Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Bu protokolün genel amacı, gelişmekte olan embriyoların canlı hücrelerindeki metabolitleri in situ mikroörnekleme kapiler elektroforez-kütle spektrometresi ile karakterize etmektir. Bu yöntem, hücre ve gelişim biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü tek hücrelerdeki metabolizmanın doğrudan canlı gelişmekte olan embriyolarda analiz edilmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı olması, farklı hücre boyutlarına ölçeklenebilir olması ve canlı embriyolarda tek tek hücrelerin minimal invaziv örneklemesini mümkün kılmasıdır.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü embriyo nispeten hızlı gelişir ve özel yapım bir kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon aleti kullanılır, çünkü bazı adımların öğrenilmesi zordur. Bu prosedüre, 1X Steinberg çözeltisinde% 2 agaroz hazırlığı ile başlayın. Hala sıvı iken, 60 milimetrelik Petri kaplarının altını solüsyonla kaplayın.

Agaroz jeli soğuduktan ve katılaştıktan sonra, altı inçlik bir Pasteur pipetinin ucunu bir top oluşturana kadar alevlendirin. Ardından, agarozun yaklaşık bir milimetre derinliğinde beş ila 10 kuyu basmak için ısıtılmış uca hafifçe dokunun. Konik uçlu mikropipetler üretmek için, önce metin protokolünde bulunan ayarları kullanarak borosilikat kılcal damarları Alevli/Kahverengi tip bir kılcal çektirme içinde çekin.

Daha sonra, yaklaşık 20 mikronluk bir kılcal uç dış çapı elde etmek için bir çift ince keskin forseps kullanarak çekilen mikropipetin ucunu kırın. Hassasiyet ve tekrarlanabilirliğe yardımcı olmak için bu adımı stereo mikroskop altında gerçekleştirin. Yetişkin xenopus laevis'in gonadotropin kaynaklı doğal çiftleşmesi veya metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi in vitro fertilizasyon yoluyla embriyolar elde edin.

Embriyoları çevreleyen jöle kaplamaları, önce embriyoların iki dakika boyunca jöle giderme solüsyonunda dinlenmesine izin vererek, iki hücreli aşamaya ayrılmaya başladıklarında çıkarın. Ardından, embriyoların toplama kabının yüzeyine yapışmasını önlemek için iki dakika daha hafifçe döndürün. Çanak içeriğini yavaşça temiz bir behere dökün ve jel giderme solüsyonunu beherden hızlı bir şekilde boşaltın.

Kalan jöle giderme solüsyonunu durulamak için yumurtaları hemen 0.1X Steinberg solüsyonu ile örtün. Çözeltiyi yavaşça döndürün ve ardından boşaltın. Embriyoları iyice yıkamak için bu adımı dört kez tekrarlayın.

Jöleli embriyoları bir Petri kabında 1X Steinberg solüsyonuna aktarın. Plakalardaki kalabalığı en aza indirmek için, 100 milimetrelik çanağa yaklaşık 100 embriyo yerleştirin. İki hücreli aşamada parçalanan embriyoları, stereotipik pigmentasyonun sülfat haritaları oluşturmak için referans olarak dorsal ventral erişimi güvenle işaretlediği ayrı bir tabağa sıralayın.

Midsagital düzlemi belirleyen ilk bölünme karığının, koyu pigmentli hayvan çekimini ve hafif pigmentli hayvan çekimini, iki yarısı ayna görüntüleri olacak şekilde ikiye böldüğünden emin olarak embriyoları doğru bir şekilde tanımlayın. Ardından, fabrikasyon bir mikropipeti çok eksenli bir mikromanipülatöre monte edin. Mikropipeti bir mikroenjektöre bağlayın.

Sekiz hücreli embriyolardan yaklaşık beşini aspire etmek için plastik bir transfer pipeti kullanın ve bunları 0.5X Steinberg çözeltisi içeren örnekleme kabına aktarın. Bir saç halkası kullanarak, örneklenecek embriyoyu tek bir kuyucuğa yerleştirin ve doğru tanımlanmış ilgili hücrenin mikroproba yaklaşık 90 derecelik bir açıyla baktığından emin olun. Stereo mikroskop altında çalışırken, mikropipetin ucunu canlı embriyo içinde tanımlanan tek hücreye yönlendirin.

