Name: Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyer geçirgenliğini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Canlı hücre mikroskobisi ve FITC-dextran mikroenjeksiyonu ile toksinlerin ve farmakolojik ajanların etkilerini görselleştirin ve nicel olarak değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Drs. Stephanie Spohn ve Basel Abuaita organoid mikroenjeksiyon birçok yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Solumasını bağırsak kök hücre Konsorsiyumu (U01DK103141), diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) ve Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) tarafından finanse edilen bir ortak araştırma projesi tarafından desteklenir. Solumasını ve VBY NIAID roman, alternatif Model sistemleri için enterik hastalıklar (NAMSED) Konsorsiyumu (U19AI116482) tarafından desteklenmektedir. DRH desteklenmektedir mikrobiyal Patogenez mekanizmaları eğitim hibe Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIAID, T32AI007528) ve klinik ve çevirim Bilim Ödülü Michigan Enstitüsü Klinik ve sağlık için Araştırma (UL1TR000433).
Tam veri dosyaları ve bu el yazması kullanılan veri analizi kodu https://github.com/hilldr/HIO_microinjection mevcuttur.

<ol><li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStandring%2C+S+%22Gray%27s+anatomy%3A+The+anatomical+basis+of+clinical+practice%22">Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice</a>. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+defense%3A+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+A+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li>
<li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li>
<li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+measurements%3A+General+aspects+and+possible+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Hosp%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
<li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line%3A+T84+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li>
<li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability%3A+A+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li>
<li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li>
<li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+new+ball+game%3A+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2FColonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+clostridium+difficile+infection%3A+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li>
<li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=Dhn2KispfdQC">Theory and practice of histological techniques</a>. , Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization%3A+The+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization: The essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKurien%2C+B+%22Western+blotting%3A+Methods+and+protocols%22">Western blotting: Methods and protocols</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+W+%22Microsoft+excel+data+analysis+and+business+modeling%22">Microsoft excel data analysis and business modeling</a>. , Pearson Education. (2016).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R Foundation for Statistical Computing</a>. , (2017).</li>
<li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenbaum%2C+S+%22Basic+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+An+integrated+textbook+and+computer+simulations%22">Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+assessment+of+intestinal+permeability%2C+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Ther+Health+Med%22%5BJournal%5D)">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966(2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları ifşa etmek var.

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak hPSC elde edilen HIOs ve bağırsak organoids doku kaynaklı mikroenjeksiyon ve epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için genel amaçlı bir yöntem oluşturur. Biz de analiz ve bu yöntemleri kullanan oluşturulan verilerin yorumlanması bizim yaklaşım göstermiştir. Bağırsak organoids büyüyen kabulü model sistemleri verilen16,20,21,28 ve fonksiyonel bağırsak bariyer geçirgenliği gibi fizyolojik ilgili uzun süredir ilgi sonuç3,4,5,6, biz diğerleri bu alanda çalışan uygulamak ve bu yöntemler kurmak mümkün olacak tahmin.
Bu teknik uygulama için kritik olan birkaç adım vardır. Yüksek kalite hPSC - veya türetilmiş HIO doku mikroenjeksiyon ile kapsamlı deneme önce kurulmalıdır doku erişim. Doku kimlik ve hücresel Morfoloji olmasına rağmen son derece tekrarlanabilir HIOs24üretmek için kurulan metodoloji kullanan zaman HIO macrostructure hànzú, her iki boyutu ve şekli, varyasyon ile olabilir. Tek bir yarı saydam Lümen oluşan ve yaklaşık 1 mm çapında ölçme küresel HIOs mikroenjeksiyon ve gerçek zamanlı olarak luminal Floresans ölçümü için idealdir. Bazı durumlarda, mikroenjeksiyon, HIO çöküşü enjekte malzeme açık kaçağı sonuçlanabilecek başarısız olur. Başarısız HIOs-ebilmek var olmak çıkarmak ile kültür de kullanıcının isteği doğrultusunda standart bir micropipette kullanarak. Objektif lensler bir görüntüleme platformu üzerinde kullanılabilir HIOs mikroenjeksiyon ve görüntüleme için seçerken göz önünde bulundurun. 10 X amaç düşük güç lensler kullanılabilir değilse veya mevcut HIOs varsa kullanılabilir, ancak genel olarak, 2-4 X objektif lens tam HIO floresan sinyal yakalamak için idealdir &#60; 1 mm çapında. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı için tanımlanmış noktalarda floresan görüntülerin otomatik yakalama zaman içinde izin vermeniz gerekir.
