.
Drosophila melanogaster larvae served as the biological model, focusing on presynaptic motor terminals.
The study utilized transgenic Drosophila expressing the synaptic protein Syntaxin-1A tagged with a photoconvertible fluorophore.
Dissection and immobilization of larvae on a Sylgard base allowed for effective imaging.
Multiple laser configurations were used for imaging and photoconversion, acquiring a 15,000-frame movie for analysis.

Main Results

The study successfully tracked single Syntaxin-1A-eMos2 proteins at neuromuscular junctions.
Analysis indicated the presence of mobile and immobile populations of Syntaxin-1A based on diffusion coefficients.
Mean square displacement and frequency distribution were characterized to assess protein mobility.
Findings enhance understanding of synaptic protein dynamics and organization in living systems.

Conclusions

This research demonstrates a robust method for visualizing single protein movements in live neurons.
The findings contribute to our understanding of synaptic mechanisms and neuronal plasticity.
This technique could facilitate advanced studies in synaptic biology and neurobiological disorders.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using PALM for this research?

PALM provides high-resolution imaging of single molecules, allowing precise tracking of proteins at neuromuscular junctions in vivo, which standard imaging techniques cannot achieve.

How is the Drosophila model implemented in this study?

Drosophila melanogaster is genetically modified to express the synaptic protein Syntaxin-1A tagged with a photoconvertible fluorophore, facilitating the study of protein dynamics in live larvae.

What types of data are obtained from this method?

The method provides detailed insights into protein mobility, localization, diffusion coefficients, and the presence of distinct protein populations at synapses.

How can the PALM technique be applied or adapted in future research?

PALM can be adapted to track other synaptic proteins or used in different models, enhancing our understanding of various neurophysiological processes.

What are the key limitations of this study?

The technique requires advanced imaging equipment and expertise, which may limit its accessibility. Additionally, the dissection process may introduce variability in larval preparation.

How does this research contribute to understanding synaptic communication?

By providing insights into the mobility and organization of synaptic proteins, this research enhances our understanding of synaptic functions and mechanisms underlying neuronal communication.

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Drosophila presinaptik motor sinir terminalinde in vivo tek molekül takibi. Bu teknik, tek proteinlerin üçüncü instar Drosophila larvalarının motor sinir terminallerinde in vivo olarak nasıl izlenebileceğini ve görüntülenebileceğini açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, tek proteinlerin in vitro sistemlerde gözlemlenene benzer yüksek çözünürlüklerde görüntülenmesine, izlenmesine ve lokalize edilmesine izin vermesidir.

Transgenik Drosophila'nın tasarımı. İlgilenilen sinaptik protein, fotokonvertibl bir florofor ile etiketlenir ve bu, Drosophila melanogaster'de ifade edilir. Üçüncü instar Drosophila larvasının diseksiyonu.

Silindirik veya yarı silindirik şekilli bir Sylgard tabanına dolaşan bir üçüncü larva yerleştirin. Larvanın üzerine 40 mikrolitre Schneider's Insect Medium ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, hareketsiz hale getirmek için larvanın başından bir minutien pimi ve larvanın kuyruğundan bir tane daha geçirin.

Erişim sağlamak için, larvanın karın bölgesinin dorsal tarafının orta hattında dar bir kesi yapmak için bir minutien pimi kullanın. Bu kesi noktasından, yaylı makas kullanarak, vücut duvarı boyunca ön arka yönde kesin. İnce forseps ve yaylı makas yardımıyla larvanın iç organlarını çıkarın.

Disseke edilmiş larvaları Schneider's Insect Medium ile yıkayın. Altıgen şeklinde disseke edilmiş bir larva hazırlığı elde etmek için iki vücut duvarı kanadının her birine iki minutien pimi yapıştırın. Larva beynini ventral sinir kordonundan ayırmak için yaylı makas kullanın.

