Name: Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Keşfedin, endotel hücre niş ortak kültürü ve tek hücre dizini kullanarak embriyonik hematopoetik kök hücre öncülerinin klonal analizi yöntemini. Bu teknik, gelişimsel hematopoiezde nadir öncülerin fenotipik özelliklerini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Fred Hutchinson Akış Sitometresi temel yardım için FACS ile Andrew Berger, Stacey Dozono ve Brian Raden teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yardımcı işbirlikçi Grant #HL099997 ve NIDDK #RC2DK114777 vermek #HL100395, ulusal kurumları sağlık NHLBI UO1 grant tarafından desteklenmiştir. Brandon Hadland Alex'in limonata standı Vakfı ve Hyundai umut üzerinde tekerlekler Vakfı tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells%2Flong-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent%2C+IL-3-independent+CD43%28-%29+embryonic+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li>
<li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
<li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis%3A+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).</li>
<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
<li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li>
<li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis%3A+emergence+of+erythroid%2C+megakaryocyte%2C+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

HSC genesis embriyonik gelişim sırasında çalışmanın HSC potansiyel henüz transplante yetişkin alıcılar uzun vadeli multilineage hematopoetik rekonstitüsyon sağlamak için yetki eksik hemogenic öncüleri olarak algılamak için araç gerektirir. Bu protokol için biz embriyonik hemogenic öncüleri klonal bir tahlil vasküler niş ECs stromal ortak kültür tarafından öncüleri HSC için olgunlaşma destekler, AGM fonksiyonel analizde sonraki nakli deneyleri ile mevcut. Dizin izinleri sıralama birleşmesiyle retrospektif fenotipik parame...

