Name: Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, mikroplaka florometrisi kullanarak flavin içeren mitokondriyal dehidrojenazlardan süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretimini eş zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, istenmeyen yan reaksiyonları ortadan kaldırarak bireysel üretim bölgelerinin ROS oluşturma potansiyelini doğrudan değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) tarafından finanse edildi. Video üretim merkezi için yenilik öğretim ve öğrenme (CITL), Newfoundland Memorial Üniversitesi ile işbirliği içinde gerçekleştirilmiştir.

1. kimyasal maddeler ve arıtılmış enzimler
<ol><li>Aşağıdaki belgeleri temin etmek: PDHC ve KGDHC domuz kalp kökenli (veya başka bir saf mitokondriyal flavoenzyme); H2O2 (% 30 çözüm), pyruvate, α-ketoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, tiamin pirofosfat (DYP), mannitol, HEPES, sukroz, EGTA, 3-metil-2-oxo valeric asit (KMV), süperoksit dismutaz (SOD), horseradish peroksidaz (HRP), 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reaktifi (AUR) ve CPI-613.</li>
</ol>2. planlama tahlil ve reaktif hazırlık
<ol><li>Tablo 1 göre tahlil bir 96-şey plaka ayarlayın. Not: Toplam her reaksiyon için 200 µL. hisse senedi konsantrasyonları böyle reaktif 20 µL eklenir ayarlanır birimdir her şey için. Bu kofaktör ve yüzeylerde de tahlil başlamadan önce her tepki için hızlı ek sağlar.</li>
	<li>220 mM mannitol, 70 mM sukroz, 1 mM EGTA ve 20 mM HEPES (pH 7.4 HCl ile) içeren tepki arabellek hazırlayın. Not: Bu farklı arıtılmış enzimler fiziksel özellikleri bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Saf KGDHC veya PDHC enzim aktivitesi deneyleri14,16,17 kullanarak kirlenme veya immunoblot incelemek veya Coomassie leke5.</li>
	<li>Tablo 1çalışma çözüm konsantrasyonlarda göre tepki arabellekteki tüm reaktifler hazırlayın.</li>
	<li>1 mL aliquots-20 ° C'de olarak tüm reaktifler saklamak Auto-oksidasyon ve tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle kendiliğinden yıkımı önlemek için 100 µL aliquots pyruvate ve α-ketoglutarate-80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>AUR reaktif DMSO 1 mL ana stok hazırlamak ve 100 µM tepki arabelleği için oranında seyreltin. Işıktan korunan mağaza. Not: Burada, 100 µM çalışma çözüm taze her 2-3 hafta yaptı ve ışıktan korunan.</li>
</ol>3. Assay şablon ayarlama
<ol><li>Bir tek renkli Mikroplaka okuyucu Çift ölçüm yetenekleri ile tahlil ameliyat ayarlayın.</li>
	<li>Okuma yordamı "Protokol" seçerek belirleyin. O zaman "Yordamı"'ı tıklatın.</li>
	<li>"Sıcaklık" 25 ° C (şekil 1A) ayarlayın.</li>
	<li>"Başlamak okuma koşulları (şekil 1A) ayarlamak için kinetik"'ı tıklatın. Okuma aralıkları/deneyler sayısı ve zamanı ayarlayın.</li>
	<li>Tıklayın "oku" (şekil 1B). Not: Üst konumda örnekleri okunduğu bir kazancı 50. Süresi: okuma 5 dk, 30-s aralıklarla. Kanal 1: Resorufin floresan - uyarma/emisyon 565 nm:600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Kanal 2: NADH autofluorescence - uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm.</li>
	<li>Altında "okuma", wells (örneğin, A1-A4 ve B1-B4) monitör için seçin.</li>
	<li>"Son kinetik" seçin.</li>
</ol>4. standart eğrileri
<ol><li>Reaktifleri çözülme ve ihtiyaç kadar buza saklayın.</li>
	<li>
NADH standart eğri (şekil 2A)
	<ol>
<li>Çalışma çözümleri 0,5-10 mM tepki arabelleği konsantrasyon aralığında NADH için hazırlayın.</li>
		<li>20 µL aliquots çözüm konsantrasyonu 180 µL tepki arabellek içeren wells için çalışma her NADH ekleyin. NADH son konsantrasyonu her şey 0,05-1 mM.</li>
		<li>"Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm. Not: Bu salt okunur bir son nokta - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AUR standart eğri (şekil 2B)
	<ol>
<li>Hidrojen peroksit tepki arabelleği çalışma stokları hazırlamak; hisse senedi konsantrasyonları 200-4.000 nM arasındadır.</li>
