Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

Bu tekniğin genel amacı, sıkıcı manuel ölçümleri otomatikleştirmektir. Bu yöntem, kapsül veya hücre gövdesi boyutu arasındaki ilişki ve virülansın farklı yönleri gibi kriptokok alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, muazzam numune hacimlerinin yorulmadan analizine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri kriptokokkoz tedavisine kadar uzanır, çünkü kapsül ve hücre gövdesi büyüklüğü patojenin önemli yönleridir. Bir Hindistan Mürekkep Slaytı hazırlamak için, 10 mikrolitre kriptokok örneğini bir slayta pipetleyerek başlayın. İş ile herhangi bir dairesel yi suş, ancak bu deney için kullanılan tek suş H99 oldu.

Numunenin üzerine iki mikrolitre Hindistan mürekkebi lekesi pipetleyin ve pipet ucunu fiziksel olarak numunenin içine iterek ve Hindistan mürekkebi eşit olarak dağılmış görünene kadar dairesel hareketlerle hareket ettirerek karıştırın. Kapak kaymasının sol kenarını sürgünün yüzeyine doğru basılı tutarak numunenin üzerine bir kapak astarı yerleştirin. Ardından, kapak kaymasının karşı tarafını numunenin üzerine nazikçe ve eşit bir şekilde indirin.

Slaytın beş dakika kurumasını bekleyin. Ardından, bir conta oluşturmak ve Hindistan mürekkep lekesini korumak için kapak astarı kenarlığına hafif bir oje tabakası uygulayın. Örnekleri görüntülemek için, kamera eki ve bilinen pikselden mikrona dönüşümü olan bir parlak alan mikroskobunun altına bir slayt yerleştirin.

Filtreleri, hedefleri ve kontrastları ayarlayın ve hücre kapsülü ile arka plan arasında net kontrasta sahip kriptokok hücrelerle görüş alanının yoğun olduğundan, ancak aşırı kalabalık olmadığından ve hücre gövdesi koyu bir bant olarak görselleştirilerek düzgün bir şekilde odaklandığından emin olun. Görüntüleri çektikten sonra, ölçüm algoritması tek bir dizindeki görüntüler üzerinde çalıştırılacağından ve çıktı verileri görüntü dosyalarının adlarına göre düzenleneceğinden, bunları net başlıklara sahip tek bir dizine kaydedin. Algoritmanın metin protokolüne göre kurulumunun ardından QCA.py üzerine çift tıklayarak uygulamayı çalıştırınız.

Programda özetlenen adımları izlerken, görüntü dosyalarının uzantı türünü, önünde bir nokta olacak ve noktalı virgülle ayırarak girin. Ardından, Enter düğmesine tıklayın. Dizin Seç düğmesine tıklayarak görüntü dosyalarının bulunduğu dizini seçin ve görüntülerin bulunduğu klasörü seçin.

Görüntü Listesi Oluştur düğmesine tıklayarak dizindeki görüntü dosyalarının listesini oluşturun. Resimler sağdaki metin kutusunda listelenecektir. Listeyi gözden geçirin ve doğru ve eksiksiz olduğundan emin olun.

Ardından, Rastgele Görüntü Seç düğmesine tıklayarak önizleme olarak kullanmak üzere listeden rastgele bir görüntü seçin. Ardından, mikroskop objektifini ve gruplama ayarlarını girin. Varsayılan ayarlar kullanılan mikroskopla eşleşmiyorsa, Özel Piksel Dönüştürme'yi seçin ve görüntü dosyaları için pikselden mikrometreye dönüştürmeyi girin.

Seçildikten sonra, Dönüşümü Hesapla düğmesini tıklayın ve dönüşümün sağdaki metin kutusuna göre doğru olduğundan emin olun. Daire algılama için algoritma parametrelerini girmek için, minimum ve maksimum kapsül yarıçapı girişleri olarak dış kapsül algılama için algılanabilir minimum ve maksimum yarıçapı girin. Ardından, hücre gövdesi algılaması için algılanabilen minimum ve maksimum yarıçapı, minimum ve maksimum hücre gövdesi yarıçapı girişleri olarak girin.