Klonal çalışmalar heterojenite yetişkin HSCs, yaşlanma1sırasında HSC alt türlerini ve HSC davranış değişiklikleri yeni bilgi sağlayan uzun vadeli engraftment özelliklerini ortaya koymuştur. Ancak, embriyonik HSCs benzer çalışmaları ve onların öncüleri daha zor olmuştur. Erken embriyonik gelişim sırasında geçici bir süreç içinde hemogenic endotel anılacaktır olarak bilinen öncüleri nüfusu HSCs kaynaklanan olarak endotel hematopoetik geçiş2. Sağlam, uzun vadeli multilineage engraftment şartına yetişkin alıcılar nakli takip sağlamak için onların yetenek tarafından tanımlanan ilk HSC değil embriyonik günün ardından kadar 10.5 (E10.5) fare embriyo çok düşük frekanslı3, tespit . Gelişimleri sırasında öncüleri hemogenic endotel doğan HSC (pre-HSC) için olgunlaşma nakli deneyleri4,5 verimli engraftment için izin yetişkin HSC özelliklerini edinme önce geçmeleri gerekir , 6. nadir HSC kökenli, hematopoetik ataları ile erythroid, çok sayıda çalışmanın engellemeyecek myeloid ve lenfoid potansiyeli zaten algılanır HSC ortaya çıkması pre-HSC7,8önce. Böylece, pre-HSC diğer hematopoetik ataları ayırt clonally hücreleri izole etmek ve onları kendi olgunlaşma için yeterli sinyallerle HSC nakli deneyleri engraftment özelliklerini tespit etmek, sağlamak için yöntemler gerektirir.
Yaklaşımlar bir dizi tarafından ex vivo veya vivo olgunlaşma HSC için pre-HSC tespiti için izin olan tarif edilmiştir. Ex vivo yöntemler kültür nerede ilk HSC geliştirme9' tespit AGM bölge gibi embriyonik dokuların bağlıydı. Bu yöntemler, ayrılma, dahil protokolleri bina sıralama ve AGM dokuların yeniden toplama sıralanmış nüfus içinde para aort E11.5 için E9.5 üzerinden geliştirme sırasında HSC öncüleri içeren karakterizasyonu izin splanchnopleura (P-Sp) / AGM bölgeleri4,5,10; Ancak, bu yaklaşımların öncüleri klonal analiz için gerekli tek hücre düzeyinde yüksek üretilen iş analizi için mükellef değildir. Microenvironment HSC öncüleri, daha önceki aşamalarında destek için daha uygun olduğu kabul edilir nerede benzer şekilde, in vivo olgunlaşma yeni doğmuş fare, içine nakli tarafından da sarısı sac ve AGM sıralanmış nüfus çalışmaları sağladı / P-Sp (P-Sp habercisi AGM için bölgedir) pre-HSC, ama bu yöntemleri özellikleri ile de tek için sağlam bir platform sağlamak için başarısız hücre analizi11,12.
Rafii ve ark. çalışmalardan o Akt aktive endotel hücre (EC) stroma bir niş substrat yetişkin HSC kendini yenileme vitro13,14,15desteği sağlayabilir gösterdi. Biz son zamanlarda Akt aktif EC AGM bölgesinden (AGM-EC) elde edilen hemogenic öncüleri, gibi erken E9 geliştirme, HSC, Yetişkin engrafting için hem de sonraki izole olgunlaşma için uygun vitro niş sağlar tespit kendini yenileme oluşturulan HSC16. Bu sistemi basit bir 2-boyutlu ortak kültür istihdam olduğunu göz önüne alındığında, tek tek izole hemogenic öncüleri HSC potansiyelini klonal analiz için kolayca uyarlanabilir.
Son zamanlarda bir yaklaşım bireysel hemogenic öncüleri AGM-AB ortak kültür ve sonraki fonksiyonel analiz Ekiminde fare embriyo gelen dizin sıralanması birleştirerek klonal hemogenic öncüleri HSC potansiyelini tahlil bildirdin 17deneyleri. Dizin sıralama olduğunu Floresans aktif bir mod hücre (FACS) bu kayıtları (dizinler) sıralama her tek tek sıralanmış hücre böyle fenotipik parametreleri (Yani, ileri dağılım (FSC-A), yan dağılım (SSC-A), floresan parametreleri) tüm bu özellikleri geriye dönük olarak sıralama takip sonraki fonksiyonel analiz için ilişkili olabilir. FACS yazılım her hücre ve pozisyonu/kuyunun yerleştirildiği 96-şey plaka için her iki fenotipik bilgileri kaydeder. Bu teknik daha önce zarif kullanılmış olan yetişkin HSC heterojenite tanımlamak, daha fazla HSC uzun vadeli engrafting alt için zenginleştirmek ve fenotipik HSC parametrelerinin transkripsiyon ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir fenotipik parametreleri belirlemek için özellikleri tek düzey18,19hücre. Burada, benzersiz fenotipik parametreleri tanımlaması ve pre-HSC katkılarıyla lineage embriyonik gelişme erken aşamalarında sağlar bu yaklaşımın detaylı metodoloji sağlamak.