		<li>120 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin.</li>
		<li>HRP 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma 30 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 U/mL =), 20 µL SOD (hisse senedi toplama çalışma 250 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 U/mL =) ve AUR 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 100 µM = iyi son konsantrasyonu 10 µM =) de içeren her reaksiyon arabellek için.</li>
		<li>Her tampon ve tahlil reaktifler de içeren stok çözüm çalışma her H2O2 20 µL ekleyin. Son tepki birim 200 µL ve her iyi H2O2 son konsantrasyonu 20-400 nM.</li>
		<li>1 dk içinde 25 ° C'de plaka okuyucu için tabak kuluçkaya</li>
		<li>"Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 565 nm/600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Bu salt okunur bir son nokta olduğunu unutmayın - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. O2●- / h2 O2 yayın ve KGDHC ve PDHC tarafından NADH üretim ölçme
<ol><li>Bkz. Tablo 1 farklı reaktifleri ilavesi sipariş için her çalışma çözüm ve birimin her için eklendi iyi.</li>
	<li>40 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin. KMV veya CPI-613 kullanarak deneyleri için 20 µL arabelleği her şey için ekleyin.</li>
	<li>PDHC veya KGDHC 20 µL ekleyin (çalışma stok 1 U/ml, son konsantrasyonu iyi başına 0.1 U/mL =) her şey için.</li>
	<li>PDHC ve KGDHC için 2 dk 25 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>KMV 20 µL ekleyin (çalışma stok = 100 mM, son konsantrasyonu = 10 mM) veya CPI-613 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 1.5 mM, son konsantrasyonu = 150 µM =) (Tablo 2). Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir.</li>
	<li>25 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir.</li>
	<li>HRP 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama çalışma 30 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 adet/mL =) ve SOD 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 250 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 adet/mL =) her şey için.</li>
	<li>Koenzim a 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma = 1 mM, son konsantrasyonu = 0,1 mM), 20 µL DYP (hisse senedi toplama çalışma = 3 mM, son konsantrasyonu 0.3 mM =) ve NAD+ 20 µL (hisse senedi toplama çalışma = 10 mM, son konsantrasyonu = 1 mM) her w söyle.</li>
	<li>AUR reaktif koruyucu folyo kaplama kaldırın ve her şey için 20 µL ekleyin.</li>
	<li>Pyruvate 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) PDHC ve α-ketoglutarate içeren wells için (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) için KGDHC içeren wells.</li>
	<li>"Oku" Kinetik ölçüm başlatmak için tıklatın.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>Klavye 'CTRL' düğmesini basılı tutun ve kuyu Kanal 1 (şekil 3A) karşılık gelen tüm Kinetik ölçüleri içeren bir grafik oluşturmak için tıklatın.</li>
	<li>Farklı zaman noktalarda (3B rakam) ölçülen göreli Floresans birimleri (RFU) için "veri" görünümü simgesi ham değerleri için sağ üst köşedeki tıklatın.</li>
	<li>Analizi (Tablo 3) değerleri verin.</li>
	<li>"Grafik" damla aşağı yemek listesi (şekil 3B) sağ üst üzerinde Floresans Kanal 2 ile ilişkili RFU değerlerini erişmek için tıklatın.</li>
	<li>6.1-6.3 Kanal 2 için yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li>
<li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

İfşa etmek bir şey yoktur.

Bu iletişim kuralı beri avantajlıdır, 1) bu aksi takdirde H2O2 algılama (örneğin, antioksidan sistemleri veya diğer kaynakları ROS), ile 2 engel olabilecek herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırır) yerel oranı doğrudan bir değerlendirmesini sağlar ROS serbest bir flavin içeren mitokondrial dehidrogenaz tarafından 3) yerli karşılaştırmasını sağlar ROS yayın oranları iki veya daha fazla saf flavin tabanlı dehydrogenases, 4) oranı ROS yayın ve enzim aktivitesi ve 5 doğrudan karşılaştırma i...

