Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Bu prosedürün genel amacı, genomik manipülasyonu kolaylaştırmak için nasonia vitripennis embriyolarına başarılı bir mikroenjeksiyon yapmaktır. Bu yöntem, zehir üretimi ve cinsiyet belirleme gibi nasonia vitripennis biyolojisi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniği kullanmanın temel avantajı, yaban arısı genomuna doğrudan manipülasyona izin vermesi ve çok çeşitli gelişmiş genomik modifikasyonlar sunmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir doktora sonrası olan Ming Li olacak. Başlamak için, 200 ila 500 yetişkini, dişilerin erkeklere üç oranında böcek yatakhanelerine yerleştirerek birkaç N.vitripennis kolonisi kurun. Yaban arılarını %30 bağıl nem ve 12 ila 12 aydınlık/karanlık döngüsü ile 25 artı veya eksi bir santigrat derecede tutun.

İki gün boyunca, çiftleşmiş dişilerin taze S.bullata pupalarının yanı sıra bir ila on hacim arası sükroz suyu çözeltisine sahip küçük damlacıklar ile beslenmesine izin verin. Takip eden iki gün boyunca, dişi yaban arılarını bir yumurtlama bölgesinden mahrum bırakmak için sinek pupalarını çıkarın ve onları çok ağır hale getirin. S.bullota pupae konukçularını taze tutmak için, onları aldıktan hemen sonra 4 santigrat derecede saklayın ve sadece gerektiğinde çıkarın.

Kırmızı renkli bir puparium'a sahip genç konakçılar ile daha koyu renkli bir puparium'a sahip yaşlı konakçılar arasında ayrım yapın. Dişi yaban arılarının, tek tek taze S.bullata pupalarını, ortasına pupa büyüklüğünde bir delik açılmış bir köpük tıpa içine yerleştirerek genç konakçıya parazitlenmesine izin verin. Maksimum parazitizasyon konsantrasyonu ve daha kolay embriyo toplama için, daha kalın olan ve krater benzeri bir açıklık içeren arka uca kıyasla, konağın yuvarlatılmış ön ucunun sadece yaklaşık 0.2 santimetresini açığa çıkarın.

Bu düzenlemedeki konakçı pupaları kafese yerleştirin ve yaban arılarının onları parazitleştirmesine izin vermek için yaklaşık 45 dakika bekleyin. Parazitli konakçıları elle alarak ve kalan yaban arılarına hafifçe vurarak veya üfleyerek çıkarın. Enjeksiyonlar sırasında erken evrelenmiş yumurtaları toplamaya devam etmek için bunları yaklaşık her 15 dakikada bir taze konakçılarla değiştirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, N. vitripennis yumurtalarını ortaya çıkarmak için taze parazitlenmiş bir konağın dış puparyumunun arka ucunu dikkatlice soymak için forseps kullanın. Ardından, temiz bir cam lam üzerine bir kapak fişi yapıştırmak için sıvı yapıştırıcı kullanarak bir embriyo hizalama lamı hazırlayın. Islak, ince uçlu bir boya fırçasıyla, konakçının yumuşak, pupa cildine zarar vermemeye dikkat ederek, konakçıdaki embriyoları dikkatlice fırçalayın.

Daha sonra ıslak boya fırçası ile yaklaşık 20 embriyoyu tek tek, kapak fişinin hemen yan tarafına bitişik olacak şekilde lam üzerine transfer edin. Embriyonun ön ucunu, embriyonun arka uçları aynı yönde olacak şekilde kapak sürgüsünün kenarına doğru yönlendirin. Bu, tüm embriyolar arasında aynı pozisyona daha yüksek hassasiyette enjekte edilmesine izin verecektir.

Enjeksiyon iğnelerini metin protokolüne göre çektikten sonra, ucu yaklaşık 10 saniye boyunca 25 santigrat derecede elmas-aşındırıcı bir plakaya hafifçe dokundurarak iğne ucunu eğimlendirin. Genom modifikasyon reaktiflerinden oluşan enjeksiyon karışımını hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Enjeksiyon iğnesini iki mikrolitre enjeksiyon karışımıyla doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın.

