Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem

Bu yöntemin genel amacı, yarı otomatik bir protokol kullanarak anne sütü ve diğer düşük biyokütle örneklerinden 16 SRRNA'yı amplifiye etmektir. Bu yöntem, hem sağlık hem de hastalıkla ilgili olarak insan mikrobiyomunun gelişimi ve bozulmalarındaki kilit soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, yarı otomatik olması, gerçekleştirmesinin nispeten kolay olması ve sekresyon, sürüntü ve dışkı dahil olmak üzere birden fazla numune türüne uyarlanabilir olmasıdır.

Tam yağlı sütü metin protokolüne göre çözdürdükten ve ayırdıktan sonra, hücreleri peletlemek için numuneleri 5000 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika döndürün. Üst yağ tabakasını çıkarmak için plastik bir spatula veya büyük delikli pipet ucu kullanın. Daha sonra peleti rahatsız etmeden, 100 mikrolitre hariç tüm süpernatanı çıkarın.

Bir mililitre PBS ile peleti tekrar askıya alın ve yıkayın. Daha sonra beş mililitrelik bir tüpe bir mililitre steril PBS ekleyerek negatif bir kontrol hazırlayın. Süspansiyonu temiz bir nokta beş mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında 5000 kez G'de döndürün.

Ardından, tüm süpernatan yağ tabakasını atmak için 1000 mikrolitrelik steril filtreli bir pipet ucu kullanın. Numuneyi bozmak ve homojenize etmek için, pelete beta merkaptoetanol içeren 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve süspansiyonu bir boncuk tüpüne aktarın. Lizis tamponu ve 20 mikrolitre bakteri sahte numunesi ile bir pozitif kontrol hazırlayın.

Tüm boncuk tüplerini 15 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra numuneleri sıcaklık kontrollü bir girdap üzerinde 37 santigrat derece ve 700 ila 800 RPM'de 10 dakika ısıtın. Tüpleri otomatik numune bozucu adaptör setine yükleyin.

Sonra boncuk örnekleri bir dakika boyunca 30 hertz'de dövdü. Adaptör setini sökün ve sampile manuel olarak değiştirinampsol robotik koldan cihazın sağ robotik koluna plakalar. Boncuk tüpleri bir dakika daha 30 hertz'de çırptı, ardından tüpleri üç dakika boyunca 17, 200 kez G ve 25 santigrat derecede santrifüjledi.

200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, numunenin üst kısmındaki yağ tabakasının hiçbirini veya altındaki boncuk kalıntısını almamaya dikkat ederek tüm süpernatanı çıkarın. Süpernatanı homojenizatör kolonlarına uygulayın. Ardından sütunları maksimum hızda ve 25 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.

350 mikrolitre eluid'i iki mililitrelik bir üretici mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNA'yı metin protokolüne göre izole etmek için, kapakları kesin ve DNA ve RNA için ayrı spin sütunlarının kenarlarını düzeltin. Toplama tüpü olmadan DNA döndürme kolonunu rotor adaptörüne yerleştirin.

Ardından toplama tüpünü atın. Ardından, girdaplanmış iki mililitrelik tüpleri, üreticinin talimatlarına göre otomatik DNA/RNA saflaştırma cihazının yükleme tablosunu izleyerek bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bir nokta beş mililitre toplama tüplerini etiketleyin ve bunları rotor adaptörlerine yerleştirin.

Ardından, otomatik DNA/RNA saflaştırma cihazının yükleme tablosunu takip ederek rotor adaptörlerini santrifüje yerleştirin. Filtre uçlarını, RNaz içermeyen suyu ve reaktifleri cihazın reaktif bloğuna yerleştirdikten sonra, cihazın kapağını kapatın ve cihaz üzerinde özel DNA saflaştırma programını çalıştırın. Reaksiyon tamamlandığında, tüpleri içeren numuneyi çalkalayıcıdan alın ve herhangi bir numune kalırsa, kısa süreli saklama için eksi 20 santigrat derecede veya uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Çalışma alanını ve PCR ana karışımını hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 50 ila 100 mikrolitre DNA örneğini, 96 oyuklu plaka haritasını takip ederek 32 oyuklu bir alet numune adaptörüne yükleyin. Her PCR plakası için, temiz bir nokta beş mililitre toplama tüpüne 30 mikrolitre PCR suyu pipetleyerek iki negatif kontrol ayarlayın. Ardından tüm numuneleri, kapakları açık konumda kilitlenmiş 32 oyuklu cihaz numune adaptörüne yerleştirin.