Besin metabolizma, nihai hedefi adenozin trifosfat (ATP) yapmaktır. Memeli hücrelerinde mitokondri, ATP karbon depolanan enerji dönüştürme çift membraned organelleri içinde oluşur. Karbon iki elektron taşıyıcıları, NADH ve flavin adenin dinükleotit (FADH2)1şekillendirme mitokondri tarafından yakılarak olduğunda ATP üretimi başladı. NADH ve FADH2 o zaman okside çoklu alt birim solunum kompleksleri tarafından ı ve II, sırasıyla ve elektron alıcısı moleküler oksijen (O2) karmaşık IV1için serbest elektron Guam'dan sürekli. Thermodynamically olumlu "yokuş aşağı" transferi elektron zinciri sonundaki O2 proton verileceği intermembrane birleştirilmiştir uzay kompleksleri tarafından ı, III ve IV. Bu bir transmembran elektrokimyasal gradyan proton (proton-sebep kuvvet), ATP2yapmak için karmaşık V tarafından dinleniyor Gibbs serbest enerjisi geçici bir form oluşturur. Elektron transferi reaksiyonlar mitokondri içinde mükemmel ATP üretimi için birleştiğinde değil. Krebs döngüsü ve solunum zinciri çeşitli noktalarda, elektron zamanından önce O2 forma ROS3ile etkileşim kurabilir. Mitokondri tarafından oluşturulan en biyolojik ilgili ROS O2● - ve H2O2' dir. Şimdi ne kadar O2● - kez mitokondri tarafından kurulan proksimal ROS olarak, üretim siteleri ücretsiz ile ilişkili olduğu O2● - ve H2O2, karışımı oluşturmak belirgin flavin protez radikal kimya4,5gruplandırır. Yüksek düzeylerde ROS oksidatif stres6' kaynaklanan hücre işlevi için gerekli biyolojik bileşenlerinin zarar tehlikeli olabilir. Ancak, düşük tutarları, mitokondrial ROS hayati sinyal işlevleri yerine getirmek. Örneğin, H2O2 sürümü mitokondri T hücre aktivasyonu, stres sinyal (örneğin, indüksiyon Nrf2 sinyal yollar), hücre çoğalması ve farklılaşma indüksiyon kontrolünde karıştığı olmuştur, insülin sinyal ve serbest bırakmak ve davranış7besleme. Önemli ROS sinyal gönderme işlevini anlama konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Ancak, önemli soru hala cevap bekliyor hangi açısından enzimler mitokondri içinde en önemli kaynakları ve nasıl üretim kontrol olarak hizmet vermektedir.
ROS yayın üretim sitesi tarafından birkaç faktöre bağlıdır: 1) konsantrasyonu elektron bağış site, 2) elektron bağış sitesi, oksijen ve 4) konsantrasyon 3) erişim Redoks durumunu ve oksidasyon substrat3, türü 8 , 9. NADH ve membran potansiyel gücü konsantrasyonu da etkiler gibi ROS üretim8,10mitokondri içinde diğer faktörler. Örneğin, O2●-/ h2O2 tarafından üretimin saf PDHC veya KGDHC hızı artan NADH durumu5,11ile artar. Bu senaryoda, elektron geriye doğru PDHC ya da KGDHC,O2● // h2O2 üretim12sitesi E3 alt birim FAD Merkezi NADH akıyor. Benzer şekilde, NAD+ hükmü ROS yayın KGDHC12azalan ters etkiye sahiptir. Böylece, kontrol giriş veya çıkış elektron ROS üretim sitelerden ne kadar O2●-/ h2O2 oluşan değiştirebilirsiniz. Örneğin, PDHC veya CPI-613, analog, sonuçları bir neredeyse % 90 O2● -içinde/h2O2 üretim13azaltmak lipoic asit ile KGDHC E2 alt birim engelliyor. Kimyasal S-glutathionylation Katalizörler, diamide ve Ampisilin, hangi neredeyse O2●-/ h2O2 üretim PDHC veya KGDHC tarafından glutatyon e konjugasyon üzerinden kaldırılması ile benzer sonuçlar elde 2 alt birim14. E2 alt birim PDHC ve KGDHC ile elektron akışını engelleme için ticaret-off ROS oluşumuna elektron taşıma zinciri tarafından (örneğin, karmaşık III) azalır NADH üretim bir azalmadır. Bu da elektron taşıma zinciri tarafından ATP çıkış düşürebilir. Genel olarak, ROS üretim siteleri için elektron giriş kütük parçası O2●-/ h2O2 üretim kontrol son derece etkili bir anlamı olabilir.