Şimdi, algoritmanın hassasiyet eşiğini ayarlamak için kapsül ve hücre gövdesi hassasiyet kaydırıcılarını hareket ettirin. Düşük bir hassasiyet katı olacaktır ve yanlış pozitif daire algılamasını azaltacaktır, ancak aynı zamanda daha az gerçek daire de algılayabilir. Tersine, yüksek bir hassasiyet algılama oranını artıracaktır, ancak aynı zamanda yanlış pozitif döngülere de neden olabilir.

Algılanan gövde ve kapsül sayısını en üst düzeye çıkarın ve dairelerin doğru şekilde oturup oturmadığını görsel olarak inceleyin. Tespit edilen kapsüllerdeki ceset sayısı sağdaki metin kutusunda görüntülenecektir. Aksi takdirde, sonuçlar doğru olana kadar algoritma parametrelerini değiştirin.

Algılamayı Başlat algoritmasını görüntü dosyalarının tüm dizininde çalıştırmak için Analizi Başlat düğmesine tıklayın. Her görüntü analiz edilecek ve tüm görüntüler analiz edildiğinde program sağdaki metin kutusunda Bitti olarak görüntülenecektir. Ardından, Eşleştir ve Temizle düğmesini tıklayın.

Bu, tespit edilen hücre gövdelerini içinde bulundukları tespit edilen kapsüllerle eşleştirecek ve vücudu kapsülden çıkararak gerçek kapsül yarıçapını hesaplayacaktır. Görüntü dizininde, CleanedOutput'ta tamamlanan verileri bulun. CSV dosyası.

Yalnızca bir veri parçası seçilmişse, dosya CleanedBodies. csv veya CleanedCapsules.csv olarak etiketlenir. Burada, bir Hindistan mürekkep slaytının bu mikroskobik görüntüsünde görüldüğü gibi, hücreler birbirinden ayrılmıştır ve görüş alanını boğmayacak kadar düşük yoğunluktadır.

Hücreler ve arka plan arasında kontrast oluşturmak için yeterli leke de kullanılmıştır. Algoritma, ortalama yoğunluk değerini alarak ve standart sapmayı ekleyerek her görüntü için benzersiz bir eşik belirler. Eşikten daha yüksek yoğunluğa sahip piksel yoğunlukları beyaz, daha düşük yoğunluğa sahip piksel yoğunlukları ise siyah olarak kabul edilir.

Hücre gövdesi, kapsülün beyaz arka planı üzerinde sağlam, siyah bir daire olarak görselleştirilmelidir. Kullanılacak en iyi odak düzlemi, hücre gövdesinin karanlık, konsantre bir bant olarak göründüğü düzlemdir. Bu odak düzlemi standart olarak kabul edilebilir, çünkü hücreyi düzgün bir şekilde odaklar.

Bu, hücre duvarını, merkezinde zayıf bir sinyal olan net, odaklanmış bir hücre duvarı olan bir tür leke olan UVITEX ile görselleştirerek doğruladı. Protokol doğru bir şekilde takip edildiğinde ve optimal görüntüler elde edildiğinde, algoritma doğru ve güvenilirdir. Bununla birlikte, protokol yanlış izlenirse ve zayıf boyama, aşırı kalabalık veya daha önce bahsedilen diğer parametreler nedeniyle optimal olmayan görüntüler elde edilirse, algoritma doğruluğunu kaybeder ve insan ölçümlerini özetleyemez.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık 10 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, gerçek örnekler alırken hazırlıklı olmak için en uygun görüntüleri önceden elde etmek için bir fikir edinmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kriptokok araştırmaları alanındaki araştırmacıların, ikisinin açıkça görselleştirildiği herhangi bir görüntüleme sisteminde kapsül ve hücre gövdesi boyutlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kriptokok kapsüllerinin ve hücre gövdelerinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Cryptococcus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman temel BSL2 güvenliği gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.