Mikroenjektörü kullanarak mikrokılcal damara negatif basınç darbeleri uygulayarak hücre içeriğinin istenen bir bölümünü geri çekin. Mikroprobu hücreden nazikçe geri çekin ve ucunu mikro boyutlu bir şişede soğutulmuş dört mikrolitre metabolit ekstraksiyon çözücüsüne aktarın. Ardından, aspiratı çözücüye atmak için mikroenjektörü kullanarak kılcal damara bir saniye boyunca pozitif 80 psi'lik bir basınç dalgalanması uygulayın.

Buharlaşmayı önlemek için şişeyi sıkıca kapatın ve numune alma tamamlanana kadar şişeyi tekrar buzun üzerine yerleştirin. Numune alma işlemi tamamlandıktan sonra, metabolitlerin ekstraksiyonunu hızlandırmak için mikrosantrifüj şişeleri içeren numuneyi yaklaşık bir dakika boyunca vorteks karıştırın. Daha sonra, hücresel kalıntıları ve diğer partikülleri topaklamak için şişeleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 8.000 kez g'de santrifüjleyin.

Hücre ekstraktlarını hücre kalıntıları ile birlikte saklayın ve CE-ESI-MS ile ölçüme kadar bir gün boyunca eksi 20 santigrat derecede veya eksi 80 santigrat derecede bir aya kadar çökeltin. Metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi arka plan elektrolit şişesini ve numune yükleme mikroflakonunu tutan bir aşamanın hızlı dikey öteleme yeteneğine sahip CE enjeksiyon platformunu oluşturun. Önce elektrosprey metal yayıcıyı üç portlu bir T-rakoruna monte ederek CE-ESI arayüzünü monte edin.

Ardından, ayırma CE kılcalını elektrosprey yayıcıdan besleyin ve emitörün ucunun yaklaşık 40 ila 100 mikron ötesine çıkıntı yapmasına izin verin. Doğruluğa yardımcı olmak için stereo mikroskop altında çalışın. Elektrosprey çözeltisini beslemek için tabaka çözeltisi kılcalını kalan porta bağlayın.

CE-ESI arayüzünün sızdırmaz çalışması için uygun manşonlar ve parmakla sıkılan bağlantılar kullanın. Bir plaka tutucu kullanarak, CE-ESI arayüzünü üç eksenli bir öteleme aşamasına monte edin ve elektrosprey yayıcı ucunu kütle spektrometresi deliğinden yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirin. Arayüzün bileşenlerini temizlemek için, önce elektrosprey tabaka çözeltisini dakikada bir mikrolitre elektrosprey yayıcıdan ve BGE'yi CE ayırma kılcal damarından geçirin.

Solventleri sabit bir hızda beslemek için şırınga pompaları kullanın. Ardından, her ölçümden önce kılcal giriş ucuna bir şırınga bağlayarak CE ayırma kılcalını yıkayın. Solvent besleme hatlarının yeniden doldurulmasını ve astarlanmasını en aza indirmek için verimli büyük şırıngalar kullanın.

Ayırma kılcal damarını yaklaşık beş dakika duruladıktan sonra, girişini paslanmaz çelik şişede bulunan BGE çözeltisine aktarın. Elektrosprey yayıcı ucunu kütle spektrometresi deliğinden yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirin. Stereo mikroskop kullanarak spreyi izlerken kararlı koni jet rejiminde elektrosprey oluşturmak için bir çeviri aşaması kullanarak bu mesafeyi hassas bir şekilde ayarlayın.

Kararlı çalışmayı sağlamak için toplam iyon akımının veya TIC'nin kararlılığını yaklaşık 30 ila 45 dakika izleyin. Potansiyeli yaklaşık 15 saniye boyunca kademeli olarak artırarak BGE şişesine 21 artı veya eksi iki kilovolt uygulayın, tipik olarak BGE olarak% 1 formik asit kullanarak% 7.5 ayırma kılcal damarı boyunca yaklaşık 1 mikroamper akım üretin. Her ölçümden önce, TIC profilini yaklaşık beş ila 10 dakika izleyerek sistem kararlılığını sağlayın ve ardından ayırma potansiyelini kademeli olarak sıfır volta düşürün.