Mitokondri 12'ye kadar potansiyel O2●-/ h2O2 kaynakları6içerebilir. Bu sitelerin çoğu flavin içeren O2● - ve H2O2karışımı oluşturan enzimler. Farklı yüzey ve önleyici bileşimleri kullanımı hangisitelerde oluşturan yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 solunum kompleksleri ve mitokondriyal dehydrogenases hizmet tanımlaması için izin verilen farklı dokuların3. PDHC ve KGDHC yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 kas ve karaciğer mitokondri13,15yayan siteleri hizmet gösterilmiştir. Ancak, mitokondri ve etkisi farklı substrat ve önleyici bileşimleri olan bireysel sitelerin potansiyel oluşturan O2●-/ h2O2 incelenmesi açısından bazı zorluklar kalır enzimler faaliyetleri. Bu istenmeyen yan reaksiyonlar (örneğin, O2●-/ h2O2 siteleri dışındaki faiz enzim tarafından oluşumu) varlığı nedeniyle, endojen besin (örneğin,yağ kirletici asitler) veya organelleri (örneğin, aynı zamanda O2●-/ h2O2şeklinde tanımladıkları) ve seçicilik eksikliği inhibitörleri kullanımı ve/veya tamamen ROS üretim inhibe değil bileşikler kullanımı. Belirli inhibitörleri Ayrıca mitokondriyal bioenergetics ve elektron akışı yönünü değiştirebilir ve bu üretimin diğer sitelerden ROS sürüm değiştirir ve sonuçları zihnimi karıştıran. O2●-/ h2O2 serbest bırakılması için bireysel sitelerinden mitokondri yapılan mutlak oranları da O2● - ve H2O2 yüksek konsantrasyonu nedeniyle ölçmek zordur matris ve intermembrane alanı içinde enzimler ortadan kaldırarak. Bu nedenle, O2●-/ h2O2 yayın ölçümleri ile engelleyebilir herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırılması yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 belirlerken yararlı olabilir siteleri şekillendirme.
Burada, O2●-/ h2O2 üretim ve NADH oluşumu eşzamanlı incelenmesi için saflaştırılmış flavin bağımlı dehydrogenases tarafından sağlar basit bir yöntem mevcut. Arıtılmış enzimler kullanarak, istenmeyen yan reaksiyonlar oluşturan ROS ve enzimler aşağılayıcı ROS bırakmak daha doğru bir ölçü birimi yerel O2●-/ h2O2 üretim oranları için bireysel flavoenzymes için ortadan kaldırılabilir. Bu yöntem doğrudan O2●-/ h2O için kapasite farklı arıtılmış dehydrogenases veya ekran potansiyel siteye özgü inhibitörleri oluşturan O2●-/ h2O2 karşılaştırmak için kullanılabilir 2 serbest bırakmak. Son olarak, O2●-/ h2O2 ve NADH üretim aynı anda ölçme enzim aktivitesi ve ROS yayın kapasitesi arasındaki ilişkinin gerçek zamanlı bir değerlendirmesi için izin verebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Pirüvat dehidrojenaz kompleksi</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>saflaştırılmış flavoenzim</td></tr><tr><td>alfa-ketoglutarat dehidrojenaz kompleksi</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>saflaştırılmış flavoenzim</td></tr><tr><td>%30 hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>reaktifi, standart eğriler</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>reaktifi, aktivite/ROS salım deneyi</td></tr><tr><td>NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>reaktifi, standart eğriler</td></tr><tr><td>piruvat</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>reaktifi, aktivite/ROS salım testi</td></tr><tr><td>alfa-ketoglutarat</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>reaktifi, aktivite/ROS salım testi</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>reaktif, aktivite/ROS salım tahlili</td></tr><tr><td>tiamin pirofosfat</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>reaktif, aktivite / ROS serbest bırakma testi</td></tr><tr><td>mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>tampon bileşeni</td></tr><tr><td>sükroz</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>tampon bileşeni</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>tampon bileşeni</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>reaktifi, ROS salınım inhibitörü</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td><td>reaktifi, ROS salım inhibitörü</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>reaktifi, ROS salım tespiti</td></tr><tr><td>yaban turpu peroksidaz</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>reaktifi, ROS salım tespiti</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>reaktifi, ROS salım tespiti</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2 mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>tahliller için mikroplaka okuyucu</td></tr><tr><td>Gen5 yazılımı</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>yazılımı, ham RFU</td></tr><tr><td>Graphpad Prism Graphpad</td><td>yazılımının</td><td></td> toplanması için kullanılır<td>, yazılım yazılımı, veri analizi,</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td>, <td>Microsoft</td><td>yazılımı, veri analizi</td><td></td></tr></tbody></table>