Bu protokol birçok değişikliği deneysel gereksinimlerine uymak için mümkündür. Örneğin, bariyer fonksiyonu testlerinin sonuçlarını kullanım43 bileşiklerin moleküler boyutu bağımlı olabilir ve değişen molekül ağırlığı dextran hazırlıkları test etmek uygun olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan görüntüleme Floresans görüntüleme doku25genel olarak yapısal bütünlüğünü bir göstergesi olarak ek olarak gerçekleştirilebilir. Canlı bakteri25,28,31,32,33,44mikroenjeksiyon işlemi sırasında penisilin eklemek gerekli olabilir ve streptomisin veya gentamisin önce veya sonra mikroenjeksiyon HIO kültür medyaya. Microcapillary dışına doldurma ile bakteri kültürü Süspansiyon sırasında kontamine ve bu HIO medyaya devredilebilir. Alternatif olarak, mikroenjeksiyon mikroenjeksiyon tamamlandıktan sonra medya ekleme medya, hücre dışı Matriks (örneğin, Matrigel) askıya HIOs üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu kirlenme hücre dışı matriks ve dış yüzü HIO sınırlayabilir. Mikrobiyal büyüme deneyleri planlarken, antibiyotik medyada yavaşlama veya microinjected organizmaların büyümesini engelleyerek önlemek için 1-2 h sonra kaldırmak gerekli olabilir.
Son olarak, tüm araştırmacılar mikroskobu ekipman vitro görüntüleme için uygun erişimi kabul ederek, Floresans veri toplamak için bu protokolü bölümünde özetlenen yordamlar çekilen görüntülere uygulanabilir işaret etmek önemlidir otomatik görüntü yakalama veya çevresel kontroller standart epifluorescent mikroskobu kullanarak sabit timepoints. Bu yaklaşımın örnekleri raporlarda Leslie ve Huang vd tarafından bulunabilir C. difficile toksin aktivite bağırsak organoids hPSC elde edilen Karve ve Pradan ve ark. , muayene 25, epitel bariyer geçirgenliği ile canlı E. colimicroinjected benzer hPSC elde edilen bağırsak organoids içinde muayene 44. Ekipman görüntüleme el ile işlem daha fazla değişim ve floresan sinyal normalize zorluk neden olabilir. El ile görüntüleme FITC dextran performans HIOs enjekte edildiğinde sabit büyütme, floresan uyarma yoğunluğu ve pozlama süreleri floresan yoğunluk ölçümleri bozan önlemek için deney boyunca korumak için önemlidir.

Bağırsak epitel besinler, H2O, iyonlar ve atık ürünler yönlü taşımacılığının diğer parçacıklar Lümen arasında Difüzyon-aracılı nonspesifik alışverişini en aza indirerek aracılık eder seçici bir bariyer oluşturur ve Mezenkimal doku veya kan kaynağı1,2. Bağırsak epitel bariyer nonspesifik geçirgenliği uzun oranı yansıtan sağlık ve hastalık3,4,5,6, bir anahtar işlev parametre kabul edilmiştir Difüzyon yolu ile paracellular alan epitel boyunca küçük moleküllerin. Epitel bariyer geçirgenliği ölçümü içinde yürütülen hayvan modelleri7 ve insan hasta8 ' de laktuloz sindirim yoluyla, gastrointestinal sistem ve sonraki koleksiyonu belirli hiçbir ışınlama sahip olduğu ve laktuloz konsantrasyonlarda periferik kan ölçümü. Alternatif alınan işaretleri fluorescently etiketli karbonhidratlar gibi bariyer fonksiyonunun da mevcut9,10vardır. Bu yaklaşım Transwell destekler11, daha fazla deneysel kontrol için izin verir, ancak aynı zamanda içinde vivo zavallı bir tahmin eleştirilmiştir basitleştirilmiş bir yaklaşım üzerinde yetiştirilen bağırsak epitel hücre kültürleri için adapte edilmiş geçirgenliği farklılaştırılmış epitel alt türlerini ve doku yapısı12yokluğu nedeniyle. Chambers'ı kullanarak yeni bir yaklaşım temsil ve epitel bariyer fonksiyonu tüm bağırsak mukoza ex vivo13' te ölçümü için izin verir. Bu tekniğin uygulanması sık doku kullanılabilirlik durumu13,ve14tarafından sınırlıdır. Böylece tekrarlanabilirlik ve işlem hacmi fizyolojik alaka ile dengeleyen yeni yöntemler gereklidir.