Daha sonra, astarlı embriyolarla birlikte cam slaytı bir bileşik mikroskop sahnesine yerleştirin. İğneyi, 25 ila 35 derecelik dikey bir açıyla embriyonun arka ucuna dikkatlice yerleştirin. Ardından, bir ila beş pikolitre enjeksiyon karışımı enjekte edin ve embyro'nun enjeksiyonla birlikte hafifçe şişmesini sağlayın.

Tıkanma meydana gelirse, iğneleri yeniden eğim vermeyi deneyin. N.vitripennis embriyolarının sitoplazması alışılmadık derecede viskoz ve yapışkandır, bu da sık iğne tıkanmasına neden olur. Bir seferde yaklaşık 20 ila 40 yumurta enjekte edin ve sonra durun.

Enjekte edilen yumurtaları ıslak bir boya fırçası ile enjekte edilen yumurtalara hafifçe dokunarak aktarın ve bir konağa yerleştirin. Ardından, taze, yeni bırakılmış bir yumurta grubu kullanarak enjekte etmeye devam edin. İdeal olarak, bu adım, bir kişi yumurtaları toplarken ve sıralarken, başka bir kişi genom modifikasyon bileşenlerini enjekte ederken ve enjekte edilen embriyoları konakçı pupalara naklederken en etkilidir.

Mikro enjeksiyondan sonra, daha önce sokulmuş bir S.bullata pupasına her seferinde bir tane olmak üzere 40'a kadar enjekte edilmiş G sıfır embriyosunu dikkatlice yerleştirmek için ıslak bir boya fırçası kullanın. Konakçı pupaları nemli filtre kağıdı ve pamuk topları ile bir petri kabına yerleştirin ve enjekte edilen embriyolar yaklaşık bir ila iki gün içinde yumurtadan çıkana kadar yaklaşık% 70 nemle 25 santigrat derecede inkübe edin. Daha da önemlisi, konakçılar soyulmuş bir puparium ile bırakılabilir ve N.vitripennis yumurtaları, kurumayı önlemek için nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırıldıkları sürece normal şekilde gelişecektir.

G zero embriyoları yumurtadan çıktıktan sonra, konakçı pupaları yeni bir petri kabına aktarın ve 25 santigrat derece ve% 70 nemde inkübe edin. Konakçı pupaları ve enjekte edilen G zero larvalarını günlük olarak izleyin. Konak pupaların kötü bir kokusu varsa, enjekte edilen larvaları yeni sağlıklı konakçı pupalara aktarın.

N.vitripennis embriyolarına etkili iğne penetrasyonu ve mikroenjeksiyon için, farklı mikropipet çekiciler, N.vitripennis embriyo mikroenjeksiyonu için etkili olan istenen hipodermik benzeri uzun uca sahip olmak için kuvars, alüminosilikat ve borosilikat dahil olmak üzere filamentli çeşitli tipte kılcal cam iğnelerle test edildi. Burada kullanılan genom modifikasyon bileşenleri, daha net aracılı genom düzenleme için karışık kılavuz RNA'lar ve cas9 proteiniydi. Bu deneyde, cinnabar genini hedef alan bir sgRNA, cas9 proteini ile birlikte değişen miktarlarda N.vitripennis'e enjekte edildi.

Bu tablo, artan sgRNA ve cas9 proteini konsantrasyonu hayatta kalma oranlarının azalmasına yol açtığından, hayatta kalma oranlarının doza bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, nemlendirilmiş ince uçlu bir boya fırçası veya embriyo toplama kullanarak dikkatli bir şekilde manipülasyon veya transfer sırasında yaban arısı embriyolarının delinmemesine veya kurutulmamasına dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmiş genom modifikasyonlarını başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yaban arısı embriyolarının nasıl verimli bir şekilde alınacağını, mikroenjekte edileceğini ve nakledileceğini iyi anlamış olmalısınız.