Cihazın reaktif adaptöründe, belirli barkod numaralarına sahip her bir ters astarın kapağını teker teker çıkarın. Robotik sıvı işleyiciyi yüklemek için, kenar etkisini önlemek için reaktif adaptörünü B1.In konumuna yerleştirin, adaptörün bir kenarını dikkatlice kavrama tarafına yerleştirin ve diğer kenarı yavaşça aşağı indirin. Adaptörlerin tüm köşelerine bastırdığınızdan emin olun.

S'yi yerleştirinampadaptör C1 konumuna, adaptörlerin tüm köşelerine bastırdığınızdan emin olun. Ardından beş mililitrelik ana karışımı girdaplayın. Kapağı açın ve cihazın ana karışım ve reaktif bloğu üzerindeki A konumuna yerleştirin.

PCR plakasını, yarım etekli PCR plakalarını tutması amaçlanan 96 oyuklu cihazın adaptörüne yerleştirin. Ardından çalıştırmayı başlatın ve yeni bir dosya olarak kaydedin. Çalıştırma tamamlandığında herhangi bir hata olmadığını doğrulayın.

Ardından plakayı kapatmak için 12 veya sekiz şerit kapak kullanın. Kuvvetlice girdap yapın ve plakaları bir dakika boyunca döndürmek için 96 oyuklu bir plaka döndürücü kullanın. Son olarak, plakayı amplifikasyon sonrası odaya taşınana ve termal döngüleyiciye yüklenene kadar buzun üzerine yerleştirin.

PCR amplifikasyonunu takiben, metin protokolüne göre kalite kontrol ve kütüphane hazırlığı yapın. Protokolün ilk kalite kontrol adımı, 16SV4 bölgesinin PCR amplifikasyonunu takip eder. Burada gösterildiği gibi, her numuneden bir mikrolitre PCR ürünü, 350 ila 450 baz çifti arasında beklenen boyut aralığında olduğunu doğrulamak için elektroforez ile analiz edildi.

Bazı anne sütü numuneleri daha düşük miktarlarda spesifik ürün üretti, bu da bu numunelerde düşük seviyelerde ekstrakte edilmiş mikrobiyal DNA olduğunu veya ekstraksiyon sırasında PCR inhibitörlerinin taşındığını düşündürdü. Her bir numune için spesifik ürünün miktar tayini, dizileme için numunelerin eşit molar havuzlaması için gerekli hacmini belirlemek için gerekliydi. Hedeflenen dizileme için havuzlanmış bir kitaplığa genellikle belirli bir PCR ürünü hakimdir.

Kütüphanede önemli miktarda spesifik olmayan ürün varsa, iş akışına bir jel saflaştırma adımı eklenmelidir. Dizileme sonuçları, anne sütü mikrobiyomu ile ilişkili taksonlarda yüksek çeşitlilik ve her numune için dizileme kamış sayımlarının sayısındaki değişkenliği göstermektedir. Buna karşılık, bakteri sahtesi için takson bileşimi ve kamış sayımları, önceki iş akışı çalıştırmalarında sahte için elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilirdi, bu da anne sütü örnekleri için gözlemlenen değişkenliğin, içsel iş akışı değişkenliğinin bir fonksiyonu değil, gerçek bir deneysel sonuç olduğunu düşündürdü.

Bir sıralayıcı gece boyunca çalışır durumda bırakılırsa, tüm örnekler ilk PCR çalışmasına yükselirse, bu teknik 12 ila 24 numune için iki gün içinde yapılabilir. Değilse, başka bir kabuk gününe ihtiyaç vardır. Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için sadece PCR öncesi alandan PCR sonrası alana seyahat etmek önemlidir.

Herhangi bir çapraz kontaminasyonu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirmek de çok önemlidir. İnsan numuneleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve her zaman uygun koruyucu ekipman ve biyo güvenlik kabinleri gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.