süperoksit/hidrojen peroksit ve nadh üretim mitokondriyal dehydrogenases flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) 12 enzimatik kaynakları içerebilir bildirilmiştir. Bu sitelerin çoğunluğu flavin bağlı solunum kompleksleri ve süperoksit (O2● -) ve hidrojen peroksit (H2O2) karışımı üretmek dehydrogenases içerir. ROS üreten potansiyel izole mitokondri içinde bireysel siteleri doğru miktar antioksidan savunma sistemleri ve ayrıca O2●-/ h2O2formu yan reaksiyonlar varlığı nedeniyle zor olabilir. Mitokondriyal bioenergetics bozabilir nonspesifik inhibitörleri kullanımı da ROS yayın üretim diğer sitelerden değiştirerek ölçümleri olumsuz etkileyebilir. Burada, saflaştırılmış flavin bağlı dehydrogenases tarafından eş zamanlı ölçüm H2O2 serbest bırakmak ve Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) üretim için kolay bir yöntem mevcut. Burada kastedilen, örnek olarak saflaştırılmış pyruvate dehidrogenaz kompleksi (PDHC) ve α-ketoglutarate dehidrogenaz kompleksi (KGDHC) domuz kalp kökenli kullandık. Bu yöntemi doğru bir ölçü oranlarının yerli H2O2 yayın üretim bireysel siteleri tarafından ROS ve antioksidan sistemleri diğer potansiyel kaynakları ortadan kaldırarak olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem H2O2 serbest bırakmak ve enzim aktivitesi ve etkinliği testi ile taranması ve inhibitörleri ROS üretim için selectivity ilişkisi doğrudan karşılaştırması için izin verir. Genel olarak, bu yaklaşım ROS yayın izole mitokondri veya permeabilized kas fiber ile daha sofistike deneyler önce bireysel enzimler için yerel oranları derinlemesine değerlendirilmesi için izin verebilirsiniz.

