X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Bu prosedürün genel amacı, hem x-ışını kristalografisi hem de küçük açılı x-ışını saçılımı ile hibrit yapısal analiz için sıralı ve düzensiz alanların bir karışımından oluşan bir rekombinant protein üretmektir. Bu yöntem, yapısal biyolojide, tüm çözeltilerin belirlenmesi proteinin yapısını koruyacak şekilde biyolojik fonksiyonun yerleştirilmesiyle ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, x-ışını kristalografisi ile çözülemeyen bir protein veya makro molekülün dinamik bölgelerini modellemek için kullanılabilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, başlangıçta SAXS verilerinin kalitesini nasıl düzgün bir şekilde değerlendireceklerini öğrenmekte zorlanacaklardır. Prosedüre başlamak için, bir Nsa1 ekspresyon plazmidini uygun bir E.coli ekspresyon suşuna dönüştürün. Hücreleri kültürleyin, Nsa1 ekspresyonunu indükleyin ve hücreleri hasat edin.

Hücreleri 25 mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin, bir EDTA içermeyen proteaz inhibitör tableti içeren dört santigrat dereceye kadar soğutun. Hücreleri yedi dakika boyunca dört santigrat derecede sonikasyon, iki saniye açık, iki saniye kapalı bir döngü ile. Daha sonra, lizatı dört santigrat derecede 45 dakika boyunca yerçekiminin 26.900 katında santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında karışımın donmadığından emin olun. Daha sonra, 10 ml hareketsizleştirilmiş kobalt afinite reçinesi içeren bir yerçekimi akış kolonunu lizis tamponu ile dengeleyin. Arıtılmış lizatı kolona yükleyin ve reçineden dört santigrat derecede akmasına izin verin.

Daha sonra reçineyi 100 ml'lik porsiyon lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Nsa1'i 20 ml elüsyon tamponu ile kolondan elute edin. Proteinin elüsyonunu doğrulamak için dört ila% 15'lik bir SDS-PAGE jeli üzerinde 15 mcl'lik bir alikot çalıştırın.

Ardından, eluere'ye 1 mg / ml TEV proteaz stok çözeltisinden 1 ml ekleyin. MBP etiketini çıkarmak için eluere'yi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, MBP ile bölünmüş Nsa1'i yaklaşık 5 ml'ye konsantre etmek için 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtre ünitesi kullanın ve aşırı konsantre olmamaya dikkat edin.

Konsantre proteini, Tampon A ile önceden dengelenmiş bir jel filtrasyon kolonunda saflaştırın.Bu prosedürdeki kritik adımlardan biri, saflaştırma sırasında tüm agregaları çıkarmanızı sağlamaktır. Agregalar, kristalleşme ve SAXS veri toplama ve analizlerine müdahale edecektir. MBP'nin Nsa1'den ayrıldığını doğrulamak için SDS-PAGE ile her sütun fraksiyonundan 15mcl numuneleri analiz edin.

Nsa1 içeren kesirleri birleştirin. Kombine fraksiyonları yaklaşık 8 mg / ml'ye konsantre etmek için 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtre ünitesi kullanın. Absorbansı 289 nanometrede ölçün ve protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Hemen proteolitik tarama ve kristalizasyon denemelerine devam edin. Proteolitik taramaya başlamak için, Alfa-komotripsin, tripsin, elastaz, capayin, septilisin ve Endoproteinaz GluC'nin 1 mg / ml stok çözeltilerini hazırlayın. Her stok çözeltisini seyreltme tamponu ile 1:10, 1:100 ve 1:1.000 oranında seyreltin.