Kavisli cımbız kullanarak minutien pimlerini Sylgard tabanına itin. Tek parçacık izleme foto-aktif lokalizasyon mikroskobu. Larvaların Sylgard tabanını, iki mililitre oda sıcaklığında Schneider's Insect Medium ile doldurulmuş cam tabanlı bir kültür kabına ters çevirin.

ELYRA PS.1 mikroskobunun 63x suya daldırma objektifine su uygulayın ve ardından tabağı sahneye yerleştirin. İletilen ışığı açın ve 10x hava hedefinin yardımıyla Sylgard tabanındaki larvayı bulmak için göz merceğini kullanın. 63x suya daldırma hedefine geçin ve parlak alan aydınlatmasını kullanarak altıncı kasları belirleyin.

ZEN Black Acquisition Yazılımını kullanarak Toplam Dahili Yansıma Floresansı, TIRF, yapılandırmayı seçin. eMos2'yi yeşil renkte görselleştirmek için 488 nanometre lazeri değiştirin. Bir ipteki boncuklar gibi görünen nöromüsküler kavşakları bulun ve düşük çözünürlüklü bir TIRF görüntüsü elde edin, aynı anda 405 nanometre lazeri ve 561 nanometre lazeri foto dönüştürmek ve eMos2 kırmızı türlerini görüntülemek için açın.

Orta derecede sabit stokastik fotodönüşümlere izin vermek için 405 nanometre lazer için çok düşük lazer gücü kullanın. Burada 405 nanometre lazer %0.09'da çalıştırılırken, 561 nanometre lazer %50'de çalıştırılır Yazılım üzerindeki TIRF Açısı seçeneklerinde TIRF Kritik Açı'yı hafifçe dışarı kaydırın. Pozlama süresini 30 milisaniye olarak ayarlayın.

Nöromüsküler kavşağın bir zaman serisi görüntüsünü elde edin. Burada 15.000 karelik bir film elde edildi. Filmi czi formatında bir dosya olarak kaydedin.

Veri analizi. Elde edilen filmleri uygun tek moleküler izleme analitik yazılımı ile analiz edin. Yoğunluk noktası yayılma fonksiyonunun Gauss uyumu ile her bir floresan protein lokalizasyonunun x ve y koordinatlarını bulun.

Her yerelleştirmenin yörüngesini izlemek için, her yerelleştirme için en az sekiz sürekli farklı kare görünümü eşiği ve her kare arasında en fazla üç piksel hareketliliği ayarlayın. İzlenen tüm lokalizasyonların yörünge görüntüsünü, ortalama kare yer değiştirmesini ve difüzyon katsayısını elde edin. Temsili sonuçlar.

Syntaxin-1A-eMos2'nin bireysel yörüngelerinin üç farklı larvadaki çoklu nöromüsküler kavşaklardan ortalama kare yer değiştirmesi, ortalama artı eksi standart ortalama hatası olarak çizildi. Ortalama kare yer değiştirme eğrisinin altındaki alan da çizildi. Syntaxin-1A-mEos2'nin difüzyon katsayısı benzer şekilde çoklu nöromüsküler kavşaklardan elde edildi ve nispi frekans dağılımının bir histogramı olarak çizildi.

Difüzyon katsayısı eşiği, bir mobil ve bir hareketsiz popülasyon olmak üzere iki Syntaxin-1A popülasyonunu ortaya çıkardı. Syntaxin-1A-mEos2'nin mobil ve hareketsiz popülasyonlarının oranı hesaplandı. Son. Bu video, Drosophila larvalarının nöromüsküler kavşağında tek protein izlemesinin nasıl yapılabileceği hakkında bir anlayış sağlamalıdır.

Teknik, nöronal iletişim alanındaki araştırmacıların, tek proteinlerin hareketliliğini ve organizasyonunu in vivo olarak yüksek çözünürlüklerde görselleştirmeleri ve gözlemlemeleri için bir yol sağlar.