Şekil 3A tarafından arıtılmış KGDHC H2O2 ve NADH üretim eş zamanlı ölçüm sırasında toplanan RFU için bir temsilci izleme sağlar. Ham RFU veri her zaman aralığı için şekil 3B' tasvir edilir. Ham RFU veri daha sonra analiz için verilir. Şekil 2' de sunulan standart eğriler üzerinden extrapolating tarafından her ölçüm Aralık 5 dk süre içinde oluşan NADH ve H2O2</sub...

Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) üretebilir birkaç flavin bağımlı enzim içerir. ROS izleme mitokondri içinde tek tek siteleri istenmeyen yan tepkiler nedeniyle zorlu sürümüdür. Biz saf flavoenzymes ve Mikroplaka fluorometry kullanarak ROS yayımı için yerel oranları doğrudan değerlendirilmesi için bir kolay, ucuz yöntemi mevcut.

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroplaka florometri kullanılarak saflaştırılmış flavin içeren mitokondriyal dehidrojenazların süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim hızını ölçmektir. Mitrokondri, izole edilmiş mitokondri ile farklı substrat ve inhibitör kombinasyonları kullanılarak tanımlanmış 12 farklı süperoksit/hidrojen peroksit oluşturma bölgesi içerebilir. Bununla birlikte, izole edilmiş mitokondrideki bireysel üretim bölgelerinin salım kapasitesinin doğru bir şekilde ölçülmesi konusunda hala bazı zorluklar devam etmektedir.Ve bu, aynı zamanda reaktif oksijen türleri üreten istenmeyen yan reaksiyonlarla ilişkilidir, aynı zamanda antioksidanların varlığı ve ölçümlere müdahale edebilecek katkı maddelerinin kullanımına ek olarak özgüllüğü olmayan inhibitörlerin kullanımı ile ilişkilidir. Burada, saflaştırılmış flavin bağımlı mitokondriyal dehidrojenazlar tarafından süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretiminin eşzamanlı ölçümü için yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü istenmeyen yan reaksiyonları ve herhangi bir reaktif oksijen türü söndürme sistemini ortadan kaldırarak bireysel üretim alanlarının ROS üretme potansiyelinin doğrudan ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verebilir.Hem ROS hem de NADH üretiminin eşzamanlı ölçümü, mitokondri ile deneyler yapılmadan önce ROS üretimi için inhibitörlerin taranması için değerli olabilecek süperoksit / hidrojen peroksit oluşturma potansiyelinin ve bireysel enzimlerin aktivitesinin doğrudan karşılaştırılmasına da izin verir. Buradaki amaçlarımız doğrultusunda, örnek olarak domuz kalbi kökenli piruvat dehidrojenaz kompleksi ve alfa-ketoglutarat dehidrojenaz kompleksini kullanacağız. Her ikisi de flavin içeren enzimlerdir ve reaktif oksijen türleri için bilinen kaynaklardır.Ek olarak, bu iki enzim kolayca saflaştırılabilir. Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH'nin eş zamanlı ölçümü, çiçeklenmedeki değişikliklerin izlenmesiyle elde edilir. NADH, üretiminin kolay ölçülmesini sağlayan kendi içsel floresan özelliklerine sahiptir.Bu arada süperoksit / hidrojen peroksitteki değişiklikler süperoksit dismutataz, yaban turpu peroksidaz ve amplex ultrared reaktif gerektirir. Yaban turpu peroksidaz ve hidrojen peroksit varlığında, amplex ultrared, floresan olmayan bir molekülden floresan resorufin'e dönüştürülür. Süperoksit dismutaz, incelenen dehidrojenaz tarafından oluşturulan herhangi bir süperoksidin hidrojen peroksite dönüştürülmesini sağlar.Tahlil kurulmadan önce çalışma solüsyonları hazırlanır. Tahlili kolaylaştırmak için, tüm reaktifler 20 mikrolitrelik alikotlarda 96 oyuklu siyah bir plakanın kuyucuklarına eklenir. Kuyudaki her reaksiyonun hacmi 200 mikrolitredir, bu nedenle çalışma çözeltileri reaksiyon kuyusunda bulunan konsantrasyonun 10 katıdır.Ardından, mikroplaka okuyucuyu, NADH otofloresan ve resorufin floresansının ikili ölçümü için kinetik bir test çalıştıracak şekilde programlayın. Bu, önce Prosedür seçilerek ve 25 santigrat dereceye ayarlanarak yapılır. Ardından, Kinetiği Başlat'ı tıklayın.Süreyi yaklaşık beş dakika çalışacak şekilde ayarlayın ve ardından 30 saniyelik bir floresan okuma aralığı seçin. Ardından, Oku'ya tıklayın ve testiniz için floresan ölçüm parametrelerini ayarlayın. Burada probun konumu, çiçeklenmedeki değişiklikleri izlemek için kullanılan dalga boyları ve okunacak kuyular