8 mg / ml Nsa1 çözeltisini Tampon A ile 1 mg / ml ila seyreltin. Ardından, her proteaz seyreltmesi için 1 mcl proteaz seyreltmesini 9 mcl seyreltilmiş protein stoğu ile birleştirin. Çözeltileri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her çözeltiye tamponlamak için 10mcl 2x SDS-PAGE örneği ekleyin ve çözeltileri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

Proteaza dirençli alanları belirlemek için çözeltileri %4 ila %15'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın. Proteaz kararsız bölgeleri dışlayan kesik ifade yapıları oluşturun. Kristalleşme optimizasyonu için bu proteinleri eksprese edin ve saflaştırın.

Nsa1 proteini için bir dizi konsantrasyonda SAXS verilerini aldıktan sonra, terminal kabuk dosya yolunu verileri içeren dizine ayarlayın. Ardından, analiz yazılımını başlatın. Saçılma eğrilerini analiz yazılımına yükleyin.

Her eğri için dönme yarıçapını ve ileri saçılma yoğunluğunu belirlemek için otomatik RG aracını kullanın. Ardından, kompaktlık derecesini belirlemek için her saçılma eğrisi için Kratky grafikleri oluşturun. Dönme yarıçapının 3 katı bir başlangıç maksimum boyutu kullanarak her eğri için ikili dağılım fonksiyonunu hesaplamak için otonom aracını kullanın.

Deneysel saçılma eğrisi ile tutarlı olan düzgün, çift yönlü bir dağılım fonksiyonu eğrisi elde etmek için maksimum boyutu optimize edin. Radyasyon hasarının veya konsantrasyona bağlı etkilerin olmadığını doğrulamak için yapısal parametreleri konsantrasyonlar arasında karşılaştırın. Bir konsantrasyon serisi boyunca dönme yarıçapı, moleküler kütle, ileri saçılma ve çift mesafe dağılımı fonksiyonları dahil olmak üzere temel yapısal parametreleri karşılaştırmak çok önemlidir.

Ve bu, radyasyon hasarı veya konsantrasyon etkisi olmadığından emin olmak içindir. Ardından, başlangıç protein kristal yapı dosyasını, hedef protein dizisi dosyasını ve deneysel SAXS veri dosyasını kullanarak topluluk optimizasyon yöntemi yardımcı programını çalıştırın. Topluluk modelinin deneysel verilere iyi uyup uymadığını belirlemek için başlangıç kristal yapı dosyasından ki-kare değerlerini topluluk dosyasıyla karşılaştırın.

Kristal yapıyı oluşturulan konformerlerle kaplamak için moleküler görselleştirme yazılımı kullanın. Saçılma eğrisine katkıda bulunan toplam konformer sayısını ve her bir konformer için doluluk oranını not edin. Nsa1'in proteaz kararsız C terminalinin proteolitik bölünmesi, ortorombik kristallerin oluşumuna neden oldu.

Taze saflaştırılmış Nsa1 kübik kristaller oluşturdu, ancak kristal yapı, kararsız c terminali için hala elektron yoğunluğundan yoksundu. Nsa1'in n-terminal yedi blasyonlu beta pervaneli WD-40 alanı her iki yapıda da iyi çözülmüştür. Nsa1 WD-40 alanı tek başına deneysel SAXS verileri için uygun değildi.

Sert cisim modellemesi ve C terminalinin aborjik rekonstrüksiyonunun bir kombinasyonu, uyumun iyiliğini önemli ölçüde geliştirdi. Topluluk modellemesi, uyum iyiliğinde daha da büyük bir gelişme sağladı ve çözeltideki C-terminal kuyruğunun doğrulayıcı örneklemesini ortaya çıkardı. SAXS düşük çözünürlüklü bir yapısal teknik olsa da, x-ışını kristalografisi gibi yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları çok iyi tamamlar.

Böylece esnek ve düzensiz bölgeleri modelleyebilirsiniz. Makromolekülün SAXS verilerini toplayıp analiz ederek, meydana gelen doğrulayıcı değişikliği anlamaya başlayabilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, hem x-ışını kristalografisi hem de SAXS ile düzenli ve düzensiz bölgelerden oluşan bir proteinin yapısını nasıl çözeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.