Asetil soğutma standart çözeltisinin bir mikrolitresini enjeksiyon şişesine pipetleyin ve ayırma kılcal damarını BGE şişesinden enjeksiyon şişesine aktarın. CE enjeksiyon aşamasını bir saniyede 15 santimetre kaldırın. 60 saniye sonra, numunenin altı nanolitresini hidrodinamik olarak ayırma kılcal damarına enjekte edin.

Ardından, sahneyi başlangıç seviyelerine geri çevirin ve kılcal giriş ucunu yavaşça BGE'ye hareket ettirin. Hemen ardından, elektroforetik ayırma ve EMA durum edinimini başlatmak için CE voltajını artırın. Standart algılandıktan sonra, veri alımını durdurun ve ayırma voltajını kademeli olarak sıfır volta düşürün.

Ardından, yayıcıyı delikten iki santimetre uzağa kadar alın. Hücre ekstraktını analiz etmeden önce ayırma kılcal damarını beş dakika boyunca yıkayın. Numuneyi hidrodinamik olarak enjekte etmek için 90 saniye kullanarak bu adımları tekrarlayarak tek hücre ekstraktının 10 nanolitresini ölçün.

Burada, bir dizi tanımlanmış metabolitin ayrılmasının görüntülendiği hücre ekstraktının temsili bir elektroferogramı gösterilmektedir. 70 farklı sinyal, bir standart veya tandem kütle spektral kütüphanelerinden gelenlere kıyasla, hücre ekstrakt sinyallerinin göç süresine ve MS/MS parçalanma modellerine dayalı olarak küçük polar metabolitler olarak yüksek güvenle tanımlandı. Metabolit tanımlaması, numuneden gelen bilinmeyen sinyalin doğru kütlesi, göç süresi ve parçalanma davranışının metabolit standardı veya bir metabolit veritabanında bulunan verilerle karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir.

Bu adım histidin için gösterilmiştir. Burada, mikroprob CE-ESI-MS kullanılarak tanımlanan ve örneklenen bireysel dorsal hücreler, sekiz hücreli, 16 hücreli ve 32 hücreli embriyonik aşamalarda gösterilmektedir. Üç farklı hücre tipinde tanımlanmış metabolitlerin çok çeşitli analizi, hücre aşamaları boyunca farklı metabolik profilleri ve karmaşık metabolik eğilimleri ortaya çıkardı.

Kantitatif meta verilerin temel bileşen analizi, 16 hücreli ve 32 hücreli embriyoda bir hücre klonu oluşturmak üzere bölünmüş sekiz hücreli embriyonun tanımlanmış bir progenitör hücresi olarak metabolik değişiklikleri ortaya çıkardı. Seçilmiş metabolitler için temsili eğilimler gösterilmiştir. Asetilkolin gibi metabolitler hücre bölünmesi ile bol miktarda azalırken, trolamin ve serin / arginin bu hücre tiplerinde zıt eğilimler gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik çok hızlı, genellikle her hücre için 10 saniyenin altında yapılabilir. Bu yöntem için ilk olarak, erken xenopus laevis embriyosunda metabolik hücre heterojenliğinin haritalandırılmasına başladığımızda aklımıza geldi. Bu videoyu izledikten sonra, tek embriyonik hücrelerdeki metabolitleri analiz etmek için mikroprob kılcal elektroforez-kütle spektrometresinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, metabolom dinamik olduğundan ve hücreler gelişmekte olan embriyoda hızlı bir şekilde bölündüğünden hızlı çalışmayı hatırlamak önemlidir. Ayrıca, hücre metabolizması hakkında yüksek kalitatif uygunluğa sahip verilerin toplandığından emin olmak için analitik ayrıntıları inceleyin. Bu tekniğin etkileri, mikroprob kütle spektrometresi yaklaşımımızın hızlı çalışması, minimal invaziv olması ve küçük numunelerle uyumlu olması nedeniyle canlı numunelerin teşhisine kadar uzanır.

Bu prosedürü takiben, metabolitlerin doku spesifikasyonu üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için sülfat takibi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Yüksek voltajlı güç kaynaklarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken elektriksel olarak izole edilmiş elektrikli arayüzler gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.