<table><tbody><tr><td><güçlü>AGM-EC kültür ortamı </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Endotel hücrelerinin kültürü için malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>AGM-EC tek katmanlarını ayırmak için kullanın</td></tr><tr><td>Suda %0.1 Jelatin</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7903</td><td>AGM-EC tek katmanlarını plastiğe</td></tr> <tr><td>yapıştırmak için kullanın96 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>AGM-EC tek katmanlarını birlikte kültürlemek ve sıralanmış klonları indekslemek için kullanın</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Diseksiyon ve FACS boyama için kullanın</td></tr><tr><td>500 ml filtre şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>Steril filtre için kullanın Endotel ortamı</td></tr><tr><td><güçlü>AGM-EC kültür ortamı (500 mls)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)</td> <td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Sığır Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg 10 ml ortam</td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM)</td> <td>içinde çözülmüşKök Hücre Teknolojileri</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Endotelyal Mitojen (EKGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Çözünmesi için 10 mls besiyeri ekleyin ve ekleyin</td></tr><tr><td><güçlü>AGM indeksi için malzemeler sort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz (%0.25)</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7902</td><td>Embriyonik dokuların ayrışması için kullanım</td></tr><tr><td>3ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td> FACS 0.22 ve mikro <td>için steril filtre antikor solüsyonlarında kullanın</td></tr><tr><td>; M şırınga tahrikli filtre</td><td>Kırlangıç</td><td>SLGP033RS</td><td>Steril filtre için kullanın FACS için antikor solüsyonları Hücre</td></tr><tr><td>süzgeç kapaklı 5 ml polistiren tüp</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS DAPI'den önce hücre kümelerini çıkarmak için kullanın</td></tr><tr><td>(H2O'da 1 mg / ml stok olarak hazırlanır)</td> <td>Millipore</td><td>268298</td><td>Ölü hücreleri sıralamadan çıkarmak için kullanın</td></tr><tr><td>anti-fare CD16 / CD32 (FcR bloğu)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Fc reseptörlerine spesifik olmayan lekelenmeyi engellemek için kullanın</td></tr><tr><td><AGM indeksi sıralaması</güçlü>></td><td></td><td></td><td></td> için antikorlar /</tr><tr><td>anti-fare CD144 PE-Siyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 kappa İzotip Kontrolü, PE-Siyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>CD144 PE-Siyanin7</td></tr><tr><td>Anti-fare CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td> <td>için izotip kontrolüeBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>CD201 için İzotip kontrolü PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-fare CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 kappa İzotip Kontrolü, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>CD41</td></tr><tr><td>PE Anti-fare CD45 FITC</td> <td>için izotip kontrolüeBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>CD45 için izotip kontrolü FITC</td></tr><tr><td>AGM-serum ücretsiz ortam (10mls)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 mls</td></tr><tr><td>rekombinant murin kök hücre faktörü (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinant insan FLT3 Ligand (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinant insan trombopoietini (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 20 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinant murin interlökin-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg / ml stok) Nihai konsantrasyon 20 ng / ml</td></tr> <tr><td>< güçlü > Ko-kültürlenmiş hücrelerin boyanması için malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka, V-alt</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>FACS analizi için kullanın</td></tr> <tr><td>< güçlü > endotel hücreleri ile birlikte kültürlenmiş İndeks sıralanmış klonların analizi için antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-fare CD45 PerCP-Siyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PE-Siyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>Anti-fare CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) için izotip kontrolü APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-fare F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-fare Ly-6G/C (Gr1) FITC</td> için izotip kontrolü<td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Ly-6G/C ve CD3 için izotip kontrolü FITC</td></tr><tr><td>Nakil için kuyruk damarı enjeksiyonu için malzemeler< / 29G</td> 1/2" iğneli güçlü><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml insülin şırıngaları</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>Transplantasyon için kuyruk damarı enjeksiyonu için kullanın</td></tr><tr><td>< güçlü>Translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Boyama</td></tr> için İzotip kontrolü için Anti-fare analizi için antikorlar <tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>F4 / 80 PE</td></tr><tr><td>Anti-fare CD3 için</td> izotip kontrolü FITC <td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Anti-fare CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>550992 Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>CD19 için izotip kontrolü APC</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45.1 (A20) PE-Siyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>CD45.1 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45.2 (104) için izotip kontrolü APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APC-eFluor780 eBioscience</td><td></td><td>47-4321-80</td><td>CD45.2 APC-eFluor780 için izotip kontrolü</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II, DIVA yazılımı ile</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II, plaka okuyuculu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>Hücre saymak için</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td> dağıtım hücreleri</td></tr><tr><td>FACS analiz yazılımı</td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Hematopoetik kök hücre (HSC) genesis embriyonik gelişim sırasında çalışma özelliği erken embriyo HSC öncüleri nadir ve işlevsel olarak uzun vadeli multilineage engraftment potansiyelini belirlemek deneyleri eksikliği ile sınırlı bireysel sözde HSC öncüleri. Burada, yalıtım ve işlevsel olarak doğrulanmış HSC öncüleri tek hücre düzeyinde karakterizasyonu sağlar metodoloji açıklayın. İlk olarak, biz kesin fenotipik parametresi, tek tek sıralanmış her hücrenin katalog için dizin sıralama kullanmak deneysel analizi için ek işaretçileri olan HSC öncüleri için zenginleştirmek için fenotipik işaretçileri kullanarak. İkinci olarak, her dizin sıralanır hücre vasküler niş stroma sigara engrafting HSC öncüleri multilineage, uzun vadeli engraftment içinde potansiyel ile fonksiyonel HSC için olgunlaşma destekler aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölge ile ortak kültürlü. nakli deneyleri. Bu metodoloji korelasyon klonal hemogenic öncüleri ile fonksiyonel engraftment potansiyellerini fenotipik özellikleri veya transkripsiyon profil, HSC habercisi ayrıntılı bir analiz için bir araç sağlayan gibi diğer özellikleri sağlar tek hücre düzeyinde geliştirme.

