Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Bu yöntemin genel amacı, murin embriyonik gelişimi sırasında klonal Hematopoetik Kök Hücre veya HSC öncüllerinin fenotipik özelliklerini ve aşılama potansiyelini belirlemektir. Bu yöntem, gelişimsel hematopoez alanında, embriyonik gelişim sırasında klonal HSC öncülerinin benzersiz soy katkıları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hemojenik öncüllerin tek hücre düzeyinde analiz edilmesidir.

Bu, nadir HSC öncülerini ayırt eden benzersiz fenotipik özelliklerin tanımlanmasına izin verir. Aort-Gonad-Mezonephros, AGM, koitumdan 9.5 ila 11.5 gün sonra embriyolardan diseke edilen dokuları, buz üzerinde% 10 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre PBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyerek başlayın. Dokular tüpün dibine çöktüğünde, süpernatanı aspire edin ve numunelere hemen bir mililitre% 0.25 kollajenaz ekleyin.

37 santigrat derece su banyosunda 25 dakika sonra, bir mililitre PBS artı FBS ile reaksiyonu durdurun ve tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar dokuları 20 ila 30 kez ezmek için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Daha sonra hücreleri sekiz mililitre PBS artı FBS ile seyreltin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri 500 mikrolitre bloke edici tamponda buz üzerinde beş dakika boyunca tekrar süspanse edin.

Sonra ilgilenilen antikor kokteylinden 500 mikrolitre ekleyin. Buz üzerinde 15 ila 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri sekiz mililitre PBS artı FBS içinde yıkayın ve peleti bir mililitre taze PBS artı FBS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden beş mililitrelik bir tüpe süzün, süzgeci tüm hücreleri toplamak ve hücreleri tekrar santrifüjlemek için üç mililitre PBS artı FBS ile yıkayın.

Daha sonra peleti 500 mikrolitre PBS artı FBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Tek hücre ve indeks sıralama modunda sıralama için kapıları ayarlamak için, akış sitometresine küçük bir hücre alikotu yükleyin ve alımı en düşük akış hızına ayarlayın. Öne doğru saçılma alanına karşı yan saçılma alanı grafiği açın ve farklı boyutlardaki hücreleri dahil etmek için bir geçit ayarlayın.

Bir ileri dağılım alanına karşı ileri dağılım genişliği grafiği ve bir yan dağılım alanına karşı yan dağılım genişliği grafiği açın ve çiftleri dışlamak için her çizimde bir geçit ayarlayın. Canlı hücreleri geçit etmek için DAPI grafiğine karşı bir ileri dağılım alanı ayarlayın. Daha sonra bir anti-vasküler endotelyal Cadherin'e karşı anti-endotelyal protein C reseptörü grafiği oluşturun ve vasküler endotelyal Cadherin pozitif ve yüksek endotelyal protein C reseptörü eksprese eden hücreleri kapılayın.

Aort-gonad-mezonephros hücrelerini indekslemek için, AGM serum içermeyen ortam artı sitokinlerde AGM endotel hücreleri ile önceden kültürlenmiş 96 oyuklu bir plakayı akış sitometresinin plaka bloğuna yerleştirin ve deneysel numuneyi yükleyin. Numune alımına başlayın ve 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna tek bir hücreyi sıralamak için indeks sıralama tek hücre modunun seçildiğini onaylayın. Plakanın her bir oyuğuna bir hücre ayrıldığında, plakayı yedi güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 CO2'ye ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Ko-kültür periyodunun sonunda, çeşitli boyut ve morfolojilerdeki hematopoietik koloniler, 100X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Klonları akış sitometrisi ile analiz etmek için, endotel hücrelerini ayırmadan hematopoietik hücreleri endotel katmanlarından ayırmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra 100 mikrolitre hücreyi yeni bir 96 oyuklu v-alt plakanın ayrı oyuklarına aktarın ve kalan 100 mikrolitre hücreyi içeren orijinal 96 oyuklu plakayı doku kültürü inkübatörüne geri koyun.