Vitro organogenesis son gelişmeler 3D doku kültürü model sistemleri kabulü karmaşık doku15,16,17 dinamikleri recapitulating için sofistike bir platform olarak yol açmıştır ,18,19,20,21,22,23. Özellikle, insan pluripotent kök hücre (hPSC) elde edilen insan bağırsak organoids (HIOs)19,24 konak-mikrobiyal etkileşim incelenmesi için bir tekrarlanabilir ve deneysel olarak uysal modeli sistem olarak çıkmıştır ve epitel bariyer dynamics25,26,27,28. Benzer şekilde, insan doku kaynaklı organoids (enteroids olarak da bilinir) bir basit biyopsi yordamla elde ve uysal bir sistem olarak insan fizyolojisi ve hastalık15,29,30eğitim için kullanılabilir. İnsan bağırsak organoids mikroenjeksiyon deneysel bileşikler25 teslimi için izin verir veya mikropların25,31,32,33 ' e apikal epitel yaşamak organoid Lümen yüzeyine. Leslie ve Huang vd. 25 son zamanlarda bakteriyel toksinler maruz takip dextran etiketli floresein isothiocyanate (FITC) ile microinjected HIOs bariyer geçirgenliği ölçmek için bu tekniği adapte.
Bu iletişim kuralı hPSC elde edilen HIOs ve floresan mikroskopi kullanarak doku kaynaklı HIOs epitel bariyer geçirgenliği ölçüm için bir kılavuz olarak hazırlanmıştır. Küçük değişiklikler ile o da HIOs mikroenjeksiyon deneysel bileşikler ile genel bir astar olarak hizmet verebilir. Kullanıcılar bu iletişim kuralı ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile mikroenjeksiyon sonra ek.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0.5 M steril (pH 8.0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Hücre matris çözeltisi (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT canlı hücre görüntüleme sistemi</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Kameralı</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>29065728</td><td>Deltavision sistemine dahildir</td></tr><tr><td>softWoRx Görüntüleme yazılımı</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>29065728</td><td>Deltavision sistemine dahildir</td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM-F12</td><td>Life Teknolojiler</td><td>12634-010</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</sup</td></tr><tr><td>>B27 eki (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamin (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630080</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipülatör</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tutucu</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Xenoworks pipet tutucuya alternatif</td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon dürbünü</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Önerilen dürbün, ancak diğer modeller muhtemelen uyumludur</td></tr><tr><td>Olympus IX71 Floresan mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Deltavision sistemine dahildir</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometri</td><td>29065728</td><td>Deltavision sistemine dahildir</td></tr><tr><td>Rekombinant C. difficile Toksin A/TcdA Proteini R</td><td>& D Sistemleri</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>236-EG</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</sup</td></tr><tr><td>>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Hazne Kızakları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Cam filamentler</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Tercih edilen cihaz</td></tr><tr><td>Analog Boru kiti</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 şeffaf yüksüklü</td><td>Xenoworks</td><td></td> V001104 <td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm O-ring</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı insan bağırsak organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Biyopsi ile elde edilen veya pluripotent kök hücreler yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla üretilen bağırsak dokuların 3D kültür gelişmeler bağırsak mukoza sofistike vitro modellerinde sonuçlandı. Ortaya çıkan bu model sistemleri yararlanarak araçlar ve teknikler 2D kültür sistemleri ve hayvanlar için geliştirilen uyum gerektirir. Burada, gerçek zamanlı olarak insan bağırsak organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçüm tekniği tarif. Bu mikroenjeksiyon fluorescently etiketli dextran ve görüntüleme epifluorescent filtre ile donatılmış bir ters mikroskop Tarih tarafından gerçekleştirilir. Bu teknik aynı zamanda yaklaşımlar Imaging sabit timepoint birlikte gerçek zamanlı bağırsak organoids bariyer geçirgenliği ölçümü insan bağırsak epitel dokusu, yüksek çözünürlüklü zamansal veri nesil kolaylaştırır. Farmakolojik ajanlar, bakteriyel ürünler veya toksinler veya canlı mikroorganizmalar maruz kalma takip epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için kolayca uyarlanabilir bir protokoldür. Küçük değişikliklerle bu protokolü de bağırsak organoids mikroenjeksiyon genel bir astar olarak hizmet verebilir ve kullanıcılar bu protokolü mikroenjeksiyon aşağıdaki ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile tamamlamak tercih edebilir.