yazılıma girilir.Floresan okumalar için farklı kanallar da seçilir ve biri 376 nanometre uyarma ve 450 nanometre emisyon dalga boylarına ayarlanmış NADH'nin otofloresansına ayrılmıştır. Resorufin çiçeklenmesindeki değişiklikler 565 nanometre ve 600 nanometrede izlenir. Tahlil koşulları oluşturulduktan sonra, ayrı kuyulara aynı anda hem NADH hem de süperoksit/hidrojen peroksit üretimini ölçmek için gereken tampon ve farklı reaktifler yüklenir.Kuyuların farklı reaktiflerle yüklenme sırası aşağıdaki gibidir. İlk olarak, kuyuya gerekli miktarda tampon eklenir, ardından 20 mikrolitre saflaştırılmış enzim çözeltisi eklenir. Enzim, cihazın içinde birkaç dakika boyunca tampon içinde dengelenir.Ardından, kalan reaktifler aşağıdaki sırayla eklenir. Alt tabaka eklendikten sonra Başlat'a basın. Plaka taşıyıcı okuyucuya girecek ve protokol başlatılacaktır.Tahlil sırasında, ham bağıl floresan üniteleri veya RFU'lar için gerçek zamanlı çıktılar yazılım kullanılarak izlenebilir. Kullanıcı, kuyu düzeninin üzerindeki Veri sekmesini kullanarak farklı floresan okumalar arasında geçiş yapabilir. Farklı floresan okumaları için eğrilerin seçilebileceğini unutmayın.Ek olarak, klavyede Control'ü basılı tutarak ve kuyucuklara sol tıklayarak, farklı reaksiyonların gerçek zamanlı karşılaştırmalarına izin veren bir bileşik grafik elde edilebilir. Deneyin tamamlanmasının ardından, mikroplaka taşıyıcı cihazdan çıkacaktır. Bu noktada, RFU'daki değişiklikler için temsili grafikteki sonuçlar Excel'e aktarılır.Ham RFU değerleri, önce temsili RFU grafiğindeki Veriler'e tıklanarak dışa aktarılır. Bu, NADH ve resorufin floresansı için ham RFU değerlerinin bir tablosunu verecektir. NADH veya resorufin çiçeklenmesindeki değişikliklere karşılık gelen ham RFU numaraları aynı anda dışa aktarılamaz.Dışa aktarıldıktan sonra, sonuçlar analiz için düzenlenir. Test yapılmadan önce oluşturulan NADH ve resorufin floresanı için standart eğriler kullanılarak, zamanla oluşan mikromol içindeki NADH ve pikomoldeki süperoksit/hidrojen peroksit miktarı hesaplanabilir. Bunu, NADH ve süperoksit/hidrojen peroksit üretim hızının hesaplanması takip edebilir.Bu prosedür için, tahliller yapmadan önce izole edilmiş flavin içeren dehidrojenazınızın saflığını kontrol etmeniz çok önemlidir. Bu, proteinler için basit bir coomassie boyası yapılarak veya farklı substratların varlığında enzimin aktivitesini test ederek elde edilebilir. DTT gibi indirgeyici ajanların, flavin bağlı dehidrojenazlar tarafından süperoksit/hidrojen peroksit üretimi için bir substrat görevi görebileceğinden, testten çıkarılması tavsiye edilir.Genel olarak, bu yöntem, süperoksit/hidrojen peroksit üretimi için inhibitörleri taramak için kullanılabilmesi ve ayrıca farklı flavin bağlantılı mitokondriyal dehidrojenazların ROS oluşturma kapasitesinin doğrudan karşılaştırılmasına izin vermesi bakımından oldukça esnektir. Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış dehidrojenazlar tarafından ROS ve NADH üretiminin nasıl ölçüleceği konusunda samimi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu tahlil, izole mitokondri ile daha karmaşık deneyler için bir basamak taşı görevi görebilir.

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı...

Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme In Vivo

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Bu çalışma, respirometrik ve enzimatik testler yoluyla mitokondriyal fonksiyon üzerindeki ksenobiyotik etkileri incelemek için bir metodoloji sunmaktadır. Çeşitli türlerde elektron taşıma zinciri modülasyonunu inceleyerek, böcek vektörü kaynaklı hastalıklara karşı hedeflenen biyopestisit gelişimi için içgörüler sunar.

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

Öğrenin, mikroplaka florometrisi kullanarak flavin içeren mitokondriyal dehidrojenazlardan süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretimini eş zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, istenmeyen yan reaksiyonları ortadan kaldırarak bireysel üretim bölgelerinin ROS oluşturma potansiyelini doğrudan değerlendirir.

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

Daha fazla video keşfet