Santrifüjleme ile v-alt plakadaki hücreleri peletleyin ve plakayı tek bir hızlı hareketle ters çevirerek ve hafifçe vurarak süpernatanı çıkarın. Her bir oyuktaki peletleri dört santigrat derecede 50 mikrolitre bloke edici tampon ile yeniden süspanse edin. Beş dakika sonra, dört santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa ilgilenilen antikor kokteylini ekleyin.

Kuluçka işleminin sonunda, her bir kuyuyu 200 mikrolitre PBS artı FBS ile yıkayın, süpernatanı atmak için santrifüjlemenin sonunda plakayı hafifçe vurun. Peletleri 50 mikrolitre PBS artı FBS'de yeniden süspanse edin ve hematopoietik kök hücre potansiyeli içeren kolonileri taramak için hücreleri standart akış analizi protokollerine göre analiz edin. Akış analizi ile hematopoetik kök hücre fenotipine sahip hücreleri içeren oyukların seçilmesi, orijinal ko-kültürden kalan 100 mikrolitre hücreyi yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipet kullanın ve 100 mikrolitre PBS'de dördüncü kurtarma kemik iliği hücrelerine beş kez 10 ekleyin ve% 2 FBS her oyuğa.

Her klonun tek tek ölümcül ışınlanmış konjenik alıcı hayvanlara evlat edinilmiş transferinden sonra, nakil sonrası düzenli aralıklarla aşılanmış hayvanlardan periferik kan örnekleri toplayın. Uzun süreli aşılama ile klonları tanımlamak için, numuneleri standart akış analiz protokollerine göre akış sitometrisi ile analiz edin. Her klonun fenotipik özellikleri daha sonra aşılama özellikleri ile ilişkilendirilebilir.

Pre-hematopoetik kök hücreler, vasküler endotelyal Cadherin pozitifliği ve yüksek düzeyde endotelyal protein C reseptör ekspresyonu ile zenginleştirilebilir. Diğer florokrom konjuge antikorlarla boyama, indeks sıralama sırasında her hücre için kaydedilebilen ek fenotipik parametrelerin retrospektif analizine izin verir. Aort-gonad-mezonephros endotel hücre ko-kültürlerine indeks sıralamasını takiben, bireysel klonlar, klonlar toplanmaya ve hematopoietik kümeler oluşturmaya başlamadan önce aorta-gonad-mezonefros endotel hücre tabakasına entegre olur.

Beş ila yedi günlük ko-kültürden sonra, çeşitli büyüklüklerde ve morfolojilerde koloniler tespit edilebilir. Burada, ko-kültürü takiben elde edilen dört farklı koloni, diğer daha farklılaşmış hücre tipleri ile birlikte fenotipik hematopoietik kök hücrelerin farklı oranlarını gösteren üç koloni ve hematopoietik kök hücre marker ekspresyonu olan hücrelerin eksik olduğu dördüncü koloni gösterilmiştir. Klon hücre soyunun evlat edinme transferi, zaman içinde alıcının periferik kanının miyeloid B ve T hücre bölmelerine donör katkısını takiben her klonun uzun vadeli çok soylu aşılama yeteneğinin değerlendirilmesine izin verir.

Hematopoietik kök hücre fenotipine sahip hücreler içeren kolonilerin çoğu uzun süreli aşılama elde etse de, bazı klonlar zamanla aşılamayı kaybettiğinden, fonksiyonel bir çok soylu aşılamayı doğrulamak için transplantasyon gereklidir. Her bir klonun fonksiyonel hematopoietik kök hücre potansiyeli, daha sonra kesin fenotipik özelliklerini tanımlamak için o klonun orijinal indeks sıralama parametreleriyle ilişkilendirilebilir. Bu prosedürü takiben, in vitro olarak B ve T hücre gelişimini destekleyen stroma üzerinde hematopoietik döllerin ikincil kültürü gibi diğer yöntemler, bireysel hemojenik öncüllerin lenfosit potansiyelleri hakkında ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.