HIOs insan pluripotent kök hücreleri ayrıştırılan ve hücre matris çözüm olarak daha önce açıklanan19,24kültürlü. Kültür 4 hafta sonra HIOs mikroenjeksiyon için izin vermek için yeterince genişletti. HIOs 4 kDa FITC Birleşik dextran PBS veya Clostridium difficile toksin TcdA içeren PBS askıya ile microinjected. C. difficile HIOs25epitel toksisite toksin-aracılı sergileyen bir fırsatçı gastrointestinal hastalık var. Pozitif kontrol, EGTA bir alt kümesini PBS ve FITC dextran ile enjekte HIOs HIO kültür medyada eklenmiştir. EGTA hızlı de-polimerizasyon aktin sitoiskeleti42neden olur bir kalsiyum şelatör var. FITC Floresans gerçek zamanlı canlı görüntüleme mikroskop içinde kontrollü bir çevre odası olarak izlenmeli ve görüntüleri 10 dakikalık aralıklarla ele geçirildi.
Görüntüleme veri Post-hoc çözümlemesi FITC floresan (şekil 5) tutma önemli farklılıkları ortaya koydu. PBS ile enjekte HIOs muhafaza neredeyse tüm floresan sinyal t mevcut Ayrıca TcdA ile EGTA ile tedavi enjekte edildi HIOs 8 saat sonrası mikroenjeksiyon (şekil floresan yoğunluğu önemli bir düşüş sergiledi ancak = 0, 5A). görüntüleme veri göreceli değişiklik floresan yoğunluğu zamanla deneysel her durumda (şekil 5B) temsil eden yüksek çözünürlüklü bir veri kümesi oluşturmak tüm HIOs tüm zaman noktalarda için sayısal. Epitel geçirgenliği farklılıkları her tedavi grubu (Tablo 1) FITC (t1/2 ) ortalama eliminasyon zaman hesaplama ve t t1/2 gruplar arasındaki farkları karşılaştırarak değerlendirildi kullanarak öğrenci t-test. Denetimi değerlendirilmesi HIOs muhafaza FITC floresan sinyal 16 saatten fazla çoğunluğu (t1/2 = 17 ± 0,3 h). EGTA ile tedavi azaltılacağını FITC dextran eleme zaman denetime HIOs göre (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h; P = 1.3 x 10-8). Daha önce yayımlanmış sonuçları25ile tutarlı, TcdA mikroenjeksiyon önemli ölçüde epitel bariyer geçirgenliği kontrol tedavi göre artar (t1/2 = 7,6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). Böylece, dış (EGTA) ve microinjected (TcdA) bileşikleri HIOs epitel bariyer geçirgenliği içinde önemli değişiklikler inducing yeteneğine sahiptirler. Bu sonuçlar epitel bariyer fonksiyonu çok çeşitli farmakolojik ajanlar, metabolitleri, bakteriyel ürünleri, sitokinler, büyüme faktörleri ve diğer bileşikler etkileri bu yaklaşımı kullanarak değerlendirilecek öneririz.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tedavi</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>% 95 CI (h) indir</td>
			<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank"></a>

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Bu prosedürün genel amacı, zaman içinde insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyeri geçirgenliğini ölçmektir. Bu yöntem, spesifik toksinlerin, bakteriyel ürünlerin ve hatta farmakolojik tedavilerin epitel bariyeri geçirgenliğini nasıl değiştirebileceği gibi gastroenteroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak ve insan bağırsak epitel dokusunu kullanarak hem görselleştirmeye hem de kantitatif ölçüm epitel bariyeri geçirgenliğine izin vermesidir.İnsan bağırsak organoidlerine mikroenjekte edilmeden önce, mikroenjektör kurulmalı ve mikrokapiller metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanmalı, kurulmalı ve test edilmelidir. Mikrokılcal damarı enjeksiyon malzemesi ile doldurmak için, cam mikro kılcal damarın ucunu FITC-dekstran enjeksiyon süspansiyonuna batırın, mikro kılcal damarın ucunu tüpün yanına veya altına doğru kırmamaya dikkat edin. Yaklaşık 10 mikrolitre FITC-dekstran süspansiyonunu mikrokapiller içine çekmek için mineral yağ şırıngasını geri çekin.Mikroenjeksiyon süspansiyonu cam mikrokılcal damarın uzunluğunun %90'ını doldurduğunda, mikro kılcal damarı doldurmayı bırakın. Mikrokılcal damarın ucunun hava cepleri