Şekil 1A bir şematik deneysel tasarım gösterir. P-Sp/AGM doku disseke, havuza alınmış ve collagenase içinde ayrışmış sonra dizin sıralama için antikorlar VE-Cadherin ve EPCR ile lekeli. Pre-HSC VE-Cadherin+EPCRyüksek (şekil 1B) göre hücrelerdeki zenginleştirilmiş. Diğer fluorochrome Birleşik antikorlar geriye dönük olarak her hücre için dizin sıralama sırasında kaydedilir ek fenotipik parametreler analiz dah...

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Bu yöntemin genel amacı, murin embriyonik gelişimi sırasında klonal Hematopoetik Kök Hücre veya HSC öncüllerinin fenotipik özelliklerini ve aşılama potansiyelini belirlemektir. Bu yöntem, gelişimsel hematopoez alanında, embriyonik gelişim sırasında klonal HSC öncülerinin benzersiz soy katkıları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hemojenik öncüllerin tek hücre düzeyinde analiz edilmesidir.Bu, nadir HSC öncülerini ayırt eden benzersiz fenotipik özelliklerin tanımlanmasına izin verir. Aort-Gonad-Mezonephros, AGM, koitumdan 9.5 ila 11.5 gün sonra embriyolardan diseke edilen dokuları, buz üzerinde% 10 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre PBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyerek başlayın. Dokular tüpün dibine çöktüğünde, süpernatanı aspire edin ve numunelere hemen bir mililitre% 0.25 kollajenaz ekleyin.37 santigrat derece su banyosunda 25 dakika sonra, bir mililitre PBS artı FBS ile reaksiyonu durdurun ve tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar dokuları 20 ila 30 kez ezmek için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Daha sonra hücreleri sekiz mililitre PBS artı FBS ile seyreltin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Pe

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, HSPC'leri kemik iliğinden izole etmek ve bunları tek tek sıralanmış HSPC'leri elde etmek için bir yöntem olan floresan aktive hücre sıralama tekniği kullanarak sıralama protokolü açıklanmaktadır. HSPC klonlarını elde etmek için bu sıralanmış hücreleri kültüre ediyoruz.

HSPC Klonlarının Kültürlenmesi ve Hasat Edilmesi: Tek Başına Sıralanmış HSPC Klonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Genetik olarak tasarlanmış fare modellerinden primer tümöre özgü endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir bir yöntem bildiriyoruz.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.

İnsan Eksfoliye Edilmiş Yaprak Döken Dişlerden İmmünfenotipli Mezenkimal Kök Hücrelerin Tek Hücreli Sınıflandırılması

Keşfedin, endotel hücre niş ortak kültürü ve tek hücre dizini kullanarak embriyonik hematopoetik kök hücre öncülerinin klonal analizi yöntemini. Bu teknik, gelişimsel hematopoiezde nadir öncülerin fenotipik özelliklerini belirlemeye yardımcı olur.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi (Video) | JoVE Journal

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Daha fazla video keşfet