Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, zaman içinde insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyeri geçirgenliğini ölçmektir. Bu yöntem, spesifik toksinlerin, bakteriyel ürünlerin ve hatta farmakolojik tedavilerin epitel bariyeri geçirgenliğini nasıl değiştirebileceği gibi gastroenteroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak ve insan bağırsak epitel dokusunu kullanarak hem görselleştirmeye hem de kantitatif ölçüm epitel bariyeri geçirgenliğine izin vermesidir.

İnsan bağırsak organoidlerine mikroenjekte edilmeden önce, mikroenjektör kurulmalı ve mikrokapiller metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanmalı, kurulmalı ve test edilmelidir. Mikrokılcal damarı enjeksiyon malzemesi ile doldurmak için, cam mikro kılcal damarın ucunu FITC-dekstran enjeksiyon süspansiyonuna batırın, mikro kılcal damarın ucunu tüpün yanına veya altına doğru kırmamaya dikkat edin. Yaklaşık 10 mikrolitre FITC-dekstran süspansiyonunu mikrokapiller içine çekmek için mineral yağ şırıngasını geri çekin.

Mikroenjeksiyon süspansiyonu cam mikrokılcal damarın uzunluğunun %90'ını doldurduğunda, mikro kılcal damarı doldurmayı bırakın. Mikrokılcal damarın ucunun hava cepleri içermediğinden emin olmak için mikrokılcal damarı mikroenjeksiyon çözeltisinden çekmeden önce şırıngayı hafifçe bastırın. İnsan bağırsağı organoid kültür plakasını hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve mikroenjektör ile biyo güvenlik kabinine aktarın.

Kapağı kültür plakasından çıkarın ve ilk kuyucuğu, en düşük büyütme ayarında dürbünün göz merceğinden net bir şekilde görülebilecek şekilde mikroskop tablasında ortalayın. Mikromanipülatör kolunu, mikrokapiler mikroskop aşamasına göre 45 dereceden daha büyük bir açıyla kültür kuyucuğuna doğru bakacak şekilde çevirin. Mikrokılcal damarın ucunu, ortamın yüzeyinin yaklaşık bir santimetre yukarısında, ilk kültür kuyusunun üzerine yerleştirin.

Hem cam filamentin ucunun hem de insan bağırsak organoidinin göz merceğinden görülebildiğini kontrol edin. Başarılı bir mikroenjeksiyonun anahtarı, mikroenjeksiyonu denemeden önce mikrokılcal damarı organoid ile dikkatlice hizalamaktır. Ve her zaman yeni kullanıcıların kritik bir deney yapmadan önce yedek doku ile pratik yapmalarını öneririm.

Z ekseni kontrol düğmesini saat yönünde çevirerek mikrokılcal damarı yavaşça ilerletin. İnsan bağırsak organoidini mikrokılcal uç ile delin. İnsan bağırsak organoidinin dış yüzeyi, mikrokılcal damar basınç uygulamaya başladığında hafifçe bastırılacak ve uç lümene nüfuz ettiğinde tekrar şekillenecektir.

Lümen içindeki mikrokılcal damarın ucunu görmekte zorluk çekiyorsa, diseksiyon mikroskobunun aydınlatma veya büyütme ayarlarını yapın. Mikrokılcal damar, mikrokılcal damarın ucu insan bağırsağı organoidinin merkezine yakın olacak şekilde doğru şekilde yerleştirildiğinde, ellerinizi mikromanipülatör kontrollerinden çekin. Mikroenjeksiyon solüsyonunu mikrokılcal damardan dışarı ve insan bağırsağı organoid lümenine itmek için mineral yağ dolu şırıngayı hafifçe bastırın.

İnsan bağırsak organoidi, enjeksiyonun hacmini karşılamak için hafifçe genişleyebilir. Manevra sırasında insan bağırsak organoidlerine kazara zarar vermemek için mikrokılcal damar ortamın üzerine yerleştirildiğinde, bir sonraki insan bağırsak organoid hedefine geçin. Tedaviler arasında veya kırılma durumunda, mikrokılcal damarı değiştirin.

Mikromanipülatör kolunun ucundaki kelepçeyi gevşetin ve mikrokılcal damarı mikro pipet tutucusundan çıkarın. Apikal epitele verilen bileşikleri test etmek için, bileşiğe, mililitre FITC-dekstran başına iki miligram içeren steril PBS'de yeniden süspanse edilmelidir. Bu temsili deneyde, Clostridium difficile toksini TcdA'yı yeniden askıya alın, mikroenjeksiyondan önce FITC-dekstran içeren PBS'de mikrolitre başına 12.8 nanogram ekleyin.

Bileşiği, önceki bölümde gösterildiği gibi insan bağırsağı organoid lümenine mikroenjekte edin. Bazal lateral bölmeye verilen bileşikleri test etmek için, FITC-dekstran mikroenjeksiyonundan sonra, harici kültür ortamını, pozitif kontrol olarak iki milimolar EGTA, negatif kontrol olarak tek başına PBS aracı veya başka bir deneysel bileşik içeren yeni ortamla değiştirin. Mikroenjeksiyondan hemen sonra canlı görüntülemeye başlayın.

Bu temsili parlak alan görüntüsü, FITC-dekstran mikroenjeksiyonundan sonra doku kaynaklı bir insan bağırsak organoidini göstermektedir. Floresan sinyali, belirli bir filtre seti kullanılmadan bile görülebilir. Kök hücre kaynaklı insan bağırsak organoidleri, PBS'de süspanse edilmiş dört kilodalton FITC konjuge dekstran veya Clostridium difficile toksini TcdA içeren PBS ile mikroenjekte edildi.

Pozitif bir kontrol olarak, EGTA, PBS ve FITC-dekstran enjekte edilen insan bağırsak organoidlerinin bir alt kümesinde insan bağırsak organoid kültür ortamına eklendi. İnsan bağırsak organoidleri 20 saat boyunca görüntülendi. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, PBS enjekte edilen insan bağırsak organoidleri, T sıfırda bulunan hemen hemen tüm floresan sinyalini korudu.

Bununla birlikte, TcdA ile enjekte edilen veya EGTA ile tedavi edilen insan bağırsak organoidleri, mikroenjeksiyondan sekiz saat sonra floresan yoğunluğunda önemli bir azalma göstermiştir. Görüntüleme verileri, her deneysel koşulda zaman içinde floresan yoğunluğundaki nispi değişimi temsil eden yüksek çözünürlüklü bir veri seti oluşturmak için tüm zaman noktalarında tüm insan bağırsak organoidleri için ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, deney koşullarının sayısına bağlı olarak yaklaşık 30 dakika ila bir saat arasında yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, mikroenjeksiyondan önce insan bağırsak organoidlerini mikrokapiller ile hizalarken sabırlı olmayı ve zaman ayırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, insan bağırsak organoidinin enjekte edilen materyale tepkisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için PCR, western blot ve RNA arama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bakteriyel toksinlerin, farmakolojik ajanların, sitokinlerin ve hatta canlı mikroorganizmaların insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelememizi sağladı.

Bu videoyu izledikten sonra, floresan etiketli dekstran ve diğer deneysel materyallerin bir insan bağırsak organoidinin lümenine nasıl mikroenjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bakteriyel toksinler veya canlı organizmalarla çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Ve son olarak, mikro kılcal damarlar son derece keskin olduğu için delinme yaralarından kaçınmak için özellikle dikkatli olun.