içermediğinden emin olmak için mikrokılcal damarı mikroenjeksiyon çözeltisinden çekmeden önce şırıngayı hafifçe bastırın. İnsan bağırsağı organoid kültür plakasını hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve mikroenjektör ile biyo güvenlik kabinine aktarın.Kapağı kültür plakasından çıkarın ve ilk kuyucuğu, en düşük büyütme ayarında dürbünün göz merceğinden net bir şekilde görülebilecek şekilde mikroskop tablasında ortalayın. Mikromanipülatör kolunu, mikrokapiler mikroskop aşamasına göre 45 dereceden daha büyük bir açıyla kültür kuyucuğuna doğru bakacak şekilde çevirin. Mikrokılcal damarın ucunu, ortamın yüzeyinin yaklaşık bir santimetre yukarısında, ilk kültür kuyusunun üzerine yerleştirin.Hem cam filamentin ucunun hem de insan bağırsak organoidinin göz merceğinden görülebildiğini kontrol edin. Başarılı bir mikroenjeksiyonun anahtarı, mikroenjeksiyonu denemeden önce mikrokılcal damarı organoid ile dikkatlice hizalamaktır. Ve her zaman yeni kullanıcıların kritik bir deney yapmadan önce yedek doku ile pratik yapmalarını öneririm.Z ekseni kontrol düğmesini saat yönünde çevirerek mikrokılcal damarı yavaşça ilerletin. İnsan bağırsak organoidini mikrokılcal uç ile delin. İnsan bağırsak organoidinin dış yüzeyi, mikrokılcal damar basınç uygulamaya başladığında hafifçe bastırılacak ve uç lümene nüfuz ettiğinde tekrar şekillenecektir.Lümen içindeki mikrokılcal damarın ucunu görmekte zorluk çekiyorsa, diseksiyon mikroskobunun aydınlatma veya büyütme ayarlarını yapın. Mikrokılcal damar, mikrokılcal damarın ucu insan bağırsağı organoidinin merkezine yakın olacak şekilde doğru şekilde yerleştirildiğinde, ellerinizi mikromanipülatör kontrollerinden çekin. Mikroenjeksiyon solüsyonunu mikrokılcal damardan dışarı ve insan bağırsağı organoid lümenine itmek için mineral yağ dolu şırıngayı hafifçe bastırın.İnsan bağırsak organoidi, enjeksiyonun hacmini karşılamak için hafifçe genişleyebilir. Manevra sırasında insan bağırsak organoidlerine kazara zarar vermemek için mikrokılcal damar ortamın üzerine yerleştirildiğinde, bir sonraki insan bağırsak organoid hedefine geçin. Tedaviler arasında veya kırılma durumunda, mikrokılcal damarı değiştirin.Mikromanipülatör kolunun ucundaki kelepçeyi gevşetin ve mikrokılcal damarı mikro pipet tutucusundan çıkarın. Apikal epitele verilen bileşikleri test etmek için, bileşiğe, mililitre FITC-dekstran başına iki miligram içeren steril PBS'de yeniden süspanse edilmelidir. Bu temsili deneyde, Clostridium difficile toksini TcdA'yı yeniden askıya alın, mikroenjeksiyondan önce FITC-dekstran içeren PBS'de mikrolitre başına 12.8 nanogram ekleyin.Bileşiği, önceki bölümde gösterildiği gibi insan bağırsağı organoid lümenine mikroenjekte edin. Bazal lateral bölmeye verilen bileşikleri test etmek için, FITC-dekstran mikroenjeksiyonundan sonra, harici kültür ortamını, pozitif kontrol olarak iki milimolar EGTA, negatif kontrol olarak tek başına PBS aracı veya başka bir deneysel bileşik içeren yeni ortamla değiştirin. Mikroenjeksiyondan hemen sonra canlı görüntülemeye başlayın.Bu temsili parlak alan görüntüsü, FITC-dekstran mikroenjeksiyonundan sonra doku kaynaklı bir insan bağırsak organoidini göstermektedir. Floresan sinyali, belirli bir filtre seti kullanılmadan bile görülebilir. Kök hücre kaynaklı insan bağırsak organoidleri, PBS'de süspanse edilmiş dört kilodalton FITC konjuge dekstran veya Clostridium difficile toksini TcdA içeren PBS ile mikroenjekte edildi.Pozitif bir kontrol olarak, EGTA, PBS ve FITC-dekstran enjekte edilen insan bağırsak organoidlerinin bir alt kümesinde insan bağırsak organoid kültür ortamına eklendi. İnsan bağırsak organoidleri 20 saat boyunca görüntülendi. