Görselleştirme düzleştirilmiş memeli Cortices'deki kortikal modülleri

Korteks düzleştirme ve boyama için bu prosedürün genel amacı, kortikal bölgelerdeki hücresel modülleri katman bazında görselleştirmektir. Bu yöntem, kortikal yapının beyne nasıl yayıldığı ve işlevle nasıl ilişkili olabileceği gibi sinirbilimdeki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kortikal mimariyi laminal bir tarzda karşılaştırabilmeniz ve sınıf evrimini nasıl koruduğu veya işlevinin nasıl değiştiği gibi çeşitli yönlerini karşılaştırabilmenizdir.

Tekniği göstermek için Simon Lauer ve Profesör Michelle Black'in laboratuvarından bir öğrenci ve bir teknisyen olan Undine Schneeweib olacak. Başlamak için, homojen bir şekilde sabitlenmiş ve kansız bir beyin elde etmek için hayvanı transkardiyal olarak perfüze edin. Beyni çıkardıktan sonra, 0.1 molar fosfat tamponuna batırın.

Geniş kortikal alanlara sahip bölümler isteniyorsa, daha fazla postfiksasyondan önce beyni düzleştirin. Bununla birlikte, medial entorinal korteks gibi ulaşılması daha zor alanların bölümlerini elde etmek için, düzleşmeden önce beyni 24 saat boyunca %4 PFA'da sabitleyin. Tüm diseksiyon sırasında beyni tampon ile nemli tutmaya hazırlanın.

Başlamak için, yarım küreleri bir neşter kullanarak ayırın. Beyin sonradan düzeltilmemişse, onu tutarken dikkatli olun. Daha sonra, beyni beyincik ile sabitlerken, korpus kallozumda bir diseksiyon düzlemi açmak için spatulayı nazikçe yerleştirin.

Spatulanın yuvarlak ucu korteksten uzağa bakmalıdır. Ardından, talamus ve korteksi bölmek için spatulayı manipüle edin. Daha sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak subkortikal yapıları ayırın.

Daha sonra, bir neşter veya spatulanın kenarını kullanarak subkortikal yapıları ayırın. Düzleşmeyi iyileştirmek için, lateral bölgedeki korteksin kalınlığını arttırdıkları için striatum, nucleus accumbens ve orbital frontal korteksten temiz bir kesim yapın. Daha sonra prefrontal korteksin iç bölgesinin tabanına rahatlatıcı bir kesi ekleyin.

Bu, korteksin medial kısımlarının açılmasına izin verecektir. Şimdi, bir cam slayt üzerine bir yarım küre korteksi yerleştirin. Ardından, dokunun her iki tarafına iki kil silindir yerleştirin.

Kil, düzleşmenin derecesini tanımladığı için beyin dokusundan %10 ila %20 daha ince olmalıdır. Daha sonra, bir cam tarafı kortekse teğet olarak yerleştirin ve önce yanal kısma temas edin. Ardından, kütle yanal kısım üzerinde ortalanmış şekilde camın üzerine bir ağırlık koyun.

Şimdi, düzeneğin dört santigrat derecede fosfat tamponunda üç ila beş saat oturmasına izin verin. Bu hazırlığın gerçek anahtarı, beyni mümkün olduğunca düz hale getirmektir, çünkü bu, kortikal haritayı görüntülemede en büyük etkiye sahiptir. Son olarak, gerekirse, beyni düzeltin.

Düzleştirilmiş yarım küreyi %1 PFA'ya veya perfüze edilmiş bir hayvandan alınmamışsa %2 PFA'ya aktarın. Ardından, hafif çalkalama ile 4 santigrat derecede 24 saat sabitlenmesine izin verin. İlk olarak, düzleştirilmiş yarım küreyi fosfat tamponunda 15 dakika yıkayın.

Ardından, yarım küreyi bir Vibratom üzerinde teğet olarak dilimleyin. Küçük bir hacimde siyanoakrilat ve hafifçe bastırarak dokuyu yerine sabitleyin. Dikkatli olun, çünkü çok fazla yapıştırıcı artefaktların kesilmesine neden olabilir.

Şimdi, yarım küreyi daha kalın ve daha kararlı uçtan daha ince uca doğru gerekli kalınlıkta kesin. Düşük fiksatif konsantrasyonlar kullanılmışsa, dokuyu yüksek bir genlikle yavaşça kesin. Daha sonra, kesitli dokuyu hepes tamponunda 15 dakika boyunca hafif bir çalkalama ile yıkayın.

Yıkama sırasında taze sitokrom oksidaz boyama solüsyonu hazırlayın. Ve kullanmadan hemen önce DAB bileşenini ekleyin. Şimdi, taze yapılmış boyama solüsyonundaki bölümleri oda sıcaklığında çalkalayıcı ile inkübe edin ve izlemeye devam edin.

Fiksasyon miktarına bağlı olarak, lekelenme 10 dakika içinde gözlemlenebilir veya birkaç saat sürebilir. Reaksiyon çok yavaş gidiyorsa, sıcaklığı 37 santigrat dereceye yükseltin. Reaksiyonu durdurmak için, bölümleri %4'lük bir PFA banyosuna aktarın ve hafif çalkalama ile 15 dakika inkübe etmelerine izin verin.

Ardından, bölümleri yıkama başına 10 dakika boyunca hepes tamponu ile üç kez yıkayın. Şimdi, bölümleri cam slaytlara monte edin ve kurulayın. Ve giderek daha güçlü etanol banyoları kullanarak onları kurutun.

Ardından, slaytları İzopropanol'de beş dakika, ardından Ksilen ile beş dakika yıkayın. Ksilen banyosundan hemen sonra, hızlı sertleşen, su bazlı olmayan bir montaj ortamı ekleyin. Su bazlı ortamlar lekeyi bozar.

Bir kapak fişi ekledikten sonra, slaytları görüntülenene kadar dört santigrat derecede saklayın. Çeşitli beyinlerdeki somatosensoriyel korteksin kortikal bölümleri, tarif edilen prosedürler kullanılarak işlendi. Bu karşılaştırmalı yaklaşım, kemirgenlerde ve lagomorpha'da fıçılar olarak mistacial vibrissaer'in yüksek oranda korunmuş temsili gibi korteksi şekillendiren evrimsel kuvvetlerin incelenmesine izin verir.

Medial entorinal korteksin mimarisi, farelerde, sıçanlarda ve Mısır meyve yarasalarında tıbbi entorinal korteksin teğetsel kesiti kullanılarak, kabuk yüzeyine paralel bölümler halinde gözlendi. Ek olarak, insan beyni, korteksin ve teğetsel dilimlerin nazikçe düzleştirilmesi kullanılarak işlendi. Tüm beyinler kriyoprezervasyon yapıldı ve 60 mikronda bir kriyostat üzerinde kesit alındı.

Kalbindin pozitif parameatal hücre modüllerini etiketlemek için immün boyama kullanıldı. Entorinal kortekste calbindin modülleri her türde dikkate değer bir periyodiklik gösterir ve beyin büyüklüğündeki 20.000 katlık bir varyasyon boyunca sadece 10 kat değişir. Bu videoyu izledikten sonra, analiz için teğetsel bölümlerin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, boyut, kalite veya nihai sonuçlar yerine beyni düzgün bir şekilde düzleştirmeyi hatırlamak önemlidir. PFA ve DAB gibi ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman koruyucu giysiler giymeli ve saha ışığı altında çalışmalısınız.