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, PBS enjekte edilen insan bağırsak organoidleri, T sıfırda bulunan hemen hemen tüm floresan sinyalini korudu.Bununla birlikte, TcdA ile enjekte edilen veya EGTA ile tedavi edilen insan bağırsak organoidleri, mikroenjeksiyondan sekiz saat sonra floresan yoğunluğunda önemli bir azalma göstermiştir. Görüntüleme verileri, her deneysel koşulda zaman içinde floresan yoğunluğundaki nispi değişimi temsil eden yüksek çözünürlüklü bir veri seti oluşturmak için tüm zaman noktalarında tüm insan bağırsak organoidleri için ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, deney koşullarının sayısına bağlı olarak yaklaşık 30 dakika ila bir saat arasında yapılabilir.Bu prosedürü denerken, mikroenjeksiyondan önce insan bağırsak organoidlerini mikrokapiller ile hizalarken sabırlı olmayı ve zaman ayırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, insan bağırsak organoidinin enjekte edilen materyale tepkisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için PCR, western blot ve RNA arama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bakteriyel toksinlerin, farmakolojik ajanların, sitokinlerin ve hatta canlı mikroorganizmaların insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelememizi sağladı.Bu videoyu izledikten sonra, floresan etiketli dekstran ve diğer deneysel materyallerin bir insan bağırsak organoidinin lümenine nasıl mikroenjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bakteriyel toksinler veya canlı organizmalarla çalışırken son derece tehlikeli olabileceğini ve bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Ve son olarak, mikro kılcal damarlar son derece keskin olduğu için delinme yaralarından kaçınmak için özellikle dikkatli olun.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, eksize edilmiş bağırsak dokusu preparatlarının veya "bağırsak keselerinin" bağırsak bariyer fonksiyonunun ex vivo modeli olarak kullanımını tanımlar. Bu model, sindirim hastalığının hayvan modellerinde belirli bağırsak bölgelerinde hem epitel bariyerinin hem de mukoza jel tabakasının bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Burada ince bağırsak organoidlerinin bariyer bütünlüğünü ölçmek için bir teknik açıklanmıştır. Yöntemin canlı organoidlere dayanması, farklı bariyer bütünlüğünün maddeleri veya bunların kombinasyonlarını zaman içinde çözümlü bir şekilde modüle ederek sıralı olarak araştırılmasını sağlar.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Bu çalışma, organoidlerden sığır bağırsağı 2D tek tabakaları oluşturmak için bir protokol sunar ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için gelişmiş erişim sunar. Sığırların gastrointestinal fizyolojisini taklit eden in vitro modelleri geliştirerek membran bütünlüğünü ve işlevselliğini değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu yaklaşım, gelişmiş tedavi stratejileri de dahil olmak üzere önemli biyomedikal ve tarımsal faydalar vaat etmektedir.

İnce ve Kalın Bağırsak Tek Katmanlı Arayüzleri Kullanılarak Sığır Organoid Teknolojisindeki Gelişmeler

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Bu çalışmada sunulan protokol analizi akış sitometrisi kullanılarak, pozitif ve negatif pluripotent kök hücresi belirleyicilerinin kinetik ölçümleri ile yeniden programlama ilerlemesi gerçek zamanlı izleme için yöntemler tarif etmektedir. protokol aynı zamanda iPSC oluşturma sırasında morfolojisi ve işaretleyici veya muhabir ifade görüntüleme bazlı değerlendirmesini içerir.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Öğrenin, insan bağırsak organoidlerinde epitel bariyer geçirgenliğini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Canlı hücre mikroskobisi ve FITC-dextran mikroenjeksiyonu ile toksinlerin ve farmakolojik ajanların etkilerini görselleştirin ve nicel olarak değerlendirin.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Daha fazla video keşfet